Name: La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: Aprende a transfectar células ganglionares de la retina en ratones posnatales mediante electroporación in vivo. Este protocolo permite el etiquetado fluorescente preciso de neuronas retinianas para estudios de desarrollo visual.

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El plásmido pCAG-gapEGFP fue un regalo del doctor S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plásmido fue un regalo del doctor Feller M. (Berkeley, CA). Agradecemos al Dr. Edward Ruthazer por sugerir el uso de una estrategia de dos plásmidos para el etiquetado de células individuales y Schohl Anne (Montreal, QC) para validar los dos plásmidos Cre / loxP estrategia en los estudios piloto y los miembros de Crair de laboratorio para soporte técnico. Con el apoyo de R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) y NIH P30 EY000785 (MC).

1. Instalación del equipo de electroporación <ol><li> Electrodos: Hemos modificado Dumont # 5 pinzas para su uso como electrodos. <ol><li> Separado y se separan las pinzas. </li><li> Soldar un cable en el extremo más ancho de cada diente. Envuelva el cable conectado y puntas con cinta aislante dejando aproximadamente 25-30 mm de la punta de los dientes expuestos. </li><li> Ponga las pinzas modificado de nuevo junto con los espaciadores plásticos adecuados (por ejemplo un botón) entre las dos puntas para proporcionar una acción de resorte. </li></ol></li><li> Equipo eléctrico: Utilizamos un estimulador eléctrico para entregar pulsos de corriente de electroporación y un monitor de osciloscopio y de audio para confirmar la forma de onda y el número de pulsos que se entregó. <ol><li> Conecte el cable de una punta de la pinza de un pedal de pie que también está conectado en serie con el estimulador. El pedal actúa como un interruptor. Cuando se pulsa se cierra el circuito para la electroporación. </li><li> Conecte el cable de la otra punta del estimulador eléctrico. </li><li> Conecte el estimulador en el osciloscopio y el monitor de audio. </li></ol></li><li> Micropipeta y el inyector de configuración: Usamos fuerte tiró pipetas de vidrio y el sistema de Nanoinject II inyector para inyectar volúmenes muy pequeños de tinte o solución de ADN directamente en la retina. <ol><li> Monte sistema de inyección en un micromanipulador de 3 ejes. </li><li> Tire de pipetas de vidrio con una vela larga y pequeña propina. </li><li> Volver llenar la pipeta tiró con aceite mineral y seguro a los inyectores (para más detalles véase el manual de instrucciones Nanoinect II). </li><li> Utilizando unas tijeras afiladas microdissecting un corte de la punta de la pipeta, la creación de una pequeña abertura (~ 3.2 m). </li><li> Llenar la pipeta con la cantidad deseada de la solución de inyección a través de la punta de la pipeta. Siempre y cuando la integridad de la punta se mantiene, se puede utilizar para múltiples inyecciones y los animales. Nota: i) Velar por la solución de inyección de suficiente carga en la punta de tal manera que el aceite mineral rellenadas no se inyecta en el ojo. ii) El Nanoinject II del sistema y el equipo específico electrónicos que se utilizan en este video no son críticos para lograr el éxito de etiquetado de la CGR. Inyecciones realizadas con otros dispositivos, como un picospritzer y electroporación con otros estimuladores común también se puede utilizar para CGR etiqueta. </li></ol></li></ol> 2. Soluciones para el etiquetado plásmido RGC <ol><li> Para el etiquetado de pequeños grupos de la CGR: Utilizamos una construcción codificación EGFP (~ 3.2 g / l) la mejora de la proteína fluorescente verde) bajo el control de un promotor CAG (β-actina de pollo con un promotor de CMV inmediata principios potenciador). EGFP está marcado con la secuencia palmitoilación de GAP-43 (el crecimiento de la proteína asociada a-43) dirigidas a la membrana celular (mut4EGFP) 12. Esta construcción se conoce como pCAG-gapEGFP. </li><li> Para el etiquetado sola célula: Utilizamos una combinación de dos construcciones. El primer vector es un promotor CAG de conducción de la recombinasa Cre (Cre-pCAG, Addgene [Cambridge, MA] plásmido 13775) 13 y el segundo vector contiene una cinta de parada floxed seguido por una membrana dirigidos EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP). pCAG-Cre (~ 0.15-ng/μL) se utiliza a una concentración de aproximadamente 1.000-10.000 veces más bajos que pCAG-LNL-gapEGFP (~ 1-2 μgμL), limitando la expresión EGFP fuerte a un pequeño número de células (en virtud de la relativamente baja concentración pCAG-Cre). </li></ol> 3. Inyección de la retina y el Protocolo de electroporación <ol><li> Después del día 0 (P0) a los cachorros P5 son anestesiados por hipotermia, mientras que los ratones de más de P5 se anestesian con una inyección intraperitoneal (0,7 ml / kg) de un cóctel de ketamina (4,28 mg / ml), la xilazina (0,82 mg / ml) , y acepromacina (0.07mg/ml) 14. </li><li> Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y puntas de los electrodos en un esterilizador de cuentas en caliente. Posteriormente, tanto fresco en solución salina estéril antes de su uso para evitar daños térmicos en los ojos. </li><li> Coloque el ratón en un ámbito de la disección y la posición del inyector. </li><li> Para los ratones más jóvenes que P14 (antes de abrir los ojos), cirugía del párpado abierto cortando a lo largo de toda la longitud de la apertura de los párpados futuro con micro primavera disección b tijeras. </li><li> Hacer que el globo ocular sobresale parcialmente ejerciendo una suave presión alrededor de los ojos con la punta de unas pinzas c. </li><li> Mantener el ojo en su lugar con cuidado pellizcar la piel alrededor del ojo. </li><li> Ajuste micromanipulador y llevar la pipeta cerca del globo ocular. </li><li> Presione el pedal, el cual está conectado al sistema de Nanoinject II, para expulsar a unas pocas gotas de solución de la inyección y por lo tanto verificar que la pipeta no esté obstruido. </li><li> Con una mano la estabilización del globo ocular, mueva el micromanipulador de tal manera que la punta de la pipeta de vidrio atraviesa el epitelio pigmentario de la retina y entra en la retina. </li><li> Inyectar desired cantidad de solución presionando el pedal de pie para el sistema de Nanoinject II. Por ejemplo, para etiquetar CGR solo hacemos una sola inyección de 2,3 4.6nL. </li><li> Retractarse de la pipeta y se coloca cuidadosamente puntas de los electrodos directamente sobre el sitio de la inyección y presione el pedal de estimulador para completar el circuito y electroporar el ojo. Por lo general usan pulsos cuadrados con la configuración de la fuerza de 25V, 50msec duración, 1 segundo de diferencia. 10 pulsos (5 pulsos de cada polaridad) se aplican a ratones pulsos mayores de P4 y 6 (3 pulsos de cada polaridad) se aplican a ratones para P0 P3. </li><li> Empuje suavemente ojo de nuevo en el zócalo y aplicar el ungüento oftálmico estéril sobre los párpados cortados. </li><li> Animales a cabo en una plataforma de temperatura controlada de calor y en la recuperación completa, incluyendo el recalentamiento adecuado y la movilidad, el retorno de los animales a su madre. </li><li> Observar a los animales cada 12 horas para detectar cualquier signo de dolor, angustia o malestar, como la pérdida de la movilidad, postura anormal o falta de preparación. Ciclos repetidos de la anestesia, las inyecciones y la electroporación no se debe realizar en el mismo animal. </li></ol> 4. Notas <ol><li> El método de la inyección se describe en este video es un "ciego" de la inyección. Es posible visualizar la cantidad y localización de la inyección cuando se trabaja con ratones albinos y soluciones de color (DII o solución de plásmido con trazas de azul más rápido). Sin embargo, con las cepas de ratones pigmentados el lugar de inyección no pueden verse directamente y por lo tanto es difícil de describir verbalmente si se ha llegado a la ubicación de retina previsto o hasta dónde se debe mover la pipeta para orientar la capa de CGR en particular. Por lo tanto, le recomendamos los nuevos usuarios a empezar primero con inyecciones de DII en ratones albinos ya que estas inyecciones pueden ser visualizados inmediatamente en la retina y el etiquetado de las proyecciones de RGC a la retina y el cerebro se puede utilizar para evaluar la calidad de la inyección. Prepare un 10% en DII N, N-dimetilformamida (100%) para inyección de actividad. Una vez que los usuarios de este procedimiento es dominado debe ser capaz de dirigirse constantemente CGR con las soluciones de ADN plásmido en claro los ratones pigmentados. </li><li> El método de la inyección se describe en este vídeo se puede utilizar para hacer focal inyecciones DII para etiquetar pequeñas poblaciones de células para estudiar retinotopy (4.6nL etiquetas de unos pocos cientos de CGR) 14 y CGR etiqueta a granel con fluoróforos (Alexa555, 488, etc) conjugado con la toxina del cólera subunidad B para el estudio del ojo específicos de la segregación, la exclusión de la etapa de la electroporación en el # 10. Un volumen máximo de inyección total de 2-3UL para los ratones mayores de P14 y un 2UL-de los ratones más jóvenes que P14 de cualquier solución es recomendable. </li><li> Pipetas pueden ser rellenados con las soluciones a inyectar seguido por el relleno con aceite mineral antes de montar la pipeta en el inyector y romper la punta. Esto es especialmente útil cuando se utilizan soluciones de alta concentración de ADN (~ 6ug/uL), que son en general muy viscoso y difícil de cargar desde la punta de la pipeta. </li><li> Si la pipeta de vidrio se tapa, limpie cuidadosamente la punta de la pipeta con un algodón empapado en agua para las soluciones de ADN y el etanol (100%) para el tinte (DII) soluciones. </li><li> Después de inyectar en el ojo, retirar la punta de la pipeta del globo ocular y pulse el pedal para inyectar de nuevo. Esto es para confirmar que la punta no se obstruyen durante el proceso de inyección. Si no hay solución se dispensa, es muy probable que la inyección no tuvo éxito. Sin embargo, esto no debe ser tomado como una señal absoluta de que la inyección no se ha realizado correctamente. El experimentador puede inyectar el ojo mismo de nuevo si los sitios de inyección múltiple y el etiquetado de un mayor número de células que se desea. </li><li> Para el etiquetado de CGR solo establece la velocidad de inyección para reducir en la caja de control Nanoinject. Esto reduce aún más la cantidad de solución se inyecta en la retina como el sistema tarda más tiempo en esta opción para prescindir de la solución y al mismo tiempo la punta de las pipetas de vidrio se retractó rápidamente del globo ocular. </li><li> Electroporación de días después del parto 0 a 3 (P0 a P3) los ratones requiere un cuidado adicional, ya que es muy fácil dañar el ojo (esto se hace evidente a los pocos días de recuperación, cuando el ojo se puede demostrar más pequeñas de lo normal). Reducir el número de pulsos y la tensión aplicada es aconsejable para principios de ratones recién nacidos. Después de P4, los globos oculares son más resistentes a los daños de la electroporación. </li><li> En nuestra experiencia de versiones específicas de la membrana EGFP o RFP ("gapEGFP, véase 12) son muy superiores a las buenas prácticas agrarias sin modificaciones para el examen de las proyecciones retinofugal al cerebro. Sin embargo, pCAG-tdTomato, que carece de una membrana objetivo modificación, también funciona bien (Figura 1). Además, el dextrano conjugado fluorescente colorantes también se puede utilizar para CGR etiqueta utilizando el protocolo de electroporación descrito anteriormente. </li><li> Por lo general, 9 de cada 10 inyecciones llevará a CGR etiqueta, aunque sólo el 15% de las inyecciones con el enfoque de doble plásmido sellegar en cuestión de RGC solo se está etiquetando. El número de casos de éxito se puede aumentar mediante la inyección de ADN en múltiples lugares en un ojo o mediante la inyección de plásmidos que codifican distintas proteínas fluorescentes en cada ojo. </li></ol> 5. Resultados representante RGC etiquetado se observó en todas las edades, que van desde P2 a P25, con el etiquetado de EGFP en CGR por 24 horas después de la electroporación y mantenido la expresión de al menos tres semanas después de la transfección. Dendritas marcados con fluorescencia (Figura 1 A, B) y pérgolas axonal (Figura 1 F) de la CGR solo se puede visualizar claramente y reconstruido. Aparte de la CGR, esta técnica puede ser utilizada para etiquetar otros tipos de células de la retina, como las células horizontales, células bipolares y diversos subtipos de células amacrinas (fig. 1C) Este método no interfiere con el transcurso del tiempo normal de refinamiento mapa visual, como lo demuestra retinotopy normal en el SC (Figura 1). En todas las edades, en un 90% de los casos, una inyección de pequeño volumen (~ 2,3 4.6nL) de pCAG-gapEGFP llevado a su expresión en una pocas CGR (Figura 1D). En aproximadamente el 15% de los ensayos con una sola inyección de la pCAG-Cre y pCAG-LNL-gapEGFP plásmidos combinación por animal, dirigido al etiquetado individual de neuronas retinianas incluyendo CGR (Figura 1 A, B, D) y otros tipos de células como amacrinas las células (fig. 1C). <img src="/files/ftp_upload/2678/2678fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 - A, B. Ejemplos de EGFP etiqueta solo las células ganglionares de la retina (cabeza de flecha apuntando al axón) en una retina plana de montaje en el post-natal el día 14 (P14) C. Ejemplo de célula amacrinas estelar en P8 D.. . Un grupo de EGFP etiqueta neuronas de la retina incluyendo CGR y las células amacrinas de la retina plana de montaje en P14. CGR E. dorsal y ventral en el ojo derecho se electroporated y etiquetados con EGFP y CGR temporal y ventral en el ojo izquierdo galvanizado y se etiquetados con tdTomato en P1. Las zonas de destino (asteriscos) formado por la CGR etiqueta se puede ver en su ubicación topográficamente correcta en el SC en P9 (todo el montaje, esquema de color blanco). F. Ejemplo de una sola etiqueta EGFP RGC cenador (2-D de proyección) en un corte sagital (250 micras de espesor) de la SC (línea punteada). Para mayor claridad, las imágenes en (D) y (F) ha sido convertida a escala de grises y se invierte. Las barras de escala (m): (A) - (D), (F): 100 (E): 500

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<li>Plas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((morphogenetic+proteins%2C+eye+patterning%2C+and+retinocollicular+map+formation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse.</a> J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).</li>
</ol>

En este video se demuestra un protocolo de electroporación in vivo que se traduce en el etiquetado de los grupos individuales o pequeños de las neuronas de la retina en ratones postnatales, con construcciones de ADN que codifican las proteínas fluorescentes. Pequeños grupos de marcado con fluorescencia proyecciones CGR a la dLGN SC y reproduce patrones similares de proyección ya que estudios previos con el etiquetado de CGR con colorantes lipofílicos, lo que indica que la electroporación no interferir ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Materiales </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinzas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Estimulador eléctrico </td><td> Grass Instruments </td><td> Modelo S4 </td></tr><tr><td> Osciloscopio </td><td> Agilent </td><td> Modelo 54621A </td></tr><tr><td> Monitor de audio </td><td> Grass Instruments </td><td> Modelo AM8B </td></tr><tr><td> Extractor </td><td> Sutter Instrumentos </td><td> Modelo P-97 </td></tr><tr><td> Vannas Tijeras una </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 14003 </td></tr><tr><td> Micro Tijeras b </td><td> Ted Pella </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> Dumont AA Pinzas c </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11210-20 </td></tr><tr><td> Nanoinject II del Sistema </td><td> Drummond Científico </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Pipetas de vidrio </td><td> Drummond Científico </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Pedal </td><td> Drummond Científico </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> Aceite mineral </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> DII </td><td> Invitrogen </td><td> D-383 </td></tr><tr><td> N, N-dimetilformamida </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

la transfección de células de ratón del ganglio de la retina por in vivo la electroporación

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

La selección y el refinamiento de las proyecciones de RGC para el cerebro medio es un sistema modelo popular y de gran alcance para el estudio de cómo los patrones precisos de la forma de conectividad neuronal durante el desarrollo. En los ratones, las proyecciones retinofugal están dispuestos de una manera topográfica y la forma del ojo específicos de las capas del núcleo geniculado lateral (dLGN) del tálamo y el colículo superior (SC). El desarrollo de estos patrones precisos de proyecciones retinofugal típicamente ha sido estudiado por el etiquetado las poblaciones de la CGR con tintes fluorescentes y marcadores, como la peroxidasa de rábano picante 1-4. Sin embargo, estos métodos son demasiado gruesas para dar una idea de los cambios de desarrollo en cada morfología axonal RGC cenador que son la base de la formación del mapa retinotópica. Asimismo, no permitir la manipulación genética de la CGR. Recientemente, la electroporación se ha convertido en un método eficaz para proporcionar un control preciso espacial y temporal para la entrega de las moléculas cargadas en la retina 05.11. Los protocolos actuales de electroporación retina no permiten la manipulación genética y la localización de las proyecciones de retinofugal de un solo grupo o pequeño de la CGR en ratones postnatales. Se ha argumentado que después del parto en la electroporación in vivo no es un método viable para la transfección CGR desde el etiquetado de eficiencia es muy baja y por lo tanto requiere dirigidos a edades embrionarias cuando los progenitores RGC están experimentando la diferenciación y la proliferación de 6. En este video se describe un protocolo de electroporación in vivo para la entrega selectiva de genes, shRNA, y dextranos fluorescentes para CGR murino después del nacimiento. Esta técnica proporciona una solución eficaz, rápida y relativamente fácil de plataforma para la detección eficaz de los genes candidatos involucrados en varios aspectos del desarrollo neural como la retracción del axón, la ramificación, la laminación, la regeneración y la formación de sinapsis en las distintas etapas del desarrollo del circuito. En resumen, como se describe aquí una valiosa herramienta que ofrecerá nuevas perspectivas sobre los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo del mapa sensorial.

Se demuestra una<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporación protocolo para la transfección de grupos individuales o pequeños grupos de células ganglionares de la retina (CGR) y otros tipos de células de la retina en ratones postnatales en un amplio rango de edades. La capacidad de etiquetar y manipular genéticamente CGR postnatal<em&gt; In vivo</em&gt; Es una poderosa herramienta para los estudios de desarrollo.

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

El direccionamiento y el refinamiento de las proyecciones de las CGR hacia el mesencéfalo constituyen un sistema modelo popular y potente para estudiar cómo se forman los patrones precisos de conexiones neuronales...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en transfectar una sola célula o pequeños grupos de células ganglionares de la retina mediante electroporación in vivo en ratones posnatales para estudiar el desarrollo de las proyecciones retinogénicas. Esto se logra mediante la exposición quirúrgica del globo ocular e inyectando un pequeño volumen de solución de ADN plasmídico directamente en la retina. Como segundo paso, se colocan electrodos sobre el globo ocular directamente encima del sitio de inyección, y se aplican pulsos eléctricos, lo que permite la transferencia del ADN plasmídico a las neuronas retinianas.A continuación, a la edad deseada, se extraen retinas y cerebros electroporados para visualizar las células ganglionares de la retina transfectadas y sus proyecciones al SNC; los resultados obtenidos muestran la marcación fluorescente tanto de dendritas como de ARBs axonales de las células ganglionares de la retina marcadas en sus diversas estructuras diana subcorticales. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la electroporación retiniana in utero, es que esta técnica es menos invasiva y no interfiere con los eventos tempranos de guía axonal, como el cruce en el quiasma óptico. También nos permite marcar una pequeña población o células ganglionares de la retina individuales en ratones posnatales con un control espacial y temporal preciso.Para fabricar electrodos para la electroporación, rompa una punta de un par de pinzas Dumont número cinco y luego suelde un cable en la base de cada punta. Envuelva la base de los cables con cinta aislante y coloque un separador de plástico entre las puntas para proporcionar acción de resorte. Una vez ensamblados los electrodos, conecte el cable de una punta al pedal, que está conectado en serie al estimulador eléctrico.Cuando se presiona el pedal, la corriente fluye a través de los electrodos. A continuación, conecte el cable del otro pin al estimulador eléctrico. Y finalmente, conecte el estimulador eléctrico al osciloscopio y al monitor de audio.Monte el sistema inyector en un micromanipulador de tres ejes sobre la mesa de trabajo utilizando un tirador de pipetas. Prepare pipetas de vidrio estiradas con una punta larga y fina usando una aguja proporcionada con el Nano Inject dos. Llene por detrás una pipeta estirada con aceite mineral y fíjela al microinyector.Utilizando tijeras de microdisección afiladas, corte la punta de la pipeta montada para crear una abertura de dos a tres micrómetros. Llene la pipeta con la solución de inyección aspirándola a través de la punta abierta.Anestesiar crías de ratón en el día posnatal cuatro a cinco mediante hipotermia. Y confirmar el estado anestésico mediante un pellizco en el dedo del pie. Colocar el ratón anestesiado bajo un microscopio de disección y abrir quirúrgicamente el párpado cortando a lo largo de la longitud de la futura abertura del párpado con tijeras de microdisección, luego hacer protruir el globo ocular aplicando suavemente presión alrededor de la órbita ocular con un par de pinzas.Coloque la pipeta cerca del globo ocular ajustando el micromanipulador. Presione el pedal con el pie del sistema de microinyección con una mano para asegurarse de que la punta de la pipeta no esté obstruida. Estabilice el globo ocular protruido pellizcando la piel alrededor de la órbita con pinzas utilizando la otra mano.Mueva el micromanipulador de forma que la pipeta atraviese el epitelio pigmentario de la retina e ingrese en la retina. Administre la cantidad deseada de solución presionando el pedal del pie, retire la pipeta y coloque las puntas de los electrodos directamente sobre el sitio de inyección. A ambos lados del globo ocular, justo tocando la superficie, presione el pedal del pie conectado al estimulador para cerrar el circuito y electroestimular el globo ocular.Empuje suavemente el globo ocular hacia dentro de su cavidad y aplique una pomada oftálmica sobre el corte. Coloque a los ratones sobre una almohadilla calefactora mantenida a 36 grados Celsius hasta que recuperen la conciencia y devuélvalos únicamente a sus madres si han sido transfectados con RG CS. Aquellos que contengan tanto el plásmido como la secuencia codificante para la recombinasa Cre y el EGFP con stop de flock serán capaces de expresar.La marcación de una sola célula con EGFP se logra gracias a la concentración relativamente baja del plásmido Cre utilizado; mediante esta técnica, se pueden visualizar una célula ganglionar retiniana marcada con EGFP, así como sus dendritas y axones, en una retina montada en plano. Otros tipos celulares retinianos, como las células omicrón en forma de estrella, también pueden marcarse con este método. Aquí observamos un ejemplo de un grupo de neuronas retinianas marcadas con EGFP, incluyendo células ganglionares retinianas y células omicrón, en una retina montada en plano en el día 14 posnatal.Mediante esta técnica, podemos analizar la distribución retiniana específica de las RG CS en una preparación completa del colículo superior, proveniente de las cuatro coordenadas retinianas principales en el mismo ratón, una vez dominada. Esta técnica puede realizarse en cuatro a cinco minutos si se lleva a cabo correctamente. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar inyecciones focales de soluciones, como ADN plasmídico, en la retina posnatal y de la transfección in vivo de neuronas retinianas mediante electroporación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Aquí se presentan dos técnicas para manipular la expresión génica en las células ganglionares de la retina murina (CGR)...

La electroporación in vivo en el útero y el ex de la expresión génica en células de ratón ganglionares retinianas

Este protocolo describe un método simple y económico para cuantificar la actividad de los elementos reguladores cis (es decir, potenciador / promotores) que viven en la retina del ratón a través de electroporación explante. Preparación del análisis de ADN, la disección de la retina, la electroporación, la cultura de explantes de retina, y después de la fijación y cuantificación se describen.

La cuantificación de la actividad de Cis Elementos reguladores en la retina del ratón por electroporación explante

Un método para la incorporación de ADN plásmido en murino células de la retina con el propósito de llevar a cabo ya sea ganancia o pérdida de los estudios de...

En electroporación in vivo de la retina del ratón en desarrollo

Este artículo describe la grabación de las células individuales de marcado con fluorescencia poblaciones neuronales en la retina del ratón intacto. Mediante el uso de excitación de dos fotones infrarrojos células transgenetically etiquetado fueron objeto de grabación de patch-clamp para estudiar la luz de sus respuestas, las propiedades de campo receptivo, y la morfología.

Caracterización electrofisiológica de las buenas prácticas agrarias que expresan las poblaciones de células en la retina intacta

Un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína de destino en la retina del pez cebra adulto se describe, lo que implica la inyección intravítrea morfolinos antisentido y electroporating ellos en la retina. La proteína resultante es derribado por varios días, lo que permite realizar pruebas de función de la proteína en la regeneración o la retina intacta.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

El objetivo general de este video es mostrar cómo llevar a cabo la inyección específica de retina...

En electroporación in ovo en la retina de embriones de pollo

Fuente: Denaxa, M., el al., Trasplante de progenitores interneuronales corticales modificados quimiogenéticamente en cerebros de ratón posnatales tempranos. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el procedimiento para inyectar un vector plásmido que lleva el gen de interés en progenitores interneuronales en un corte de cerebro embrionario, seguido de electroporación para la entrada de plásmidos y la expresión génica. Estos progenitores modificados se pueden usar más tarde para tratar...

Transferencia de genes asistida por electroporación integrada en agarosa en progenitores de interneuronas corticales de ratón

Este procedimiento muestra cómo dirigirse a las interneuronas en el prosencéfalo del ratón en desarrollo mediante electroporación en el útero. Esta técnica fue particularmente eficiente para lograr la expresión génica selectiva en subtipos de interneuronas destinadas a las capas superficiales de la corteza.

-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

Cultivos de células de la retina de embriones de pollo constituyen herramientas valiosas para el estudio de la biología de los fotorreceptores. Hemos desarrollado una técnica de transferencia de genes eficiente, basado en ex ovo plásmido electroporación de las retinas antes del cultivo. Esta técnica aumenta considerablemente la eficiencia de transfección a través de protocolos disponibles en la actualidad, lo que hace posible la manipulación genética para este sistema.

Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un Ex-ovo Enfoque electroporación

Este protocolo describe un método para diseccionar, experimentalmente manipular y explantes de cultivo completo de la retina a partir de embriones de pollo. Los cultivos de explantes son útiles cuando alta tasa de éxito, la eficacia y reproducibilidad son necesarios para probar los efectos de plásmidos para la electroporación y / o sustancias de reactivos, es decir, inhibidores enzimáticos.

Los explantes de retina enteras de pollo embriones para Tratamientos electroporación y Reactivos Químicos

Las inyecciones subretinianas son una técnica indispensable para el desarrollo preclínico de terapias para enfermedades de fotorreceptores y EPR. Describimos una técnica de inyección subretiniana transescleral optimizada en ratones que mejora las tasas de éxito intraoperatorio y minimiza el daño retiniano.

Técnica de inyección subretiniana transescleral mínimamente invasiva optimizada en ratón

Aprende a transfectar células ganglionares de la retina en ratones posnatales mediante electroporación in vivo. Este protocolo permite el etiquetado fluorescente preciso de neuronas retinianas para estudios de desarrollo visual.

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

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