De alto rendimiento de una sola célula y múltiple las células de micro-encapsulación

Las aplicaciones que utilizan células encapsuladas en pequeñas gotas de tamaño de picolitros a menudo se han visto limitadas por la incapacidad de controlar el número de células por gota. Este protocolo demuestra un método para controlar la encapsulación de células mediante la combinación de dos fenómenos microfluídicos distintos, el ordenamiento de células dinámicas de fluidos y la generación de gotas en una microboquilla de enfoque de flujo. En un canal aguas arriba, se proporciona un caudal suficientemente alto de solución acuosa con celdas o partículas suspendidas para causar la formación de trenes con igual espaciado en la dirección del flujo aguas abajo.

Se utiliza una boquilla generadora de gotas de enfoque de flujo para formar gotas acuosas a velocidades de kilohercios en un fluido portador de aceite admisible estabilizado con surfactante. A continuación, los trenes de partículas de células ordenadas se combinan con la generación de gotas ajustando los caudales acuosos y de aceite para proporcionar tasas de generación de gotas que se sincronizan con la llegada de células o partículas ordenadas longitudinalmente a la boquilla de generación de gotas, mientras que las partículas se utilizan como sustitutos de las células. Para demostrar este protocolo, los caudales deben ser lo suficientemente pequeños como para limitar el fluido.

Las tensiones puras en las células biológicas, la superposición de la generación de gotas de orden celular y la viabilidad celular. Las restricciones de caudal acuoso proporcionan un régimen operativo ideal para la encapsulación controlada de celdas simples y múltiples. El análisis de los datos de microscopía de video muestra que las eficiencias de encapsulación de una y dos celdas o partículas superan las eficiencias de encapsulación aleatoria y reducen en gran medida el número de gotas, que no contienen el número deseado de células o partículas.

El confinamiento de células y gotas limita la dilución de las secreciones celulares, resalta la heterogeneidad celular y también controla las señales intercelulares en comparación con una suspensión a granel. Los medios eficientes para encapsular estas células en gotas proporcionan una herramienta valiosa para que los investigadores biológicos comiencen este procedimiento. Diseñe un patrón de microcanal como se muestra en esta figura en el software AutoCAD.

La sección de canal largo representa el canal de ordenación de flujo acuoso con un ancho de 27 micras. El esquema de boquilla ampliado muestra anchos de canal iguales de 27 micras para el canal de pedido acuoso y el canal de aceite, seguido de la contracción de la boquilla de 22 micras y una expansión repentina a un canal más amplio de 61 micras. La altura del dispositivo es de 52 micras.

Tanto las entradas acuosas como las de aceite tienen grandes filtros de residuos con espacios del orden del ancho del canal de orden, como se ilustra en este esquema ampliado de la entrada de aceite. Mostrado. Aquí hay una imagen real del canal de pedido y la boquilla inyectada con tinte. Contrata a un fabricante externo para imprimir una máscara de transparencia de alta resolución en película de Mylar o cuarzo donde los canales son transparentes sobre un fondo oscuro.

Posteriormente, cree un maestro fotorresistente de silicona y SU eight para el moldeo de réplicas. Pega el molde maestro en la parte inferior de una placa de Petri para la moldura de réplica de PDMS. Una vez que se haya completado el moldeo de la réplica y se haya cortado el contorno del dispositivo, use un punzón de biopsia de 0,75 milímetros de diámetro exterior para perforar puertos fluidos en las tres regiones redondas que se muestran en esta figura, una querida cinta adhesiva en el lado del patrón del PDMS y pela para eliminar el polvo después de la unión por plasma.

El PDMS a un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio. Coloque todo el dispositivo en un horno y caliente el horno gradualmente a 120 grados centígrados. Deje el dispositivo en el horno a 120 grados centígrados durante la noche para completar la unión y devolver el PDMS a su estado hidrofóbico original.

Un método alternativo para hacer que la superficie de vidrio del canal sea hidrófoba es inyectar un recubrimiento como aquae en los puertos fluídicos y luego purgarlos con aire. Usando una jeringa de un mililitro y una aguja de jeringa, extraiga varios cientos de microlitros de aire, seguido de una pequeña cantidad de aquil, suficiente para llenar solo la punta de la jeringa de metal, con cuidado pero con firmeza, inyecte el agua seguido del aire de purga en los puertos fluídicos. Sin romper agresivamente la unión PDMS a vidrio.

Repita la purga de aire en todos los puertos de entrada y perspectiva mientras limpia el exceso de agua para evitar depósitos que puedan obstruir los canales durante el secado. El control de la concentración celular es esencial para lograr el número adecuado de células para el número adecuado de gotas. Esto tiene dos componentes desafiantes.

La primera es estimar la concentración adecuada de antemano, y la segunda es mantener esa concentración durante el experimento. Para el dispositivo particular utilizado en este estudio, las células o partículas de ocho a 15 micras deben ordenarse adecuadamente para una encapsulación controlada. En esta demostración, se utilizarán microesferas de diario de polis de 9,9 micras como sustitutos de células para preparar la concentración de suspensión de partículas acuosas para lograr una encapsulación de auditoría ideal, comenzando con una concentración de stock de microesferas del 1% de sólidos en peso utilizando datos anteriores para un pedido completo. Como guía, aumente la concentración a 1,5% de sólidos centrifusionando suavemente un mililitro de la muestra madre, eliminando 250 microlitros de líquido supinato y Resus suspendiendo las partículas mediante una mezcla en vórtice o una mezcla más suave.

Cuando se usan celdas, tanto las celdas como las partículas de poliestireno tienen una gravedad específica mayor que uno, aunque no se muestra en este video. Para experimentos a largo plazo que duran del orden de muchos minutos a horas, la flotabilidad de la solución puede combinarse agregando un soluto como cloruro de calcio para las partículas u opti prep para las células. Una vez que la celda o la suspensión de partículas esté lista, prepare una muestra de 10 mililitros de la fase continua de aceite de fluorocarbono en un vórtice de tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Mezcle el surfactante y el aceite de fluorocarbono hasta aproximadamente el 2,5% de peso en peso. Aquí obtenemos una mezcla de 2,4 pesos en peso, que es aceptable para montar el experimento de microencapsulación. Primero, encienda el microscopio óptico invertido y la cámara de alta velocidad.

Concéntrese en la capa de microcanales e inspeccione los canales en busca de obstrucciones y cualquier residuo que pueda desprenderse. Seleccione un canal libre de escombros grandes u obstrucciones obvias. Corte tres tramos de tubo de PVC tigón translúcido para la entrada acuosa, la entrada de aceite y la salida de emulsión para minimizar el volumen muerto.

Corte el tubo suficiente para llegar desde las bombas de jeringa hasta el microscopio. Los extremos del tubo cortados por etapas en un ángulo de 45 grados Para facilitar la inserción en los puertos fluídicos, use pinzas para presionar los extremos del tubo en los puertos fluídicos. A continuación, presione una aguja de jeringa de acero inoxidable de punta roma de calibre 30 en el extremo libre del tubo de entrada acuoso.

Repita para el tubo de entrada de aceite. Mueva el dispositivo y conecte el tubo a la platina del microscopio usando una alineación de objetivo 20 veces y concéntrese en la boquilla del dispositivo. Ajuste manualmente el microscopio para la iluminación Kohler para proporcionar una iluminación óptima en el plano focal.

Con el software de la cámara de alta velocidad, recorte el campo de visión alrededor de la boquilla para permitir velocidades de fotogramas más altas y, a continuación, establezca la velocidad de fotogramas, el tiempo de exposición y otros ajustes de la cámara según sea necesario para una grabación óptima. A continuación, llene una jeringa de un mililitro con la solución de fase acuosa bien mezclada previamente preparada. Llene una jeringa de tres mililitros con la solución en fase oleosa.

Incline una de las jeringas llenas verticalmente y muévala para mover las burbujas de aire a la salida de la jeringa. Presione lentamente el émbolo el tiempo suficiente para empujar el aire hacia la punta de la jeringa que sostiene la jeringa verticalmente. Conecte la jeringa a la aguja de jeringa respectiva que ya esté conectada al dispositivo.

Presione el émbolo para forzar el aire a través del volumen muerto de la aguja de la jeringa hasta que el líquido sea empujado a través del tubo casi hasta el dispositivo, monte firmemente la jeringa en una bomba de jeringa y enganche el bloque del émbolo. Repita las conexiones para la segunda jeringa y móntela en una segunda bomba de jeringa en cada bomba de jeringa y programe cada bomba. Siguiendo los protocolos del fabricante, ajuste los caudales iniciales a 50 microlitros por minuto para la fase oleosa y cinco microlitros por minuto.

Para el inicio de la fase acuosa, las bombas esperan a que cada fluido entre en el dispositivo y llenen los canales expulsando el aire muerto restante. Esto puede llevar varios minutos utilizando los caudales iniciales. Observe la formación de gotas en la boquilla.

Aumente lentamente el caudal acuoso para observar el orden de las partículas en el canal de solución acuosa larga. Como los aumentos del caudal no aumentan el caudal hasta el punto en que se desencadena la inyección de la corriente de fluido acuoso en la boquilla como se muestra en este ejemplo, utilizando una nota de boquilla de generación de gotas diferente, el flujo inestable y la caída inconsistente están aquí. Si la concentración de partículas es demasiado baja para proporcionar trenes alternos con relativamente pocas partículas faltantes y la muestra no coincidió con la flotabilidad, incline físicamente la bomba de jeringa hacia la salida de la jeringa para proporcionar una sedimentación gradual de las partículas hacia las salidas de la jeringa.

Una vez que se produzca el pedido adecuado, ajuste el caudal de aceite para ajustar la frecuencia de generación y el tamaño de las gotas. Ajuste iterativamente ambos caudales para lograr las tasas de encapsulación y los volúmenes de caída deseados. Una vez que se confirme la encapsulación ordenada estable, mueva la tubería de salida del depósito de desechos a un tanque de recolección para uso futuro.

La encapsulación de una o dos partículas o celdas se puede lograr con alta eficiencia. Utilizando este protocolo que se muestra aquí se muestra un resultado representativo de la encapsulación de una sola partícula con un caudal de aceite de 60 microlitros por minuto y un caudal acuoso de nueve microlitros por minuto. Lambda, el número medio de partículas para la gota es de 0,95.

El espaciado de partículas en la dirección del flujo es de aproximadamente 17 a 18 micras para partículas alternas completamente ordenadas. La tasa de generación de gotas en este ejemplo es de 6,1 kilohercios con un tamaño de gota medio de 24,4 picolitros. El histograma compara la eficiencia de la partícula de encapsulación en gota del orden de la encapsulación de una sola partícula con más.

En estadística, la encapsulación aleatoria para un tamaño de muestra de 517 gotas, la fracción promedio de gotas que contienen una partícula es 79.5% en comparación con una fracción de encapsulación aleatoria predicha de 36.7%La fracción de partículas que terminan en las gotas correctamente encapsuladas se observó que es 83.7% para un tamaño de muestra de 491 partículas, mientras que la fracción de encapsulación aleatoria fue del 37,3%La encapsulación de doble partícula se logra simplemente reduciendo el caudal de aceite a 30 microlitros por minuto mientras se mantiene el caudal acuoso a nueve microlitros por minuto. Aquí lambda, el número medio de partículas por gota es de 1,8. Similar a la encapsulación de una sola partícula.

El espaciado de partículas en la dirección del flujo es de aproximadamente 17 a 18 micras para partículas alternas completamente ordenadas. Las gotas más grandes tienen un tamaño de gota promedio de 39,8 picolitros y se han formado a una velocidad de 3,8 kilohercios en comparación con la encapsulación aleatoria. Para un tamaño de muestra de 383 gotas, la fracción promedio de las gotas de encapsulación ordenadas que contienen dos partículas es del 71,5%en comparación con una fracción de encapsulación aleatoria predicha del 26,8%Se observó que la fracción de partículas que tendían hacia arriba en las gotas correctamente encapsuladas era del 79,5% para un tamaño de muestra de 689 partículas, mientras que la fracción de encapsulación aleatoria fue del 33,4%Taken.

En conjunto, estos resultados muestran que las eficiencias de encapsulación de partículas simples y dobles superan las eficiencias de encapsulación aleatoria en más de un factor de dos y reducen en gran medida el número de gotas, que no contienen el número deseado de células o partículas. En esta ejecución experimental se ilustra la importancia de las concentraciones adecuadas de partículas o células para una alta eficiencia de encapsulación. Si bien los caudales de aceite y acuoso son los mismos que en la ejecución de encapsulación de doble partícula mostrada anteriormente, el número promedio de celdas por gota lambda se reduce a 1,57.

En consecuencia, no se produce un pedido completo y, por lo tanto, surgen agujeros en los trenes que dejan gotas de sol con menos partículas de las previstas. Este histograma muestra la disminución de la eficiencia para la encapsulación de dos partículas debido al menor valor de Lambda. Para un tamaño de muestra de 324 gotas, la fracción promedio de gotas que contenían dos partículas fue del 55,9%, con casi tantas gotas de partículas simples como gotas de partículas dobles.

Esto indica que Lambda debe ser igual o cercano al número de celdas por gota deseadas para maximizar las partículas correctamente encapsuladas o celdas con el valor exacto de lambda elegido, según si se toleran menos o más celdas por gota. En esta demostración, explotamos los desajustes de flotabilidad para permitir el control en tiempo real de la concentración durante el experimento. Sin embargo, para experimentos a largo plazo, puede ser aconsejable igualar la flotabilidad para obtener resultados más consistentes después de la encapsulación de las células en gotas acuosas.

Los experimentos dependientes del tiempo se pueden realizar en un tubo de centrífuga o bajo un microscopio reinyectando las gotas en matrices microfluídicas.