Name: Título encapsulación celular a través de gotitas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:09:54.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Aprende la encapsulación celular mediante impresión 3D con válvulas solenoides y geles para crear estructuras tridimensionales viables. Este método avanza la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa.

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NIH3T3 células de preparación: A. Las células de eyección <ol><li> Trypsinize las células, y luego se diluye 1:1 con los medios de comunicación celular, y la transferencia de un frasco T75 a un tubo de 15 ml Falcon </li><li> Centrifugar las células en un pellet por centrifugación, se aspira el sobrenadante y lavar las células con DPBS </li><li> Centrifugar las células en una bolita de nuevo, y aspirar el sobrenadante </li><li> Resuspender las células en los medios de comunicación </li><li> Determinar la densidad celular con hemocitómetro (~ 200 X 10 4 células / ml por frasco T75) </li><li> Solución de centrífuga de células, se aspira el sobrenadante y resuspender en cantidad adecuada de los medios de comunicación para diferentes concentraciones de células </li></ol> B. expulsión de la célula <ol><li> Vortex antes de usar las células para la eyección </li><li> Transferencia de 200 l de solución de células en la jeringa </li><li> Establecer el modo apropiado en el generador de impulsos <ol><li> Para la expulsión de gotas individuales y múltiples gotas (ráfagas), generador de pulso para &quot;E. Bur&quot; modo de </li><li> Para la eyección de gota continua, generador de pulso en &quot;NORM&quot; modo de </li></ol></li><li> Cambiar la configuración de la señal <ol><li> Establecer el nivel de alta y baja tensión Nivel de salida: LIS a 5 V y LOL a 0 V y asegúrese de que el &quot;LIM&quot; está encendido </li><li> Establecer como una señal de pulso cuadrado </li><li> Cambiar la cantidad de tiempo que la válvula solenoide se abre para la eyección de gotas, cambiando el valor de &quot;MED&quot; o cambio de ciclo de trabajo (&quot;derecho&quot;) </li><li> Cambiar la frecuencia de la expulsión, cambiando el valor de &quot;PER&quot; </li><li> Cambiar el número de gotas expulsadas en una explosión al cambiar el valor de &quot;Bur&quot; </li></ol></li><li> Solución de células de expulsión sobre el sustrato preparado para imágenes con microscopio </li></ol> C. La tinción <ol><li> Conforman solución colorante con 0,5 l calceína-AM y 2 l homodímero de etidio por ml de DPBS </li><li> Sumergir sustrato preparado en la solución colorante </li><li> Que la muestra de incubar durante 10 minutos a 37 ° C antes de exponer </li></ol> Experimento de Validación <ol><li> En una Nikon Eclipse TE-2000 microscopio fluorescente U <ol><li> Punto avanzado de software (Diagnostics, Inc.) </li><li> Live / Dead ensayo </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<table><tbody><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE-2000 U</td><td></td></tr><tr><td>Eyector de células con válvula solenoide</td><td></td><td></td><td></td><td>Frecuencia de operación: 1 KHz, 30 psi, 50 nl~0,5 µl. Controlador de válvula de 12 V: corriente de accionamiento de 2,5 A</td></tr><tr><td>Depósito de aire portátil de 5 galones</td><td></td><td>Coleman</td><td>Powermate CT5</td><td>Aire presurizado: 30 PSI</td></tr><tr><td>Reguladores de presión</td><td></td><td>Marsh Bellofram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Generador de impulsos</td><td></td><td></td><td>HP8112A</td><td>Generación de frecuencia de accionamiento: 50 MHz</td></tr><tr><td>Plataforma XYZ</td><td></td><td>Newmark Systems</td><td></td><td>Con motor paso a paso: plataforma XY de recorrido 6 pulgadas (NLS4-6-25), plataforma Z de recorrido 2,5 pulgadas (NLS4-2,5-25), controlador de 3 ejes (NSC-G3), resolución de 0,1 µm</td></tr><tr><td>NIH 3T3</td><td>Línea celular</td><td></td><td></td><td>Fibroblastos</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td></td><td></td><td></td><td>Solución al 0,05 %</td></tr><tr><td>Medio para células NIH 3T3</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Tampón</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td></td><td></td><td></td><td>Frascos de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Tubos cónicos de plástico</td><td></td><td></td><td></td><td>15 ml, para cultivo de tejidos</td></tr></tbody></table>

título encapsulación celular a través de gotitas

Title Cell Encapsulation by Droplets

Título encapsulación celular a través de gotitas

Me llamo Hang Moon. Estoy trabajando con el profesor de condones. Él y yo trabajamos con la etapa XYJ para crear una estructura tridimensional de célula.Hola, soy PE y Lynn, y estoy trabajando en el proyecto de impresión celular con encapsulación de células y medios y geles. Esto es un solenoide para la expulsión de una célula y una mezcla celular sobre el medio celular. La válvula solenoide es activada por dos líneas de señal.La línea de señal proviene de una placa seca aquí. La señal proviene de aquí. Esa línea a través de esa línea, esa es el generador de funciones primero.Primero se genera mediante nuestro método programado. Por lo tanto, si desea cambiar el flujo, puede modificar el programa con la línea de conmutación o puede controlar ese generador de procesos desde la computadora. La válvula celular se abre y cierra mediante una señal eléctrica, pero la célula recibe suministro a través de esa línea.La célula y el medio o el gel de agro se suministran a través de las jeringas. Las jeringas dentro del agua, dentro de la jeringa, están presionadas ligeramente por el aire. El aire presurizado se suministra desde un tanque como aquí la línea.Entonces, la pequeña línea y el aire ionizado pasan a través del filtro de aire. El filtro de aire discrimina el polvo y otros tipos de suciedad. Ese generador de presión, como lo llamamos, genera la señal utilizada para abrir o cerrar la válvula de aire solar. La computadora está conectada a través del conector P-I-B-U-S-V.Entonces, podemos usar el puerto USB conectándolo directamente a nuestra computadora, la computadora portátil. Ese se conecta a este lado aquí. Y luego podemos controlar mediante la computadora de control aquí.Por lo tanto, si deseamos sincronizar el movimiento de la plataforma y la apertura de la campana, esto puede controlarse mediante el mismo controlador, como una computadora portátil. Así podemos controlar el momento en que se abre, en que se cierra, en que se mueve y en que se detiene. Y podemos sincronizar el movimiento con la apertura de la campana.Esa etapa es la platina motorizada. Se mueve automáticamente mediante la línea de señal de muerte y el motor. Por lo tanto, la motorización es de 0,1 micrómetros.Por lo tanto, idealmente puede trazar la línea hasta la marca de 100 milímetros. De este modo, el eje del chorro se mueve, subiendo y bajando de esa manera. Así controla la separación entre el sustrato y la correa solar.Por lo tanto, puede controlar la altura de eyección. Ese sustrato está conectado a las etapas XY aquí, X aquí e Y allí. De modo que se mueve alrededor de un plano XY.Por lo tanto, dibuja una demostración de ciertas características en etapas específicas: tres X, X, Y y G. Así, el eje del chorro (eje X) o el eje XY se controla mediante una señal aquí. La línea de señal está conectada al controlador de movimiento aquí. Dicho controlador de movimiento no tiene ningún interruptor manual en absoluto, ya que no puede controlarse manualmente.Está controlado mediante la computadora portátil. Por lo tanto, la computadora portátil está conectada. En la parte posterior del controlador, tenemos tres ejes para una impresión celular XY jet.Por lo tanto, genera tres tipos diferentes de señal de forma independiente. Luego, el controlador de movimiento se comunica a través de los conectores RF 2, 3, 2 que están conectados directamente al USV. A continuación, el USV está conectado a una computadora portátil.Entonces, el prestatario controlado por portátil. Utilizamos el programa AutoCAD, creamos una trayectoria gen A de esta manera, bam. Y luego se convierte al lenguaje de la máquina así.Entonces, el lenguaje de la máquina se transfiere de manera que los caracteres y números simples queden así. Cada posición está relacionada con las etapas X, Y, Z. Aquí selecciono el archivo que contiene ese tipo de programa y luego abro el programa de descarga de esa manera. A continuación, elijo desde el archivo exactamente lo mismo, el archivo de texto.Solo se descarga el archivo de texto; seleccione el archivo de texto y descárguelo automáticamente desde la computadora portátil al controlador de movimiento com, y luego pasará al carácter BAM, como mencioné anteriormente, BAM. En este matraz hay células de fibroblastos murinos NIH 3T3. Y primero voy a aspirar el medio antiguo.Este proceso sirve para realizar el pase de las células, las cuales están adheridas al fondo del frasco. Por lo tanto, después de aspirar el medio, voy a añadir seis RYS, que es una enzima. ¿De acuerdo? Una vez que se haya agregado la tripsina al frasco, debemos esperar de tres a cinco minutos para que las células se desprendan del fondo del frasco.Ahora estamos listos para agregar el medio y pasar las células a un tubo de centrífuga. Es una dilución uno a uno. Así que estoy agregando seis mililitros de este medio aquí y voy a lavar un poco los cultivos para asegurarme de que todas las células sean transferidas.Y ahora las células están listas para ser centrifugadas en este tubo. Ahora vamos a centrifugar estas células a mil RPM durante tres a cinco minutos. Ahora que las células han sido sedimentadas en un pellet, voy a aspirar el sobrenadante.Ahora voy a lavar las células con PBS. Esto es para teñir las células. Los colorantes que estamos utilizando son sustratos de esterasa.Vale, ahora vamos a centrifugar de nuevo y sedimentar las células en un botón. Voy a aspirar el PBS y voy a resuspender las células en medio para contarlas.Estoy mezclando las células para que, cuando tomemos una muestra, la concentración sea uniforme en todo el tubo. Ahora voy a tomar cien microlitros de las células para medir la densidad celular. Ahora estoy agregando cien microlitros de tinta de China, que es un colorante.Vamos a esperar de tres a cinco minutos para que el colorante penetre las membranas de las células muertas. Al contar las células, no contamos las células azules. Las células están listas para ser contadas con el hemocitómetro; voy a transferir 50 microlitros de la mezcla celular a cada lado del hemocitómetro.Vale, voy a cubrirlo con el lado del portaobjetos. El hemocitómetro tiene dos lados. Voy a contar primero un lado y, tras contar ambos lados, calcularé el promedio y luego multiplicaré por dos, porque tuvimos una dilución uno a uno con el tipo en azul.Entonces, básicamente, nuestra densidad celular será de 135 por 10 elevado a cuatro células por mililitro. Para nuestro experimento, utilizaremos una solución celular con una concentración de medio millón de células por mililitro. Y dado que tenemos 13,5 millones de células, suspenderé las células en 27 mililitros de medio.Estamos utilizando dos tipos diferentes de colorantes. Este es un ensayo de viabilidad de Molecular Probes. Nuestro primer colorante se llama calcium am.Nuestra segunda tinción se llama homodímero AUM. Tiñe las células muertas. Utilizamos excitación azul para obtener fluorescencia verde y excitación verde para obtener fluorescencia roja. Para estas dos tinciones, cuando estemos realizando la imagen, nuestra solución de tinción se preparará en PBS.Primero, voy a transferir cinco mililitros de PBS a un tubo de solución salina tamponada con fosfato. Esa es una solución salina. Ahora voy a añadir medio microlitro de calcio am por mililitro.Ahora estoy añadiendo 2,5 microlitros de calcio am al tubo y dos microlitros del homodímero athe por mililitro de PBS. Aquí está la máquina btex. Hace que la célula y el medio se distribuyan uniformemente a través de todo el volumen.Ahora cargamos la célula de 200 microlitros en el siete aquí. Luego colocamos la tapa; esto queda herméticamente sellado de esta manera. Aquí abro la válvula y entonces entra aire ligero a presión, y luego ajusto la correa así. Y entonces cambia la presión.Así que ajusto. La presión es de cinco PSI. La presión en el interior del tubo es de cinco PSI.De aquí a aquí, se conectó a través de esto dentro del agujero. Así que simplemente abrimos la campana aquí y luego la célula se inyectó con una presión de cinco PSI y luego comenzó a abrirse. Y luego la válvula Sona comenzó a operar.Luego enrollamos el sustrato. El sustrato es simplemente un portaobjetos de vidrio. A continuación, cargamos la porción adecuada y coloco cinta adhesiva para fijar el sustrato de esta manera, ¿correcto?Y simplemente lo fijo. Así que configuramos completamente la célula, la válvula aril y el sustrato durante el movimiento del trabajo aril, comenzando a operar. Entonces montamos todo el sistema y luego abrimos la válvula aril para iniciar.Luego movemos la etapa así, ¿verdad? Y entonces creamos un patrón sobre el sustrato, un patrón sobre el sustrato, y ¡listo, personaje! Voy a sumergir estas gotas que imprimimos en esta solución de colorante que preparamos anteriormente.Ahora se incubarán las gotas durante 10 minutos y luego se observarán. Primero voy a ajustar la imagen a través del ocular. Nuestra primera imagen es solo una imagen de campo brillante.Voy a apagar la luz y a cambiar el filtro para tener una excitación azul, lo que mostrará una fluorescencia verde. Y la tercera imagen que tomaremos corresponde a las células muertas, que es la tinción con Thm Homodimer. Y con luz verde, obtendremos una fluorescencia roja.

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se presentan los protocolos de 3 dimensiones (3D) en la encapsulación de células dentro de los hidrogeles sintéticos. El procedimiento de encapsulación, se destaca por dos métodos utilizados para el entrecruzamiento (michael-tipo y además iniciada por la luz los mecanismos de los radicales libres), así como una serie de técnicas para evaluar el comportamiento de células encapsuladas.

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La combinación de generación monodispersas gota con ordenamiento inercial de células y partículas, se describe un método para encapsular un número deseado de células o partículas en una sola gota a tasas kHz. Se demuestra la eficiencia de dos veces superiores a las de la encapsulación no ordenada de las gotas de una y dos partículas.

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