Evaluación longitudinal de ratón posteriores pérdida de masa ósea del miembro después de una lesión de la médula espinal utilizando Novel, En vivo Metodología

Un examen longitudinal de la pérdida ósea en los fémures y tibias de ratones adultos se llevó a cabo después de una lesión de la médula espinal utilizando secuencial de dosis baja de rayos X de los análisis. La pérdida de hueso tibia se detectó durante todo el estudio, mientras que la pérdida ósea en el fémur no se detectó hasta 40 días después de la lesión.

Este procedimiento demuestra un método novedoso que se utiliza para detectar y cuantificar la pérdida dependiente del tiempo de la densidad ósea de las extremidades traseras en el ratón después de una lesión de la médula espinal. Esto se logra realizando primero una lesión de transección espinal en un ratón anestesiado en condiciones estériles y aprobadas por alac. Luego, después de un período de recuperación, se vuelve a anestesiar al animal y se obtienen imágenes radiográficas de la tibia y el fibio de las extremidades traseras derecha e izquierda.

Esto se realiza semanalmente hasta 40 días después de la lesión. A continuación, se realiza un análisis de imagen de las radiografías. El paso final es realizar una evaluación post-mortem de la densidad ósea en los huesos de las extremidades posteriores extirpados.

En última instancia, los resultados muestran cómo la lesión de la médula espinal induce una pérdida rápida y progresiva de la densidad ósea en las extremidades traseras del ratón. Este novedoso método proporciona una fuerte resolución espacial y temporal utilizando dosis más bajas de rayos X que las empleadas por otras modalidades de imagen. La osteoporosis es una afección potencialmente mortal que afecta a quienes viven con una lesión de la médula espinal.

Lo que estamos proponiendo es un método novedoso para ser utilizado en estudios con animales de lesión medular que permite a un investigador seguir longitudinalmente durante largos períodos de tiempo, la pérdida de hueso asociada a la osteoporosis. Esto es importante por dos razones. En primer lugar, esto proporcionará una oportunidad para estudiar los mecanismos que dan forma al desarrollo de la osteoporosis.

La segunda es que nos proporciona una forma de probar nuevas intervenciones diseñadas para prevenir o tal vez revertir el desarrollo de la osteoporosis en pacientes que viven con una lesión de la médula espinal. Aunque este método puede proporcionar información sobre la osteoporosis inducida por lesiones de la médula espinal, también se puede aplicar a otros sistemas, como la pérdida ósea relacionada con la edad que ocurre en mujeres posmenopáusicas, así como otras reducciones inducidas por traumatismos en la densidad ósea. La aplicación de imágenes de rayos X longitudinales de baja dosis de animales enteros puede proporcionar nuevas vías para el desarrollo de terapias diseñadas para minimizar o prevenir estos problemas.

Realice la cirugía de lesión de la médula espinal de acuerdo con los procedimientos de la lijadora y de acuerdo con las pautas del comité institucional local de cuidado y uso de animales. Luego, comenzando el día 10, después de la cirugía de la médula espinal y continuando a intervalos de 10 días hasta el día 40. Evalúe los fémures y tibias derecho e izquierdo de animales vivos con lesiones de la médula espinal por transección anestesiados y controles de coincidencia envejecidos no lesionados mediante el escaneo con el sistema ivus Lumina XR antes de escanear, inicialice el dispositivo Lumina XR para permitir que la cámara interna alcance la temperatura operativa de menos 90 grados Celsius.

Coloque un animal anestesiado en la plataforma dentro del Lumina xr. A continuación, inserte una lente de gran aumento para permitir el enfoque tanto en el fémur como en la región tibial. Compruebe que el sujeto esté colocado correctamente en el campo de visión.

Si es necesario, abra la puerta y vuelva a colocar al animal. Aquí se muestra la posición correcta del animal. Una vez colocada correctamente, se puede ejecutar la función de rayos X.

Haga una selección de la lista desplegable de energía adecuada para animales. A continuación, abra el panel de control. Habilite la función de rayos X marcando la casilla de rayos X y adquiera la imagen de rayos X.

Todo el fémur y la tibia deben ser visibles como se ve aquí. Dado que el software de imagen viva muestra imágenes de rayos X transformadas de forma predeterminada, asegúrese de que se muestren las imágenes de rayos X sin procesar ingresando al menú de herramientas de filtrado de correcciones y quitando la marca de verificación junto a la absorción de rayos X. Los datos de imagen sin procesar se guardan automáticamente en el disco duro.

También se guardan los archivos TIFF representativos. Después de la toma de imágenes, el ratón se devuelve a su jaula de origen y se le permite recuperarse bajo la observación del investigador. A continuación, el proceso se repite con el siguiente ratón.

Primero, abra el software haciendo doble clic en el icono de la imagen viva en el cuadro de diálogo que aparece. Seleccione la carpeta que le interese y haga clic en Aceptar. Cargue una imagen de rayos X haciendo clic en el botón Examinar.

El explorador de imágenes vivas muestra los datos seleccionados junto con el ID de usuario. Información de la etiqueta e información de configuración de la cámara Para abrir los datos, haga doble clic en la fila de datos. Se muestran la imagen y la paleta de herramientas.

Los datos abiertos se resaltan en azul en el navegador. A continuación, haga clic en Herramientas de ROI. En la paleta de herramientas de las herramientas de ROI, abra la lista desplegable de tipo y seleccione ROI de medición.

Para cargar los tres ROI utilizados en este experimento, haga clic en el icono cuadrado y cargue cuadrados. Con una regla, mida la longitud del fémur, ajuste la longitud de los dos cuadrados para que sea un octavo de la longitud total del fémur. Ajusta el ancho de los cuadrados para que sea una vigésima parte de la longitud total del fémur.

Ahora, con la regla, mide un octavo de la distancia desde el extremo proximal del fémur y sitúa un rectángulo de modo que quede centrado en esa posición. Mueva el segundo rectángulo al extremo distal del fémur y colóquelo de modo que quede centrado dentro de la región trabecular de la rodilla. Luego mida la longitud de la tibia.

Ajuste la longitud de la caja a un octavo de la longitud total de la tibia. Ajuste el ancho a una 30ª parte de la longitud total de la tibia. Finalmente, coloque la caja de manera que quede centrada, y un octavo de la distancia de la longitud total de la tibia desde la tibia proximal termina como se ve aquí.

A continuación, haga clic en el icono de medida, las mediciones de intensidad de ROI aparecen en la imagen de rayos X y aparece la tabla de mediciones de ROI. Exporte esta tabla a la ubicación deseada como un archivo CSV de puntos. Esto permitirá que la tabla se abra usando Excel.

Repita este paso con todas las imágenes guardadas para analizar. Finalmente, consolide todos los datos en una hoja de Excel. La significación estadística se determina mediante la prueba T de un estudiante utilizando software como Microsoft Excel o el software Sigma Plot 11.0 si se desea, los resultados se pueden comparar con los obtenidos del análisis postmortem de la densidad ósea utilizando geometría de absorción de rayos X de energía dual utilizando protocolos estándar para este método.

La pérdida relativa de densidad ósea de un ratón, tibia y fémur después de una lesión de la médula espinal en comparación con los ratones ingenuos es detectable utilizando el método anterior. Esta figura muestra la pérdida de densidad ósea después de una lesión medular en la tibia proximal, 10, 20, 30 y 40 días después de la lesión. En comparación con los ingenuos de la misma edad, hay una disminución significativa del 12% en la densidad ósea de la tibia después de solo 10 días con una pérdida de densidad ósea de hasta el 15% a los 40 días.

Aquí vemos la pérdida de densidad ósea después de una lesión medular en el fémur proximal, 10, 20, 30 y 40 días después de la lesión. En comparación con los ingenuos de la misma edad, se observó una disminución del 7% en la pérdida de densidad ósea en el fémur proximal a los 40 días después de la lesión. Este gráfico muestra la pérdida de densidad ósea después de una lesión de la médula espinal en el fémur distal 10, 20, 30 y 40 días después de la lesión.

En comparación con los controles naïve emparejados de edad avanzada, la pérdida de densidad ósea en el fémur distal se pudo observar tan pronto como 10 días después de la lesión y se mantuvo durante el resto del experimento. Esta imagen representativa de los datos de geometría abor de rayos X de energía dual muestra el contenido mineral óseo y la producción de densidad mineral ósea. El fémur extirpado se analizó a los 40 días de la lesión medular.

Para comparar la eficacia del método demostrado en este protocolo con otros métodos disponibles actualmente, esta figura muestra el análisis de la geometría de rayos X de doble energía del contenido mineral óseo en gramos en el fémur de la lesión medular. Los ratones 40 días después de la cirugía frente a la edad coinciden con los ingenuos. Se observó una pérdida significativa del 12% del contenido mineral óseo en los ratones con lesión medular en comparación con los que no lo habían aprendido.

Aquí vemos un análisis de geometría de doble energía, extra abor de la densidad mineral ósea en miligramos, centímetro cuadrado en el fémur de la médula espinal en la lesión, ratones 40 días después de la lesión frente a ratones H que coinciden con ratones naif. La pérdida de densidad mineral ósea no cambió significativamente, pero siguió una tendencia similar al contenido mineral óseo una vez dominado. Esto se puede lograr en 20 a 30 minutos, pero recuerde que es importante colocar las extremidades traseras correctamente.

Después de ver este vídeo, debería tener una idea de cómo realizar una evaluación longitudinal de la densidad ósea en animales vivos después de una lesión de la médula espinal utilizando el dispositivo Lumina XR de Caliper Instruments.