Evaluación longitudinal de ratón posteriores pérdida de masa ósea del miembro después de una lesión de la médula espinal utilizando Novel, En vivo Metodología

Este procedimiento demuestra un método novedoso utilizado para detectar y cuantificar la pérdida dependiente del tiempo de la densidad ósea de las extremidades posteriores en el ratón tras una lesión de la médula espinal. Esto se logra primero realizando una lesión por transección espinal en un ratón anestesiado bajo condiciones estériles y aprobadas por el comité de ética animal. Luego, tras un período de recuperación, el animal se vuelve a anestesiar y se obtienen imágenes de rayos X de la tibia y la fíbula de ambas extremidades posteriores, derecha e izquierda.

Esto se realiza semanalmente hasta los 40 días posteriores a la lesión. A continuación, se lleva a cabo un análisis de imagen de las radiografías. El paso final consiste en realizar una evaluación post mortem de la densidad ósea en los huesos de las extremidades traseras extirpados.

En última instancia, los resultados muestran cómo la lesión de la médula espinal induce una pérdida rápida y progresiva de la densidad ósea en las extremidades traseras del ratón. Este nuevo método proporciona una alta resolución espacial y temporal utilizando dosis más bajas de rayos X que las empleadas por otras modalidades de imagen. La osteoporosis es una afección potencialmente mortal que afecta a las personas que viven con lesión de la médula espinal.

Lo que proponemos es un método novedoso que puede utilizarse en estudios con animales sobre lesión de la médula espinal, el cual permite a un investigador seguir longitudinalmente, durante largos períodos de tiempo, la pérdida ósea asociada con la osteoporosis. Esto es importante por dos razones. Primero, esto brindará la oportunidad de estudiar los mecanismos que determinan el desarrollo de la osteoporosis.

La segunda es que nos proporciona un método para probar nuevas intervenciones diseñadas para prevenir o tal vez revertir el desarrollo de osteoporosis en pacientes que viven con lesión de la médula espinal. Aunque este método puede ofrecer información sobre la osteoporosis inducida por lesión de la médula espinal, también puede aplicarse a otros sistemas, como la pérdida ósea relacionada con la edad que ocurre en mujeres posmenopáusicas, así como a otras reducciones de densidad ósea inducidas por traumatismos. La inmovilización de extremidades resultante de aislamiento, tras fractura u otro daño puede provocar una pérdida ósea sustancial durante el proceso de curación. La aplicación de imágenes longitudinales de rayos X de baja dosis en animales completos podría abrir nuevas vías para el desarrollo de terapias diseñadas para minimizar o prevenir estos problemas.

Realice la cirugía de lesión de la médula espinal según los procedimientos de sander y de acuerdo con las directrices del comité institucional local de cuidado y uso de animales. Luego, a partir del día 10 después de la cirugía de la médula espinal y continuando a intervalos de 10 días hasta el día 40, evalúe los fémures y tibias derechos e izquierdos de animales vivos anestesiados con lesión medular por transección y controles no lesionados emparejados por edad mediante escaneo utilizando el sistema ivus Lumina XR. Antes del escaneo, inicialice el dispositivo Lumina XR para permitir que la cámara interna alcance la temperatura operativa de menos 90 grados Celsius.

Coloque un animal anestesiado sobre la plataforma dentro del Lumina xr. Luego, inserte una lente de alta magnificación para permitir el enfoque tanto en las regiones del fémur como de la tibia. Verifique que el sujeto esté correctamente posicionado en el campo de visión.

Si es necesario, abra la puerta y reposicione al animal. Aquí se muestra la posición adecuada del animal. Una vez que esté correctamente posicionado, se puede ejecutar la función de rayos X.

Realice una selección en la lista desplegable de energía adecuada para el animal. Luego, abra el panel de control. Active la función de rayos X marcando la casilla de rayos X y adquiera la imagen de rayos X.

Se debe ver todo el fémur y la tibia, como se muestra aquí. Dado que el software de imagen en vivo muestra imágenes de rayos X transformadas por defecto, asegúrese de que se muestren las imágenes de rayos X originales ingresando al menú de herramientas de filtrado de correcciones y eliminando la marca de verificación junto a absorción de rayos X. Los datos de la imagen original se guardan automáticamente en el disco duro.

También se guardan archivos TIFF representativos. Después del análisis de imágenes, el ratón se devuelve a su jaula de alojamiento y se le permite recuperarse bajo la observación del investigador. A continuación, se repite el proceso con el siguiente ratón.

Primero, abra el software haciendo doble clic en el icono de imagen viva en el cuadro de diálogo que aparece. Seleccione la carpeta de interés y haga clic en aceptar. Cargue una imagen de rayos X haciendo clic en el botón de exploración.

El navegador de imágenes en vivo muestra los datos seleccionados junto con el identificador del usuario. Información de etiquetas e información de configuración de la cámara. Para abrir los datos, haga doble clic en la fila de datos. Se muestran la imagen y la paleta de herramientas.

Los datos abiertos se resaltan en azul en el navegador. A continuación, haga clic en las herramientas de ROI. En la paleta de herramientas de ROI, abra la lista desplegable de tipo y seleccione ROI de medición.

Para cargar las tres ROI utilizadas en este experimento, haga clic en el icono cuadrado y cargue los cuadrados. Utilizando una regla, mida la longitud del fémur y ajuste la longitud de los dos cuadrados para que sea un octavo de la longitud total del fémur. Ajuste el ancho de los cuadrados para que sea un veinticuatroavo de la longitud total del fémur.

Ahora, con la regla, mida una octava parte de la distancia desde el extremo proximal del fémur y coloque un rectángulo de modo que quede centrado en esa posición. Desplace el segundo rectángulo hacia el extremo distal del fémur y colóquelo de forma que quede centrado dentro de la región trabecular de la rodilla. Luego, mida la longitud de la tibia.

Ajuste la longitud del cuadro a un octavo de la longitud total de la tibia. Ajuste el ancho a un treintavo de la longitud total de la tibia. Finalmente, coloque el cuadro de manera que quede centrado y a una distancia de un octavo de la longitud total de la tibia desde el extremo proximal de la tibia, como se muestra aquí.

A continuación, haga clic en el icono de medición; las mediciones de intensidad de la región de interés aparecen en la imagen de rayos X y aparece la tabla de mediciones de la región de interés. Exporte esta tabla a la ubicación deseada como un archivo CSV. Esto permitirá abrir la tabla utilizando Excel.

Repita este paso con todas las imágenes guardadas que se van a analizar. Finalmente, consolide todos los datos en una sola hoja de cálculo de Excel. La significancia estadística se determina mediante una prueba T de Student utilizando software como Microsoft Excel o Sigma Plot 11.0. Si se desea, los resultados pueden compararse con los obtenidos del análisis post mortem de la densidad ósea mediante absorciometría de rayos X de energía dual, utilizando protocolos estándar para este método.

La pérdida relativa de densidad ósea en un ratón, tibia y fémur tras una lesión de la médula espinal, en comparación con ratones no tratados, es detectable mediante el método descrito anteriormente. Esta figura muestra la pérdida de densidad ósea tras una lesión de la médula espinal en la tibia proximal, a los 10, 20, 30 y 40 días posteriores a la lesión. En comparación con controles jóvenes no tratados, existe una disminución significativa del 12 % en la densidad ósea de la tibia ya a los 10 días, con una pérdida de hasta el 15 % a los 40 días.

Aquí observamos la pérdida de densidad ósea tras una lesión de la médula espinal en el fémur proximal, a los 10, 20, 30 y 40 días posteriores a la lesión. En comparación con controles jóvenes no entrenados, se observó una disminución del 7 % en la densidad ósea del fémur proximal a los 40 días posteriores a la lesión. Este gráfico muestra la pérdida de densidad ósea tras una lesión de la médula espinal en el fémur distal a los 10, 20, 30 y 40 días después de la lesión.

En comparación con controles ingenuos de edad similar, se pudo observar pérdida de densidad ósea en el fémur distal tan pronto como 10 días después de la lesión, y esta se mantuvo durante el resto del experimento. Esta imagen representativa de datos de absorciometría de rayos X de doble energía muestra el contenido mineral óseo y los resultados de densidad mineral ósea. Los fémures extraídos se analizaron 40 días después de la lesión medular.

Para comparar la eficacia del método demostrado en este protocolo con otros métodos actualmente disponibles, esta figura muestra el análisis de geometría por absorciometría de rayos X de energía dual del contenido mineral óseo en gramos en el fémur de ratones con lesión de la médula espinal, 40 días después de la cirugía, en comparación con controles sanos de edad equivalente. Se observó una pérdida significativa del 12 % en el contenido mineral óseo en los ratones con lesión de la médula espinal en comparación con los controles sanos.

Aquí observamos el análisis de geometría de doble energía y del hueso cortical de la densidad mineral ósea en miligramos por centímetro cuadrado en el fémur de ratones con lesión de la médula espinal a los 40 días posteriores a la lesión, en comparación con ratones ingenuos emparejados según peso. La pérdida de densidad mineral ósea no cambió significativamente, pero siguió una tendencia similar al contenido mineral óseo. Una vez dominado, este procedimiento podría realizarse en 20 a 30 minutos, pero recuerde que es importante posicionar adecuadamente las extremidades traseras.

Después de observar este video, debería tener una idea de cómo realizar una evaluación longitudinal en animales vivos de la densidad ósea tras una lesión de la médula espinal utilizando el dispositivo Caliper Instruments Lumina XR.