Name: Encapsulación de células de mamífero en perlas de alginato usando un recipiente agitador simple (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Aprende a encapsular células de mamífero en perlas de alginato mediante emulsión en agua y aceite con gelación interna usando carbonato de calcio. Este método escalable permite aplicaciones en terapia celular y cultivo in vitro.

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Damos las gracias a Jill Osborne por su trabajo de puesta a tierra en el proceso de emulsificación y Lauren Wilkinson para el apoyo técnico. Agradecemos al Dr. Igor Laçik, al Dr. Timothy J. Kieffer y al Dr. James D. Johnson por su contribución y colaboración. Agradecemos a Diabète Québec, a la JDRF, a ThéCell, al Centro de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería (CRSNG), al Centro para el Trasplante de Islotes Humanos y la Regeneración de Células Beta, la Red Canadiense de Células Madre, Fundación Michael Smith para la Investigación en Salud, el Fondo québécois de la investigación sobre la naturaleza y las tecnologías y COST 865 para apoyo financiero.

1. Preparar la Solución de Alginato, la Suspensión de CaCO3 y el Aceite Acidificado <ol><li> Prepare el buffer de proceso y el medio. <ol><li> Prepare el tampón de proceso típico usado para generar perlas de alginato de alta concentración utilizando HEPES 10 mM, NaCl 170 mM. Ajuste el pH a 7.4. </li><li> Preparar el medio de cultivo típico usando Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene suero bovino fetal al 10% (FBS), glutamina 6 mM, penicilina 100 U / mL y estreptomicina 100 mg / ml. </li></ol></li><li> Preparar la solución madre de alginato a 1,17 veces la concentración final deseada en las perlas. <ol><li> Primero, pesa la cantidad apropiada de polvo de alginato. Por ejemplo, para obtener una concentración final de alginato al 5% con LVM 50:50 y alginato MVG, se pesan un total de 1,17 g de alginato sódico combinando 0,583 g de polvo de alginato LVM y 0,583 g de polvo de alginato MVG. </li><li> Coloque 20 ml de buffer de proceso en un autocJarra de vidrio lavable en una placa de agitación magnética y agitar a ~ 200 rpm. Añadir progresivamente el polvo de alginato de sodio a la solución. </li><li> Dejar la solución agitando durante una noche a baja velocidad. Si es necesario, sujete el matraz a la placa de agitación. </li><li> Si la disolución se disuelve incompletamente, fije la botella en un mezclador rotatorio y continúe mezclando a 37 ° C durante 24 h adicionales. </li><li> Esterilizar la solución de alginato en autoclave la solución durante 30 min en un recipiente que está a menos de la mitad llena. Deje que la temperatura disminuya por debajo de 60 ° C antes de recuperar la solución. </li><li> Si es necesario, eliminar las partículas por filtración de la solución de alginato poco después de autoclave antes de que alcance la temperatura ambiente, mientras que la viscosidad se mantiene lo suficientemente bajo. </li></ol></li><li> Preparar la suspensión de carbonato de calcio a 21 veces la concentración final deseada para la gelificación interna. <ol><li> Pesar el polvo de CaCO3. Por ejemplo, anuncioD 1 g de CaCO $ ₃ $ a 20 ml de tampón de proceso para obtener CaCO $ ₃ $ 24 mM como la concentración final del agente gelificante. </li><li> Autoclave la suspensión de CaCO 3 durante 30 min. NOTA: La concentración de CaCO3 cambiará con el tiempo debido al equilibrio bicarbonato - CO 2 . Evite usar la misma suspensión de CaCO 3 para más de 10 procedimientos de encapsulación. </li></ol></li><li> Autoclave el recipiente de agitación utilizado para el proceso de emulsión. Antes de usar, retire cualquier traza de agua condensada que quede en el matraz de centrifugado. </li><li> Inmediatamente antes del proceso de emulsión, preparar el aceite acidificado. Disolver 44 μl de ácido acético por 11 ml de aceite mineral colocado en un tubo cónico de 50 ml. NOTA: Un error común es la disolución incompleta del ácido acético. Evite pipetear pequeñas cantidades de ácido acético y asegúrese de que el ácido acético esté completamente disuelto en el aceite por vórtex repetido. PRECAUCIÓN: el ácido acético es tóxico<html> D ácido volátil. Manejar este reactivo bajo una campana extractora y mantener la solución de ácido acético / aceite en un recipiente cerrado hasta la etapa de emulsificación. Consulte la información de MSDS de este reactivo para obtener más información. </li><li> Permita que todas las soluciones alcancen la temperatura ambiente antes de proceder a la encapsulación celular. </li></ol> 2. Generación de perlas de alginato por emulsificación y gelificación interna <ol><li> Coloque 10 ml de aceite mineral ligero en el matraz giratorio y comience a agitar a una velocidad de rotación baja ( por ejemplo, 250 rpm para el matraz giratorio usado en este video). </li><li> Si las células usadas para el proceso son de cultivos adherentes, aplique tripsina para suspender las células. Termine la reacción añadiendo medio que contenga FBS o inhibidor de tripsina y recoja una muestra para la enumeración celular. <ol><li> Determine la concentración celular y la viabilidad después de la tinción con azul tripán utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado, como se ha descrito anteriormenteAss = &quot;xref&quot;&gt; 32. </li></ol></li><li> Centrifugar las células durante 7 min a 300 xg y lavarlas una vez en el medio deseado para la inmovilización celular. Asegúrese de que este medio contenga emulsionantes tales como FBS o albúmina de suero bovino (BSA). Por ejemplo, use DMEM que contenga FBS al 10%. </li><li> Se vuelve a suspender el sedimento celular en el mismo medio para obtener 10,5 veces la concentración final deseada en las perlas. </li><li> Añadir 1,1 ml de la población celular concentrada de 10,5 veces a 9,9 ml de la solución de alginato. Luego, agregue 550 μl de suspensión de CaCO3 y mezcle agitando con una espátula estéril para asegurar una distribución uniforme del CaCO3. </li><li> Transfiera inmediatamente 10,5 ml de la mezcla de alginato, célula y CaCO3 en el aceite de agitación usando una jeringa. NOTA: Para soluciones altamente viscosas, aspirar y expulsar la mezcla muy lentamente para evitar burbujas de aire. En algunos casos, es preferible detener la agitación mientras se añade la mezcla al matraz para evitarAlginato en el eje del impulsor. </li><li> Inmediatamente después de añadir el alginato, la célula y la mezcla de CaCO3 al aceite, aumentar la velocidad de agitación. NOTA: Para el alginato LVM: MVG al 5% utilizado aquí, se aplicó una velocidad de rotación de 1025 rpm para generar perlas de aproximadamente 900 μm de diámetro adecuadas para cultivo in vitro 35 . Velocidades de rotación más altas y concentraciones más bajas de alginato conducirán a diámetros medios de perlas más bajos, como se describe en publicaciones anteriores 25 , 32 . Cambios leves en la geometría del impulsor y del recipiente, así como las propiedades del alginato pueden afectar grandemente el diámetro medio del grano. Para cada cambio en la configuración del recipiente o en el lote de alginato, debería generarse una curva estándar que relaciona el diámetro medio del talón del área superficial con la velocidad de rotación 32 . </li><li> Iniciar el temporizador y emulsionar el alginato durante 12 min. </li><li> Añadir 10 ml de tEl aceite y la solución de ácido acético para acidificar la emulsión, disolver el CaCO3 y por lo tanto reticular físicamente el alginato en perlas gelificadas. Deje 8 min para esta etapa de acidificación. </li></ol> 3. Recuperación del grano <ol><li> Reducir la velocidad de agitación a 400 rpm. Añadir 40 mL de tampón de proceso mezclado con un 10% de medio para aumentar el pH y causar la inversión de fase. </li><li> Parar la agitación 1 min después y transferir la mezcla a tubos de centrífuga de 50 ml. Enjuague el frasco giratorio con un medio adicional de 20 ml y agregue esto al tubo. Aspirar tanta fase acuosa como sea posible desde el matraz girador antes de aspirar la fase de aceite para minimizar el contacto del talón con la fase oleosa. NOTA: Utilice una pipeta de gran calibre ( por ejemplo, una pipeta de 25 ml) en este paso y desde este punto para evitar dañar las perlas. Para volúmenes más pequeños, la suspensión del talón también se puede manipular con puntas de pipeta cortadas. Para obtener tales puntas, corte el extremo de la punta de la pipeta con las tijeras whProtección del ojo que usa. </li><li> Centrifugar los tubos durante 3 min a 630 xg para acelerar la sedimentación del grano y la separación de fases. </li><li> Eliminar el aceite y el exceso de solución acuosa por aspiración con una pipeta Pasteur. </li><li> Lave las perlas al menos una vez con el medio. Filtrar la suspensión de perlas en filtros de células de nylon de 40 μm, y aspirar el exceso de líquido asociado con las perlas desde debajo del filtro. Transferir las perlas en un volumen conocido de medio utilizando una espátula estéril. NOTA: En este paso se pueden usar filtros de tamaño de poro más pequeño o más grande, dependiendo del diámetro mínimo del talón objetivo. Sin embargo, se recomienda la filtración por gravedad en lugar de filtración por presión a través de filtros de tamaño de poro submicrónicos para evitar dañar las perlas. </li><li> Medir el volumen de la perla por volumen (volumen después de añadir las perlas, menos el volumen antes de añadir las perlas) y recargar el medio para obtener la proporción deseada de perlas: volumen total, que es típicamente de 1: 5 o 1 ml de perlas en4 ml de medio. A partir de este punto, utilice siempre pipetas de gran diámetro para evitar dañar las perlas. </li><li> Transferir las células encapsuladas en frascos T para el cultivo in vitro o experimentos de trasplante. </li></ol> 4. Control de Calidad y Aplicaciones NOTA: Con el fin de garantizar la calidad de las células y los granos encapsulados, se debe cuantificar la distribución del tamaño del cordón y la supervivencia celular después del proceso. La inversión del gel para recuperar las células desde dentro de las perlas para un análisis posterior se realiza comúnmente. <ol><li> Para evaluar la distribución del tamaño del cordón, se tiñen las perlas con azul de toluidina-O. <ol><li> Se colocan 0,5 ml de perlas en 4 ml de tampón de proceso que contiene un 10% de medio completo. </li><li> Añadir 500 μl de una solución de azul de toluidina 1 g / L preparada en tampón de proceso. </li><li> Incubar durante 60 minutos en un tubo cónico en un agitador rotatorio a 50 rpm. </li><li> Añadir 5 ml de tampón de proceso que contiene 10% de medio completo e immedInmediatamente transferir las perlas y la solución en una placa de Petri y adquirir imágenes en un microscopio de baja ampliación o utilizando una cámara digital de mano. Si es necesario, coloque la placa de Petri en una caja de luz antes de adquirir imágenes con una cámara de mano para mejorar el contraste y evitar las sombras. </li><li> Realizar el análisis de imagen para cuantificar la distribución de tamaño de talón como se describió anteriormente 32 , por ejemplo utilizando el análisis de imágenes freeware [ 36] . </li></ol></li><li> Para evaluar cualitativamente la supervivencia celular, se tiñen las células usando homodímero de etidio para identificar células muertas y calceína AM para identificar células vivas. <ol><li> Añadir 1 volumen de perlas a 4 volúmenes de tampón de proceso que contiene 10% de medio completo. </li><li> Se añade la cantidad apropiada de soluciones madre de calceína AM y de homodímero de etidio para obtener concentraciones de 4 μM y 2 μM, respectivamente. Genere controles de manchas individuales añadiendo sólo uno de los reactivos a algunas muestras de perlas.</li><li> Incubar las perlas en hielo durante 20 min. </li><li> Coloque la solución entre una diapositiva y un cubreobjetos usando un espaciador tal como una junta tórica para evitar comprimir las perlas. </li><li> Proceder a la microscopía de fluorescencia. Utilice los controles de una sola mancha para evaluar el sangrado de fluorescencia. Seleccione filtros de fluorescencia apropiados basados ​​en las longitudes de onda de excitación / emisión asociadas con calceína AM (494/517 nm) y homodímero de etidio unido a ADN (528/617 nm). </li></ol></li><li> Para recuperar las células de las perlas para un análisis posterior, se descomprime el alginato usando citrato u otra solución quelante. <ol><li> Preparar una solución de degelación que contenga citrato 55 mM, HEPES 10 mM y NaCl 95 mM a pH 7,4. </li><li> Mezclar esta solución con medio al 10%, y luego agregar 1 ml de perlas de alginato a 9 ml de la mezcla. </li><li> Degel las perlas en hielo con 75 rpm de agitación durante 20 min. NOTA: Las células pueden ahora ser usadas para análisis o eliminadas de la solución de alginato desgomadoIon por centrifugación. Por ejemplo, la viabilidad celular después de la degelación puede cuantificarse mediante tinción con azul de tripán. Alternativamente, las células pueden centrifugarse y lavarse, seguido por mRNA, ADN y / o muestreo y análisis de proteínas. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Varias etapas (representadas en la Figura 2 ) durante la reacción de gelificación interna pueden limitar la cinética global. Para los granos de carbonato cálcico mayores de ~ 2,5 μm, se ha demostrado que la velocidad de disolución del carbonato es limitante de la velocidad 26 , 44 . La etapa de acidificación que conduce a la liberación interna de calcio también ha demostrado ser la variable crítica del proceso que afecta ...

La encapsulación de células de mamífero se ha estudiado ampliamente como medio para proteger las células trasplantadas del rechazo inmune 1 o para proporcionar un soporte tridimensional para el cultivo celular inmovilizado 2 , 3 , 4 . El encapsulado de islotes pancreáticos en perlas de alginato se ha utilizado para revertir la diabetes en roedores alogénicos 5 , 6 o xenogénicos 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Los ensayos clínicos y preclínicos del trasplante de islotes pancreáticos encapsulados para tratar la diabetes tipo 1 están en curso 13 , 14 , 15 . Para aplicaciones de trasplante o de mayor escalaE la producción de células inmovilizadas in vitro , generalmente se utilizan generadores de perlas basados ​​en boquillas. Típicamente, se bombea una mezcla de alginato y células a través de una boquilla para formar gotitas que caen en una solución agitada que contiene cationes divalentes, dando como resultado la gelificación externa de las gotitas. El flujo de gas coaxial 16 , 17 , la vibración de boquilla 18 , la repulsión electrostática 19 o los hilos giratorios 20 facilitan la formación de gotitas en la punta de la boquilla. Los inconvenientes principales de los generadores de talón convencionales son su capacidad de producción limitada y el intervalo limitado de viscosidades en solución que darán lugar a una formación adecuada de talones 21 . A caudales elevados, el fluido que sale de la boquilla se rompe en gotitas más pequeñas que el diámetro de la boquilla, disminuyendo el control del tamaño. Se pueden utilizar generadores de bolas de boquillas múltiples para aumentar el rendimiento, peroLa distribución uniforme del flujo entre las toberas y el uso de soluciones&gt; 0,2 Pas es problemático 22 . Por último, se espera que todos los dispositivos basados ​​en boquillas impongan algún daño a los islotes, ya que el diámetro de las boquillas utilizadas está entre 100 μm y 500 μm, mientras que el ~ 15% de los islotes humanos puede ser mayor de 200 μm 23 . En este video, describimos un método alternativo para encapsular células de mamífero formando gotitas en una única etapa de emulsificación en lugar de gota a gota. Dado que la producción de perlas se realiza en un recipiente de agitación simple, el método es adecuado para una producción pequeña (~ 1 ml) a gran escala (10 3 L) con costes de equipo reducidos 24 . Este método permite la producción de perlas con alta esfericidad usando una amplia gama de viscosidades de alginato con tiempos de generación cortos ( por ejemplo, 20 min). Este método fue desarrollado originalmente por Poncelet et aL 25 , 26 y se usan para inmovilizar el ADN 27 , las proteínas 28 incluyendo la insulina 29 y las bacterias 30 . Recientemente hemos adaptado estos métodos a la encapsulación de células de mamíferos utilizando líneas de células beta pancreáticas 31 , 32 y tejido pancreático primario 32 . El principio del método es generar una emulsión agua-en-aceite que consiste en gotitas de alginato en aceite mineral, seguida de gelificación interna de las gotitas de alginato ( Figura 1 ). En primer lugar, el encapsulante ( por ejemplo, células) se dispersa en una solución de alginato que contiene una sal de calcio de grano fino con baja solubilidad al pH del proceso inicial. A continuación se añade la mezcla de alginato a una fase orgánica agitada para crear una emulsión, usualmente en presencia de unTensioactivo. En el caso de la encapsulación de células de mamífero, los componentes presentes en el suero pueden actuar como tensioactivos. A continuación, se reduce el pH con el fin de solubilizar la sal de calcio añadiendo un ácido soluble en aceite que divide en la fase acuosa. El ácido acético, con un coeficiente de reparto de aceite mineral / agua &lt;0,005 33 , debe ser pre-disuelto en aceite, luego se agrega a la emulsión donde se mezcla en la fase oleosa y se divide rápidamente en la fase acuosa 34 . La Figura 2 ilustra las reacciones químicas y la difusión que tienen lugar durante la etapa de acidificación y gelificación interna. Finalmente, las células encapsuladas se recuperan mediante inversión de fase, separación de fases acelerada por centrifugación, etapas de lavado repetidas y filtración. Estos pasos pueden ser seguidos por muestreo de cuentas y células para análisis de control de calidad, cultivo celular in vitro y / o transplante de las células encapsuladas. Figura 1: Esquema del proceso basado en emulsificación para encapsular células de mamífero. Las perlas se producen primero emulsionando un alginato, una célula y una mezcla de CaCO3 en aceite mineral (pasos 1 y 2 en el esquema), desencadenando la gelificación interna añadiendo ácido acético (paso 3). Las perlas gelificadas se separan después del aceite mediante la adición de un tampón acuoso para activar la inversión de fase (etapa 4), seguido de centrifugación y aspiración de aceite (etapa 5), ​​y después filtración (etapa 6). Finalmente, las perlas recogidas en el filtro se transfieren al medio de cultivo celular para cultivo in vitro o para trasplante. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <imgAlt = &quot;Figura 2&quot; class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55280 / 55280fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2: Reacciones y etapas de difusión que ocurren durante la gelificación interna. (1) Se añade ácido acético a la fase orgánica y se transporta a las gotitas de alginato por convección. (2) El ácido acético se divide en la fase acuosa. (3) En presencia de agua, el ácido se disocia y difunde hasta alcanzar los granos de CaCO3 representados en azul oscuro. (4) Los iones H + se intercambian con los iones Ca 2+ en CaCO 3 , liberando iones Ca 2+ . (5) Los iones de calcio se difunden hasta que encuentran alginato sin reaccionar, dando lugar a la reticulación ionotrópica de las cadenas de alginato. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Contrariamente a los encapsuladores convencionales de celdas basadas en boquillas, una amplia distribución de tamaño de cordón es expeCitado a partir de este proceso debido al mecanismo de formación de gotitas en emulsificación agitada. Para un subconjunto de aplicaciones, esta distribución de tamaño de talón puede ser problemática. Por ejemplo, una fracción mayor de células puede estar expuesta en la superficie del cordón en perlas más pequeñas. Si las limitaciones de nutrientes ( por ejemplo, oxígeno) son una preocupación, estas limitaciones pueden exacerbarse en cuentas más grandes. Una ventaja del método de emulsión agitado es que el tamaño medio del cordón se puede ajustar fácilmente cambiando la velocidad de agitación durante la etapa de emulsión. La amplia distribución del tamaño del cordón también puede explotarse para estudiar el efecto del tamaño del cordón sobre el rendimiento de las células encapsuladas. La encapsulación de las células de los mamíferos por emulsificación y gelificación interna es una alternativa interesante para los laboratorios que no están equipados con un generador de bolas. Además, este método ofrece a los usuarios la opción de reducir el tiempo de procesamiento, o generar perlas a muy bajo o muy alto concentrado de alginatoAciones. El protocolo descrito a continuación describe cómo encapsular células en 10,5 ml de solución de alginato al 5% preparada en tampón de ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico (HEPES) 10 mM. El alginato consiste en una mezcla 50:50 de LVM de grado de trasplante (contenido de ácido manurónico alto en baja viscosidad) y alginato MVG (contenido de ácido gulurónico alto contenido en viscosidad media). Se utiliza carbonato de calcio a una concentración final de 24 mM como agente reticulante físico. El aceite mineral ligero constituye la fase orgánica, mientras que el ácido acético se utiliza para acidificar la emulsión y desencadenar la gelificación interna. Sin embargo, el tipo y composición de alginato, así como el tampón de proceso seleccionado dependen de la aplicación deseada 32 . Se ha utilizado una variedad de tipos de alginato (véase Tabla de materiales) para producir perlas con este protocolo.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos y consumibles</fuerte></td>Alginato LVM <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(grado de trasplante)</td><td>Novamatrix</td><td>No aplicable</td><td>Referido como "alginato #1" en los resultados.</td></tr><tr><td>MVG alginato (grado de trasplante)</td><td>Novamatrix</td><td>No aplicable</td><td>Referido como "alginato #2" en los resultados.</td></tr><tr><td>Alginato (grado de cultivo celular)</td><td>Sigma</td><td>A0682 (baja viscosidad) o A2033 (viscosidad media)</td><td>A2033 se conoce como "alginato #3" en los resultados.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, caracterizado, de origen canadiense</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, cultivo celular probado</td><td>Sigma</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Avantor Materials</td><td>1301-01</td><td>Después de preparar la suspensión de CaCO3, sonicar y utilizar en el plazo de un mes.</td></tr><tr><td>Aceite mineral ligero</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O121-4</td><td>Filtro estéril a través de un 0.22 &mu; membrana del tamaño de los poros antes de su uso.</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>Manéjelo con precaución: consulte MSDS.</td></tr><tr><td>Espátulas estériles</td><td>Sigma</td><td>CLS3004-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Coladores estériles de células de nylon, 40 &micro; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 y 86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>Toluidina Blue-O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mL matraces giratorios microportadores</td><td>Bellco</td><td>1965-00100</td><td>La configuración del impulsor con modelos recientes puede no ser adecuada para una emulsificación adecuada. Una cuchilla capaz de barrer el aceite hasta 0,5 cm desde el fondo del matraz se puede hacer a medida a partir de una lámina de teflón.</td></tr><tr><td>Placa de agitación magnética con velocidad ajustable</td><td>Bellco</td><td>7760-06005</td><td>La velocidad de rotación debe calibrarse (por ejemplo, con un tacómetro) antes de su uso.</td></tr><tr><td>Contador de celdas</td><td>Innovatis</td><td>Cedex AS20</td><td>Este sistema ahora es vendido por Roche. Este contador de células automatizado también se puede reemplazar por la enumeración manual de células después de la tinción con azul de tripán utilizando un hemocitómetro.</td></tr><tr><td>caja de luz LED</td><td>Artograph</td><td>LightPad&reg; PRO</td><td>Este artículo puede ser reemplazado por otros tipos de iluminadores.</td></tr><tr><td>Cámara de mano</td><td>Canon</td><td>PowerShot A590 IS</td><td>Se puede utilizar una gran variedad de cámaras de mano para capturar imágenes de cuentas teñidas de azul toluidina. Se debe colocar una regla junto a la placa de Petri que contiene las cuentas antes de adquirir imágenes.</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia con contraste de fase y filtros de fluorescencia adecuados</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>Se utilizaron varios sistemas de microscopía para obtener imágenes de las perlas. Los resultados aquí mostrados se obtuvieron con un microscopio IX81 equipado con filtros de fluorescencia GFP y TRITC. Para capturar cuentas enteras, se utilizaron objetivos de 4X a 20X dependiendo de la velocidad de agitación. Por lo general, las imágenes de manchas vivas/muertas se capturaban con objetivos de 20X a 40X.</td></tr><tr><td>Software de adquisición de imágenes</td><td>Molecular</td><td>Devices Metamorph</td><td>Se puede utilizar una variedad de software de adquisición de imágenes para adquirir imágenes de contraste de fase y fluorescencia.</td></tr><tr><td>Software gratuito de análisis de imágenes</td><td>CellProfiler</td><td>No aplicable</td> Se <td>puede utilizar una variedad de software de análisis de imágenes para identificar cuentas como objetos y analizar el tamaño de las cuentas (por ejemplo, ImageJ).</td></tr></tbody></table>

encapsulación de células de mamífero en perlas de alginato usando un recipiente agitador simple

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

La encapsulación celular en perlas de alginato se ha utilizado para cultivo celular inmovilizado in vitro así como para inmunoisolación in vivo . La encapsulación de islotes pancreáticos se ha estudiado extensamente como un medio para aumentar la supervivencia de los islotes en trasplantes alogénicos o xenogénicos. La encapsulación de alginato se alcanza comúnmente por extrusión de boquillas y gelificación externa. Usando este método, las gotitas de alginato que contienen células formadas en la punta de las boquillas caen en una solución que contiene cationes divalentes que causan gelación ionotrópica de alginato a medida que difunden en las gotitas. El requisito para la formación de gotitas en la punta de la boquilla limita el rendimiento volumétrico y la concentración de alginato que se pueden conseguir. Este video describe un método de emulsificación escalable para encapsular células de mamífero en alginato al 0,5% al ​​10% con una supervivencia celular del 70% al 90%. Mediante este método alternativo, las gotitas de alginato que contienen células y carbonato de calcio se emulsionan en aceite mineral, folPor una disminución del pH que conduce a la liberación interna de calcio ya la gelificación de alginato ionotrópico. El método actual permite la producción de perlas de alginato dentro de los 20 minutos de la emulsificación. El equipo requerido para la etapa de encapsulación consiste en recipientes agitados simples disponibles para la mayoría de los laboratorios.

<html> Al final del proceso de emulsificación y gelificación interna, se debe recuperar un volumen de perlas similar al del alginato inicial y al volumen de la mezcla celular. Las cuentas deben ser muy esféricas con pocos defectos ( Figura 3 ). Las perlas deben ser suficientemente fuertes para soportar la pipeteado a través de pipetas de gran calibre. A altas concentraciones de alginato, se pueden observar gotas de aceite o aire encapsuladas en las perlas. Es...

Este video y el manuscrito describen un método basado en emulsión para encapsular células de mamífero en perlas de alginato al 0,5% al ​​10% que se pueden producir en grandes lotes usando un simple recipiente agitado. Las células encapsuladas pueden cultivarse in vitro o trasplantarse para aplicaciones de terapia celular.

Encapsulación de células de mamífero en perlas de alginato usando un recipiente agitador simple

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

Este video describe un método para inmovilizar células de mamífero, como los islotes pancreáticos, en perlas de alginato utilizando un recipiente simple con agitación. El principio del método consiste en generar gotas de alginato mediante una emulsión de agua y aceite, seguida de la gelificación interna de las gotas de alginato. El primer paso del procedimiento consiste en generar una emulsión en la que una fase acuosa que contiene alginato, células y carbonato de calcio se dispersa en una fase orgánica de aceite mineral.El segundo paso consiste en acidificar la emulsión mediante la adición de un ácido soluble en aceite, como el ácido acético, que se distribuye rápidamente en la fase acuosa. La disminución del pH provoca la disolución del carbonato de calcio y la gelificación interna de las gotas de alginato en perlas. El paso final consiste en recuperar las perlas de la emulsión añadiendo una solución acuosa, separando las fases mediante centrifugación, seguido de lavado y filtración de las perlas.Las células inmovilizadas pueden luego cultivarse in vitro o utilizarse para trasplante. El método que describimos es una alternativa al uso de encapsuladores de células basados en boquillas para generar perlas de alginato. Este método se derivó de un procedimiento para la inmovilización de enzimas y células microbianas, reportado por primera vez por Poncelet y otros en 1992.La aplicación que más nos interesa es la encapsulación con alginato como un medio para aislamiento inmune de células trasplantadas, con el fin de reducir o incluso eliminar la necesidad de fármacos anti-rechazo. Las principales ventajas del proceso basado en emulsión frente a los dispositivos basados en boquillas son su escalabilidad y su robustez. Dado que las gotas se generan casi simultáneamente, se pueden producir cantidades muy grandes de perlas en períodos de tiempo muy cortos, a partir de soluciones de alginato ya sea muy diluidas o muy concentradas.Además, el proceso es muy robusto y no está sujeto a fallos, incluso en presencia de partículas que podrían obstruir las boquillas, y finalmente, el equipo del proceso es bastante sencillo y, por lo tanto, accesible y de bajo costo relativo para la mayoría de los laboratorios. Los pasos clave del proceso son la emulsificación para formar las gotas de alginato y la acidificación para liberar la fuente interna de calcio. El tamaño de las gotas depende principalmente del diseño del impulsor, la velocidad de agitación y la duración de la agitación.Las propiedades mecánicas de las perlas y la supervivencia celular están influenciadas por la magnitud y duración de la acidificación. En este video demostramos un método utilizado para encapsular células en perlas de alginato al 5% para trasplante. Es probable que estos parámetros requieran optimización para otras aplicaciones potenciales.Para generar perlas de alginato al 5 % que contengan una mezcla al cincuenta por ciento de alginatos LVM y MVG, pese 583 miligramos de ácido alginico LVM y 583 miligramos de ácido alginico MVG. Coloque 20 mililitros de tampón de proceso en una placa agitadora magnética. Para aplicaciones de trasplante, utilizamos un tampón HEPES 10 milimolar que contiene 170 milimolar de cloruro de sodio a pH 7,4.Agregue progresivamente el polvo de ácido alginico a la solución. Deje la solución agitando durante la noche a baja velocidad. Si es necesario, sujete el matraz a la placa de agitación.Al día siguiente, si el alginato no está completamente disuelto, sujete el frasco a un mezclador rotatorio y continúe mezclando durante la noche a 37 grados Celsius. Una vez que el alginato esté completamente disuelto, esterilice la solución mediante autoclave durante 30 minutos. Permita que la temperatura descienda por debajo de 50 grados Celsius antes de abrir el autoclave.Prepare la suspensión de carbonato de calcio añadiendo un gramo de carbonato de calcio a 20 mililitros de tampón de proceso. Autoclave la suspensión de carbonato de calcio y el recipiente agitado utilizado para el proceso de emulsión. Antes de usarlo, elimine cualquier rastro de agua condensada del recipiente.Inmediatamente antes del proceso de emulsión, disuelva 44 microlitros de ácido acético glacial en 11 mililitros de aceite mineral colocados en un tubo cónico de 50 mililitros. Un error común es la disolución incompleta del ácido acético; evite pipetear volúmenes menores a 10 microlitros y asegúrese de que el ácido se haya disuelto completamente mediante vortexado repetido. Deje que todas las soluciones alcancen la temperatura ambiente antes de proceder al encapsulado celular.Coloque 10 mililitros de aceite mineral en el matraz agitador y comience a agitar a 250 RPM. Si se utilizan células adherentes, como las células beta-tc3, realice la tripsinización de las células. Detenga la reacción añadiendo medio completo y tome una muestra para la enumeración celular.Determine la concentración celular manualmente o con un contador celular automatizado. Centrifugue las células durante siete minutos a 300 g y luego resuspenda el pellet celular en medio completo. Repita el paso de centrifugación y luego resuspenda las células en el volumen apropiado de medio completo para obtener 10 y 1/2 veces la concentración final deseada en las perlas.Transfiera 9,9 mililitros de solución de alginato a un tubo de fondo plano, luego agregue 1,1 mililitro del stock celular y 550 microlitros de la suspensión de carbonato de calcio. Mezcle el alginato, la suspensión de carbonato de calcio y la suspensión celular mediante vortex suave. Transfiera inmediatamente 10,5 mililitros de esta mezcla al aceite agitado utilizando una jeringa.Aumente la velocidad de agitación y luego inicie el cronómetro. Para determinar la velocidad de agitación, primero se debe generar una curva estándar que relacione el tamaño de las perlas con la velocidad de agitación. Después de 12 minutos, agregue 10 mililitros de la solución de aceite y ácido acético para acidificar la emulsión, liberar el calcio del carbonato y obtener perlas gelificadas.Permita ocho minutos para este paso de gelificación interna. Observe el cambio de color en las gotas emulsionadas que contienen el indicador de pH rojo de fenol. Reduzca la velocidad de agitación a 400 RPM y neutralice el ácido añadiendo 40 mililitros de tampón de proceso mezclado con medio al 10 %, lo que provoca la inversión de fase.Detenga la agitación un minuto después y transfiera la mezcla a tubos cónicos. Enjuague el matraz agitador con un adicional de 20 mililitros de medio y añada esto a los tubos. Aspire tanta solución acuosa como sea posible antes de aspirar la fase oleosa.Centrifugar los tubos durante tres minutos a 630 g para acelerar la sedimentación de las perlas y la separación de fases. Eliminar el aceite y el exceso de tampón de proceso aspirando con una pipeta Pasteur. Lavar las perlas al menos una vez con medio utilizando centrifugación a 630 g entre cada lavado.Filtre la suspensión de perlas en filtros de nylon de 40 micrones y aspire el exceso de líquido del filtro desde abajo. Transfiera las perlas a un volumen conocido de medio utilizando una espátula. Mida el volumen de perlas y complete con medio hasta alcanzar la concentración deseada de perlas.Una concentración típica es un mililitro de perlas por cinco mililitros de volumen total. A partir de este momento, manipule siempre las perlas con pipetas de gran orificio para evitar dañarlas. Las células encapsuladas ya pueden transferirse a frascos tipo T y utilizarse para cultivo in vitro o trasplante.Al final del proceso de emulsión, se deben obtener perlas de alginato que contengan células inmovilizadas. Después del proceso, se debe evaluar rutinariamente la distribución del tamaño de las perlas y la supervivencia celular. Para determinar la distribución del tamaño de las perlas, estas pueden teñirse con azul de toluidina, seguido de un análisis de imagen.Se espera una distribución amplia del tamaño de las perlas tras este proceso. Para evaluar la supervivencia celular, las perlas pueden incubarse con coloraciones de viabilidad, como calceína-AM y etidio homodímero. Utilizando el proceso descrito en este video, se midió un 76 % de supervivencia de células beta-tc3.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inmovilizar células de mamífero en perlas de alginato utilizando un sistema sencillo con agitación. El protocolo básico mostrado en este video debería ser adecuado para inmovilizar una variedad de tipos celulares utilizando una amplia gama de tipos de alginato y concentraciones. Recomendamos generar una curva estándar que relacione el tamaño promedio de las perlas con la velocidad de agitación para cada nuevo lote de alginato o aceite.El proceso de emulsificación que hemos descrito es una alternativa prometedora frente a los encapsuladores celulares basados en boquillas. Es un método robusto y sencillo para inmovilizar células de mamífero en perlas de alginato. A medida que nosotros y otros investigadores en todo el mundo desarrollamos terapias celulares con boquillas, se necesitarán métodos a esta escala para los muchos miles de pacientes diabéticos.Hemos publicado resultados prometedores del trasplante de una línea de células beta en microperlas de alginato al 5%, y continuamos explorando el rendimiento in vivo de esta barrera mejorada frente al rechazo del trasplante.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se presentan los protocolos de 3 dimensiones (3D) en la encapsulación de células dentro de los hidrogeles sintéticos. El procedimiento de encapsulación, se destaca por dos métodos utilizados para el entrecruzamiento (michael-tipo y además iniciada por la luz los mecanismos de los radicales libres), así como una serie de técnicas para evaluar el comportamiento de células encapsuladas.

La encapsulación celular en hidrogeles 3D para ingeniería de tejidos

En las secciones siguientes, se describen procedimientos para la preparación de microesferas de alginato para su uso en aplicaciones biomédicas. En especial, ilustran una técnica para la creación de múltiples capas de alginato microesferas para el doble propósito de la celda y la encapsulación de proteínas como un posible tratamiento para la diabetes tipo 1.

Generación de microesferas de alginato para aplicaciones biomédicas

Este video muestra un método para fabricar microperlas de polímero que encapsulan células neurotóxicas secretoras de beta amiloide. La suspensión de célula y polímero se procesa a través de un dispositivo de fabricación de microperlas, con la gelificación del polímero lograda mediante reticulación de calcio, formando microperlas esféricas alrededor de las células. El polímero permite la proliferación celular a la vez que permite la liberación controlada y a largo plazo de beta amiloide,...

Fabricación de microesferas de polímero liberadoras de beta-amiloide para modelar la enfermedad de Alzheimer

Aquí, presentamos un protocolo para la encapsulación de células catabólicas, que consumen lípidos para la producción de calor en el tejido adiposo intraabdominal y aumentan la disipación de energía en ratones obesos.

La encapsulación termogénico preadipocitos para el trasplante en los depósitos de tejido adiposo

Establecimos un método para encapsular células madre pluripotentes (células PS) en cápsulas de hidrogel de alginato utilizando una boquilla coaxial.  Esto evita que las células se agreguen excesivamente y limita el esfuerzo cortante experimentado por las células en cultivo en suspensión.  La técnica es aplicable a la producción masiva de células PS, así como a la investigación sobre el nicho de células madre.

La encapsulación de alginato de células madre pluripotentes utilizando una boquilla-Co axial

Se presenta el protocolo para biocatalizadores de células completas co-inmovilización para la regeneración de cofactor y la mejora de la reutilización, usando la producción de L-xilulosa como un ejemplo. La regeneración del cofactor se consigue mediante el acoplamiento de dos cepas de Escherichia coli que expresa las enzimas funcionalmente complementarios; la inmovilización biocatalizador de célula completa se consigue mediante encapsulación de células en perlas de alginato de calcio.

La inmovilización de Multi-biocatalizadores en perlas de alginato de cofactor de Regeneración y Reutilización mejorada

La ingeniería y el análisis de tejidos portadores de carga con poblaciones celulares heterogéneas siguen siendo un desafío. Aquí, describimos un método para crear discos de hidrogel de alginato de dos capas como plataforma para el cocultivo de diversas poblaciones celulares dentro de una construcción.

Las construcciones en capas de alginato: Una plataforma para el co-cultivo de poblaciones celulares heterogéneas

Este protocolo ilustra un método de encapsulación celular mediante la gelación física rápida de alginato para inmovilizar las células. Los microperlas obtenidos permiten la secreción controlada y sostenida de amiloide a lo largo del tiempo y se pueden utilizar para estudiar los efectos de los amiloides secretos en modelos in vitro e in vivo.

Fabricación de Microperlas de Alginato Secreto de Amiloide para su uso en el modelado de la enfermedad de Alzheimer

Aquí se presenta un protocolo para el uso del alginato como polímero en la microencapsulación de células inmortalizadas para la entrega a largo plazo de productos biológicos a ojos de roedores.

Tecnología celular encapsulada para la entrega de productos biológicos al ojo del ratón

Aquí se presentan dos protocolos para la encapsulación de ovocitos porcinos en condiciones de cultivo 3D. En el primero, los complejos cúmulos-oocitos (COC) se encapsulan en perlas de fibrina-alginato. En el segundo, se encierran con partículas fluoradas de etileno propileno propileno (microbiorreos). Ambos sistemas garantizan condiciones óptimas para mantener su organización 3D.

Hidrogeles de Alginato degradados proteolíticamente y microbiorreactores hidrófobos para encapsulación de oocitos porcinos

Aprende a encapsular células de mamífero en perlas de alginato mediante emulsión en agua y aceite con gelación interna usando carbonato de calcio. Este método escalable permite aplicaciones en terapia celular y cultivo in vitro.

Encapsulación de células de mamífero en perlas de alginato usando un recipiente agitador simple

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