De alto rendimiento de una sola célula y múltiple las células de micro-encapsulación

Las aplicaciones que utilizan células encapsuladas en pequeñas gotas del tamaño de picolitros a menudo han estado limitadas por la incapacidad de controlar el número de células por gota. Este protocolo demuestra un método para controlar el encapsulamiento celular combinando dos fenómenos microfluídicos distintos: el ordenamiento celular por dinámica de fluidos y la generación de gotas en una microboquilla de enfoque de flujo. En un canal aguas arriba, se proporciona una velocidad de flujo suficientemente alta de una solución acuosa con células o partículas en suspensión para provocar la formación de trenes con espaciado igual en la dirección del flujo aguas abajo.

Se utiliza una boquilla de generación de gotas por enfoque de flujo para formar gotas acuosas a tasas de kilohercios en un fluido portador oleoso admisible estabilizado con tensioactivo. Luego, los trenes ordenados de partículas celulares se combinan con la generación de gotas ajustando los caudales acuoso y oleoso para obtener tasas de generación de gotas que estén sincronizadas con la llegada de células o partículas ordenadas longitudinalmente a la boquilla de generación de gotas, mientras se emplean partículas como sustitutos celulares. Para demostrar este protocolo, los caudales deben ser suficientemente pequeños como para limitar el fluido.

Los esfuerzos cortantes sobre las células biológicas, la superposición del ordenamiento celular, la generación de gotas y la viabilidad celular. Las restricciones en la velocidad de flujo acuoso proporcionan un régimen operativo ideal para la encapsulación controlada de una o múltiples células. El análisis de los datos de microscopía de video muestra que las eficiencias de encapsulación tanto de una como de dos células o partículas superan a las eficiencias de encapsulación aleatoria y reducen considerablemente el número de gotas que no contienen el número deseado de células o partículas.

El confinamiento de células y gotas limita la dilución de las secreciones celulares, resalta la heterogeneidad celular y también controla las señales intercelulares en comparación con una suspensión masiva. Contar con métodos eficientes para encapsular estas células en gotas proporciona una herramienta valiosa para los investigadores biológicos al iniciar este procedimiento. Diseñe un patrón de microcanal como se muestra en esta figura utilizando el software AutoCAD.

La sección del canal largo representa el canal de ordenamiento de flujo acuoso con un ancho de 27 micrones. El esquema del orificio ampliado muestra anchos de canal iguales de 27 micrones para el canal acuoso de ordenamiento y el canal de aceite, seguido por la contracción del orificio de 22 micrones y una expansión repentina hacia un canal más ancho de 61 micrones. La altura del dispositivo es de 52 micrones.

Tanto las entradas de agua como de aceite tienen filtros grandes para residuos con separaciones del orden del ancho del canal de ordenamiento, como se ilustra en este esquema ampliado de la entrada de aceite. Se muestra aquí una imagen real del canal de ordenamiento y la boquilla inyectada con colorante. Emplee un fabricante externo para imprimir una máscara de transparencia de alta resolución sobre una película de Mylar o cuarzo, donde los canales sean transparentes sobre un fondo oscuro.

Posteriormente, cree un molde maestro de silicio y fotoresina SU-8 para el moldeo por réplica. Fije con cinta el molde maestro en la parte inferior de una placa de Petri para el moldeo por réplica de PDMS. Una vez completado el moldeo por réplica y recortado el contorno del dispositivo, utilice un punzón de biopsia de 0,75 milímetros de diámetro exterior para perforar los puertos fluidicos en las tres regiones redondeadas mostradas en esta figura. Aplique cinta adhesiva transparente al lado del patrón del PDMS y desprenda para eliminar cualquier polvo tras la unión por plasma.

El PDMS a una portaobjetos de vidrio limpia. Coloque todo el dispositivo en un horno y caliente el horno gradualmente hasta 120 grados Celsius. Deje el dispositivo en el horno a 120 grados Celsius durante la noche para completar la unión y para devolver el PDMS a su estado hidrofóbico original.

Un método alternativo para hacer hidrofóbica la superficie de vidrio del canal consiste en inyectar un recubrimiento como aquae en los puertos fluidicos y luego purgar con aire. Utilizando una jeringa de un mililitro y una aguja de jeringa, aspire varios cientos de microlitros de aire, seguidos de una pequeña cantidad de aquil suficiente solo para llenar la punta metálica de la jeringa. Inyecte cuidadosa pero firmemente el aqua, seguido del aire de purga, en los puertos fluidicos, sin romper agresivamente el enlace entre el PDMS y el vidrio.

Repita la purga de aire en todos los puertos de entrada y salida mientras elimina cualquier exceso de agua para evitar depósitos que puedan obstruir los canales al secarse. Controlar la concentración celular es esencial para lograr el número adecuado de células por número adecuado de gotas. Esto tiene dos componentes desafiantes.

La primera consiste en estimar la concentración adecuada de antemano, y la segunda en mantener dicha concentración durante el experimento. Para el dispositivo específico utilizado en este estudio, células u partículas de ocho a 15 micrones deberían ordenarse adecuadamente para lograr una encapsulación controlada. En esta demostración, se utilizarán microesferas de poli(diario) de 9,9 micrones como sustitutos celulares para preparar la concentración de la suspensión acuosa de partículas con el fin de lograr una encapsulación ideal. Comience con una concentración stock de microesferas del 1% en peso de sólidos, utilizando datos previos para lograr un orden completo. Como guía, aumente la concentración hasta un 1,5% en sólidos mediante la centrifugación suave de un mililitro de la muestra stock, retire 250 microlitros del líquido sobrenadante y resuspenda las partículas mediante agitación en vórtex o mezcla más suave.

Al utilizar células, tanto las células como las partículas de poliestireno tienen una densidad específica mayor que uno, aunque esto no se muestra en este video. Para experimentos a largo plazo que duran del orden de varios minutos a horas, se puede ajustar la flotabilidad de la solución añadiendo un soluto como cloruro de calcio para partículas u OptiPrep para células. Una vez que la suspensión de células o partículas esté lista, prepare una muestra de 10 mililitros de la fase continua de aceite fluorado en un tubo cónico de 15 mililitros y vortexéelo.

Mezcle el tensioactivo y el aceite de fluorocarbono hasta aproximadamente un 2,5 % en peso. Aquí obtenemos una mezcla del 2,4 % en peso, lo cual es aceptable para montar el experimento de microencapsulación. Primero, encienda la alimentación para el microscopio óptico invertido y la cámara de alta velocidad.

Enfóquese en la capa del microcanal e inspeccione los canales en busca de obstrucciones y cualquier residuo que podría desprenderse. Seleccione un canal libre de residuos grandes u obstrucciones evidentes. Corte tres tramos de tubo de PVC translúcido tigón para la entrada acuosa, la entrada de aceite y la salida de la emulsión para minimizar el volumen muerto.

Corte una longitud de tubo suficiente para que alcance desde las bombas de jeringa hasta el microscopio. Corte los extremos del tubo en un ángulo de 45 grados para facilitar su inserción en los puertos fluidicos; utilice pinzas para ajustar a presión los extremos del tubo dentro de los puertos fluidicos. Luego, ajuste a presión una aguja de jeringa de acero inoxidable sin punta de calibre 30 en el extremo libre del tubo de entrada acuosa.

Repita el procedimiento para el tubo de entrada de aceite. Mueva el dispositivo y conecte los tubos al portaobjetos del microscopio utilizando un objetivo de 20 aumentos; alinee y enfoque en la boquilla del dispositivo. Ajuste manualmente el microscopio para obtener una iluminación de Köhler que proporcione una iluminación óptima en el plano focal.

Utilizando el recorte del software de la cámara de alta velocidad, ajuste el campo de visión alrededor de la boquilla para permitir tasas de fotogramas más altas, y luego configure la tasa de fotogramas, el tiempo de exposición y otros parámetros de la cámara según sea necesario para una grabación óptima. A continuación, llene una jeringa de un mililitro con la solución acuosa previamente preparada y bien mezclada. Llene una jeringa de tres mililitros con la solución de la fase oleosa.

Coloque verticalmente una de las jeringas llenas y golpee suavemente para mover las burbujas de aire hacia la salida de la jeringa. Presione lentamente el émbolo el tiempo suficiente para expulsar el aire hacia la punta de la jeringa, manteniéndola en posición vertical. Conecte la jeringa a la aguja correspondiente ya fijada al dispositivo.

Presione el émbolo para forzar el aire a través del volumen muerto de la aguja de la jeringa hasta que el fluido sea expulsado a través del tubo casi hasta el dispositivo; monte firmemente la jeringa en una bomba de jeringa y active el bloque del émbolo. Repita las conexiones para la segunda jeringa y colóquela en una segunda bomba de jeringa; encienda cada bomba de jeringa y programe cada una. Siguiendo los protocolos del fabricante, establezca las velocidades de flujo iniciales en 50 microlitros por minuto para la fase oleosa y cinco microlitros por minuto.

Para el inicio con la fase acuosa, las bombas esperan a que cada fluido ingrese al dispositivo y llene los canales, expulsando el aire muerto residual. Esto puede tardar varios minutos utilizando las tasas de flujo iniciales. Observe la formación de gotas en la boquilla.

Aumente lentamente la velocidad de flujo acuoso para observar el ordenamiento de las partículas en el canal largo de solución acuosa. A medida que aumenta la velocidad de flujo, no la incremente hasta el punto en que se produzca la emisión en chorro del flujo de fluido acuoso en la boquilla, como se muestra en este ejemplo; utilizando una boquilla diferente para la generación de gotas, observe que el flujo inestable y las gotas inconsistentes están presentes aquí. Si la concentración de partículas es demasiado baja para proporcionar trenes alternos con relativamente pocas partículas faltantes y la muestra no fue ajustada por flotabilidad, incline físicamente la bomba de jeringa hacia la salida de la jeringa para permitir un asentamiento gradual de las partículas hacia las salidas de la jeringa.

Una vez que se logre un ordenamiento adecuado, ajuste el caudal de aceite para sintonizar la frecuencia de generación y el tamaño de las gotas. Ajuste iterativamente ambos caudales para alcanzar las tasas de encapsulación y volúmenes de gotas deseados. Una vez confirmada la encapsulación ordenada y estable, mueva el tubo de salida desde el depósito de desecho hacia un depósito de recolección para su uso futuro.

Se puede lograr la encapsulación de partículas o células individuales y dobles con alta eficiencia. Utilizando este protocolo, que se muestra aquí, se obtiene un resultado representativo de encapsulación de partículas individuales con un caudal de aceite de 60 microlitros por minuto y un caudal acuoso de nueve microlitros por minuto. Lambda, el número promedio de partículas por gota, es 0.95.

La separación entre partículas en la dirección del flujo es de aproximadamente 17 a 18 micrones para partículas alternadas completamente ordenadas. La tasa de generación de gotas en este ejemplo es de 6,1 kilohercios con un tamaño promedio de gota de 24,4 picolitros. El histograma compara la eficiencia de encapsulación de partículas por gota en orden de encapsulación de una sola partícula con más.

En cuanto a la estadística, para un tamaño de muestra de 517 gotas, la fracción promedio de gotas que contienen una partícula es del 79,5 %, frente a una fracción de encapsulación aleatoria predicha del 36,7 %. La fracción de partículas que terminan en gotas correctamente encapsuladas se observó que fue del 83,7 % para un tamaño de muestra de 491 partículas, mientras que la fracción de encapsulación aleatoria fue del 37,3 %. La encapsulación de doble partícula se logra simplemente reduciendo el caudal de aceite a 30 microlitros por minuto, manteniendo el caudal acuoso en nueve microlitros por minuto. Aquí, lambda, el número promedio de partículas por gota, es 1,8. Similar a la encapsulación de partículas individuales.

La separación entre partículas en la dirección del flujo es de aproximadamente 17 a 18 micrones para partículas alternadas completamente ordenadas. Las gotas más grandes tienen un tamaño promedio de 39,8 picolitros y se han formado a una velocidad de 3,8 kilohercios en comparación con la encapsulación aleatoria. Para un tamaño de muestra de 383 gotas, la fracción promedio de gotas con encapsulación ordenada que contienen dos partículas es del 71,5 %, frente a una fracción predicha de encapsulación aleatoria del 26,8 %. Se observó que la fracción de partículas que terminaron en gotas correctamente encapsuladas fue del 79,5 % para un tamaño de muestra de 689 partículas, mientras que la fracción de encapsulación aleatoria fue del 33,4 %. Tomado.

En conjunto, estos resultados muestran que las eficiencias de encapsulación tanto de partículas individuales como dobles superan en más de un factor de dos a las eficiencias de encapsulación aleatoria, y reducen considerablemente el número de gotas que no contienen el número deseado de células o partículas. La importancia de las concentraciones adecuadas de partículas o células para lograr una alta eficiencia de encapsulación se ilustra en este ensayo experimental. Aunque los caudales del aceite y de la fase acuosa son los mismos que en el ensayo de encapsulación de partículas dobles mostrado anteriormente, el número promedio de células por gota lambda se reduce a 1,57.

Por consiguiente, no se produce un ordenamiento completo, y por lo tanto surgen huecos en los trenes, dejando gotas con menos partículas de las previstas. Este histograma muestra la eficiencia reducida para la encapsulación de dos partículas debido al valor más bajo de Lambda. Para un tamaño de muestra de 324 gotas, la fracción promedio de gotas que contienen dos partículas fue del 55,9 %, con casi tantas gotas con una sola partícula como gotas con dos partículas.

Esto indica que Lambda debería ser igual o cercano al número de células deseadas por gota para maximizar las partículas o células encapsuladas correctamente, con el valor exacto de lambda elegido según se toleren menos o más células por gota. En esta demostración, aprovechamos las diferencias de flotabilidad para permitir el control en tiempo real de la concentración durante el experimento. Sin embargo, para experimentos de mayor duración, puede ser recomendable igualar la flotabilidad para obtener resultados más consistentes tras el encapsulamiento de células en gotas acuosas.

Pueden realizarse experimentos dependientes del tiempo en un tubo de centrífuga o bajo un microscopio mediante la reinyección de las gotas en matrices microfluídicas.