Encapsulación de células de mamífero en perlas de alginato usando un recipiente agitador simple

Este video describe un método para inmovilizar células de mamíferos, como islotes pancreáticos en perlas de alginato, utilizando un simple recipiente agitado. El principio del método es generar gotas de alginato por emulsión de agua y aceite, seguido de la gelificación interna de las gotas de alginato. El primer paso del procedimiento consiste en generar una emulsión en la que una fase acuosa que contiene células de alginato y carbonato de calcio se dispersa en una fase orgánica de aceite mineral.

El segundo paso es acidificar la emulsión mediante la adición de un ácido soluble en aceite, como el ácido acético, que se divide rápidamente en la fase acuosa. La caída del pH conduce a la disolución del carbonato de calcio y a la gelificación interna de las gotas de alginato en perlas. El paso final consiste en recuperar las perlas de la emulsión mediante la adición de una solución acuosa, la separación de las fases por centrifugación, seguida del lavado y filtrado de las perlas.

A continuación, las células inmovilizadas pueden cultivarse in vitro o utilizarse para trasplantes. El método que describimos es una alternativa al uso de encapsuladores celulares basados en boquillas para generar perlas de alginato. Esto se derivó de un método para la inmovilización de enzimas y células microbianas, reportado por primera vez por Poncelet y otros en 1992.

La aplicación que más nos interesa es la encapsulación de alginato como medio para inmunoaislar las células trasplantadas, con el fin de reducir o incluso eliminar la necesidad de fármacos antirrechazo. Las principales ventajas del proceso basado en emulsión sobre los dispositivos basados en boquillas son su escalabilidad y su robustez. Dado que las gotas se generan casi simultáneamente, se pueden producir grandes cantidades de perlas en períodos de tiempo muy cortos, a partir de soluciones de alginato muy diluidas o muy concentradas.

Además, el proceso es muy robusto y no es propenso a fallos, e incluso en presencia de partículas que podrían obstruir las boquillas, y finalmente el equipo de proceso es bastante simple y, por lo tanto, es accesible, de muy bajo costo para la mayoría de los laboratorios. Los pasos clave del procesamiento son la emulsificación para formar las gotas de alginato y la acidificación para liberar la fuente interna de calcio. El tamaño de las gotas está influenciado principalmente por el diseño del impulsor, la velocidad de agitación y la duración de la agitación.

Las propiedades mecánicas de las perlas y la supervivencia celular están influenciadas por el grado y la duración de la acidificación. En este video demostramos un método utilizado para encapsular células en perlas de alginato al 5% para trasplantes. Es probable que estos parámetros requieran optimización para otras aplicaciones potenciales.

Para generar perlas de alginato al 5% que contengan una mezcla mitad y mitad de alginatos LVM y MVG, pese 583 miligramos de LVM y 583 miligramos de ácido algínico MVG en polvo. Coloque 20 mililitros de tampón de proceso en una placa de agitación magnética. Para aplicaciones de trasplante, utilizamos un tampón HEPES de 10 milimolares que contiene cloruro de sodio de 170 milimolares a pH 7,4.

Añadir progresivamente el ácido algínico en polvo a la solución. Deje la solución revolviendo durante la noche a baja velocidad. Si es necesario, fije el matraz a la placa de agitación.

Al día siguiente, si el alginato se disuelve incompletamente, fije el frasco en una batidora rotativa y continúe mezclando durante la noche a 37 grados centígrados. Una vez que el alginato esté completamente disuelto, esterilice la solución esterilizándola en autoclave durante 30 minutos. Deje que la temperatura caiga por debajo de los 50 grados centígrados antes de abrir el autoclave.

Prepare la suspensión de carbonato de calcio agregando un gramo de carbonato de calcio a un tampón de proceso de 20 mililitros. Autoclave la suspensión de carbonato cálcico y el recipiente agitado utilizado para el proceso de emulsión. Antes de usar, elimine cualquier rastro de agua condensada del recipiente.

Inmediatamente antes del proceso de emulsión, disuelva 44 microlitros de ácido acético glacial en aceite mineral de 11 mililitros colocado en un tubo cónico de 50 mililitros. Un error común es la disolución incompleta del ácido acético, evite pipetear cantidades inferiores a 10 microlitros y asegúrese de que el ácido se disuelva por completo mediante vórtices repetidos. Deje que todas las soluciones alcancen la temperatura ambiente antes de proceder a la encapsulación de la celda.

Coloque 10 mililitros de aceite mineral en el matraz giratorio y comience a remover a 250 RPM. Si se utilizan células adherentes como las células beta-tc3, se tripsinizan las células. Finalice la reacción agregando medio completo y tome una muestra para la enumeración de celdas.

Determine la concentración de células manualmente o con un contador de células automatizado. Centrifugar las celdas durante siete minutos a 300 g y luego resuspender la paleta de celdas en medio completo. Repita el paso de centrifugación y luego vuelva a suspender las células en el volumen apropiado de medio completo para obtener 10 y 1/2 veces la concentración final deseada en las perlas.

Transfiera la solución de alginato de 9,9 mililitros a un tubo de fondo plano, luego agregue 1,1 mililitros del material celular y 550 microlitros de la suspensión de carbonato de calcio. Mezclar el alginato, el carbonato cálcico y la suspensión celular mediante un suave vórtice. Transfiera inmediatamente 10,5 mililitros de esta mezcla al aceite agitador con una jeringa.

Aumente la velocidad de agitación y luego inicie el temporizador. Para determinar la velocidad de agitación, primero se debe generar una curva estándar que relacione el tamaño del cordón con la velocidad de agitación. Después de 12 minutos, agregue 10 mililitros de la solución de aceite y ácido acético para acidificar la emulsión, liberar el calcio del carbonato y obtener perlas gelificadas.

Espere ocho minutos para este paso de gelificación interna. Observe el cambio de color de las gotas emulsionadas que contienen el indicador de pH rojo fenol. Reduzca la tasa de agitación a 400 RPM, neutralice el ácido agregando 40 mililitros de tampón de proceso mezclado con un 10% de medio, lo que conduce a la inversión de fase.

Detenga la agitación un minuto después y transfiera la mezcla a tubos cónicos. Enjuague el matraz giratorio con 20 mililitros adicionales de medio y agréguelo a los tubos. Aspire la mayor cantidad posible de solución acuosa antes de aspirar la fase oleosa.

Centrifugar los tubos durante tres minutos a 630 g para acelerar la sedimentación del cordón y la separación de fases. Elimine el aceite y el exceso de tampón de proceso aspirando con una pipeta Pasteur. Lave las perlas al menos una vez con medio utilizando una centrifugación de 630 g entre lavados.

Filtre la suspensión de perlas en filtros de células de nailon de 40 micras y aspire el exceso de líquido en el filtro desde abajo. Transfiera las cuentas a un volumen conocido de medio con una espátula. Mida el volumen del cordón y rellene el medio para obtener la concentración deseada del cordón.

Una concentración típica es de un mililitro de perlas por cada cinco mililitros de volumen total. A partir de este momento, manipule siempre las perlas con pipetas de gran diámetro para evitar dañarlas. Las células encapsuladas ahora pueden transferirse a matraces T y utilizarse para cultivo in vitro o trasplante.

Al final del proceso de emulsión, se deben obtener perlas de alginato que contengan células inmovilizadas. Después del proceso, la distribución del tamaño de las perlas y la supervivencia de las células deben evaluarse de forma rutinaria. Para determinar la distribución del tamaño de las cuentas, las cuentas se pueden teñir con azul de toluidina, seguido de un análisis de imagen.

A partir de este proceso se espera una amplia distribución del tamaño de las cuentas. Para evaluar la supervivencia celular, las perlas se pueden incubar con tinciones de muertos vivos, como calceína-AM y homodímero de etidio. Utilizando el proceso descrito en este vídeo, se midió la supervivencia de las células beta-tc3 en un 76%.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inmovilizar células de mamíferos en perlas de alginato utilizando un simple sistema agitado. El protocolo básico que se muestra en este video debería ser adecuado para inmovilizar una variedad de tipos de células utilizando una amplia gama de tipos de alginato y calcitraciones. Recomendamos generar una curva estándar que relacione el tamaño promedio del cordón con la velocidad de agitación con cada nuevo lote de alginato o aceite.

El proceso de emulsificación que hemos descrito es una alternativa prometedora a los encapsuladores de celdas basados en boquillas. Es un método robusto y sencillo para inmovilizar células de mamíferos en perlas de alginato. A medida que nosotros y otros en todo el mundo desarrollemos terapias con células de boquilla, se necesitará tal escala de métodos para los muchos miles de pacientes diabéticos.

Hemos publicado resultados prometedores del trasplante de una línea de células beta en perlas de alginato al 5%, y continuamos explorando el rendimiento in vivo de esta barrera mejorada contra el rechazo del trasplante.