La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

El objetivo general del siguiente experimento es transfectar grupos individuales o pequeños de células ganglionares de la retina utilizando electroporación in vivo en ratones postnatales para estudiar el desarrollo de las proyecciones ugales de la retina. Esto se logra exponiendo quirúrgicamente el globo ocular e inyectando un pequeño volumen de solución de ADN plasmático directamente en la retina. Como segundo paso, se colocan electrodos en el globo ocular directamente sobre el lugar de la inyección y se aplican pulsos eléctricos, lo que permite la transferencia de ADN plasmático a las neuronas de la retina.

A continuación, a la edad deseada, se extraen retinas y cerebros electroporados para visualizar las células ganglionares de la retina transfectadas y se obtienen sus proyecciones al SNC, que muestran el marcaje fluorescente de las dendritas y los ARB axonales de las células ganglionares de la retina marcadas en sus diversas estructuras diana subcorticales. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la electroporación de retina en el útero, es que esta técnica es menos invasiva y no interfiere con los eventos tempranos de guía de los axones, como el cruce en el quiasma óptico. También nos permite etiquetar una pequeña población o células ganglionares individuales de la retina en ratones postnatales con un control espacial y temporal preciso.

Para hacer electrodos para electroporación, rompa una punta de un par de pinzas dumont número cinco y luego suelde un cable en la base de cada punta. Envuelva la base en alambres con aislamiento, cinta adhesiva y coloque un espaciador de plástico entre las puntas para proporcionar acción de resorte. Una vez que los electrodos estén juntos, conecte el cable de una clavija al pedal, que está conectado en serie al estimulador eléctrico.

Cuando se presiona el pedal, la corriente fluye a través de los electrodos. A continuación, conecte el cable de la otra clavija al estimulador eléctrico. Y finalmente, conecte el estimulador eléctrico al osciloscopio y al monitor de audio.

Monte el sistema de inyectores en un micromanipulador de tres ejes en el banco utilizando un extractor de pipetas. Fabrica pipetas de vidrio estirado con un cono largo y una punta pequeña utilizando una aguja suministrada con el nano Inject dos. Rellene una pipeta extraída con aceite mineral y asegúrela al microinyector.

Usar tijeras de microdisección afiladas. Corte la punta de la pipeta montada para crear una abertura de dos a tres micrómetros. Llene la pipeta con solución inyectable aspirándola a través de la punta abierta.

Anestesiar los estallidos de ratón a H cuatro o cinco días después del parto por hipotermia. Y confirme el estado anestésico con un pellizco en el dedo del pie. Coloque el ratón anestesiado bajo un endoscopio de disección y abra quirúrgicamente el párpado cortando a lo largo de la futura abertura del párpado con unas tijeras de microdisección, protruya el globo ocular aplicando suavemente presión alrededor de la cuenca del ojo con un par de pinzas.

Coloque la pipeta cerca del globo ocular ajustando el micromanipulador. Presione el pedal del sistema de microinyección para asegurarse de que la punta de la pipeta no se obstruya con una mano. Estabilice el globo ocular protuberante pellizcando la piel alrededor de la cuenca del ojo con pinzas con el otro.

Mueva el micromanipulador para que la pipeta atraviese el pigmento de la retina, el epitelio y entre en la retina. Dispense la cantidad deseada de solución presionando el pedal, retraiga la pipeta y coloque las puntas de los electrodos directamente sobre el lugar de inyección. A ambos lados del globo ocular justo tocando la superficie, presione el pedal conectado al estimulador para completar el circuito y electro desfile del globo ocular.

Empuje suavemente el globo ocular hacia su cuenca y coloque un ungüento oftálmico sobre la corte. Coloque los ratones en una almohadilla térmica mantenida a 36 grados centígrados hasta que recuperen la conciencia y devuélvalos a su madre solo con RG CS transfectado. Tanto con plásmido como con codificación para Cree, recombinasa y parada de lote, EGFP puede expresarse.

El marcaje de una sola célula de EGFP se logra en virtud de la concentración relativamente baja de plásmido Cree utilizado, el ganglio de una sola retina, las dendritas celulares y los axones marcados con EGFP se pueden visualizar en una retina de montaje plano. Otros tipos de células de la retina, como las células ómicron de estallido estelar, también se pueden marcar con esta técnica. Aquí vemos un ejemplo de un grupo de neuronas de la retina marcadas con EGFP, incluidas las células RG CS y ómicron en una retina de montaje plano en el día 14 postnatal.

Con esta técnica, podemos analizar la orientación del tema de la retina de RG CS en un colo superior de montura completa a partir de las cuatro coordenadas principales de la retina en el mismo ratón una vez dominado. Esta técnica se puede realizar en cuatro o cinco minutos si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer inyecciones focales de soluciones como ADN plasmático en la retina postnatal y transfección in vivo de neuronas retinianas mediante electroporación.