Inducción y diversos indicadores de evaluación de la encefalomielitis autoinmune experimental

El presente protocolo describe la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón utilizando glicoproteína oligodendrocitos de mielina y monitoreando el proceso de la enfermedad utilizando un sistema de puntuación clínica. Los síntomas experimentales relacionados con la encefalomielitis autoinmune se analizan mediante análisis de tomografía microcomputarizada de fémur de ratón y prueba de campo abierto para evaluar el proceso de la enfermedad de manera integral.

Actualmente no existe una cura completa para la esclerosis múltiple. Nuestro protocolo permite la construcción efectiva de un modelo experimental de encefalomielitis autoinmune para ayudar a explorar terapias para la enfermedad de la esclerosis múltiple. La principal ventaja de nuestro protocolo es una evaluación más completa del tratamiento de la encefalomielitis autoinmune experimental desde múltiples perspectivas.

Primero preparar la emulsión peptídica de glicoproteína oligodendrocitos de mielina disolviendo el péptido liofilizado y el PBS estéril preenfriado sin iones de calcio y magnesio a pH 7.4. Agregue una bola de acero esterilizada de cinco milímetros a un tubo de microcentrífuga limpio de dos mililitros. Luego agregue 500 microlitros de adyuvante completo de Freuds que contiene cinco miligramos por mililitro de microbacteria tuberculosis liofilizada y 500 microlitros de la emulsión peptídica de glicoproteína oligodendrocitos de mielina al tubo.

Ahora oscile el tubo en un lisor de tejido durante 10 minutos. Luego enfríe los tubos en hielo durante 10 minutos. Repita el proceso cuatro veces hasta que se forme una solución viscosa blanca.

A continuación, diluya la solución de tallo de toxina pertussis 50 veces en PBS estéril de pH 7.4 sin iones de calcio y magnesio para lograr una concentración final de 200 nanogramos por 100 microlitros. Para precipitar toda la emulsión peptídica de glicoproteína oligodendrocitos de mielina preparada inicialmente en el fondo del tubo, centrifugar el tubo a cuatro grados Celsius durante dos o tres segundos, presionando el botón de pulso en el equipo. Aspire la emulsión peptídica de glicoproteína oligodendrocitos de mielina con una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 22 y transfiera la emulsión a un nuevo barril de jeringa de 1 mililitro.

Fije una aguja de calibre 26 al barril y asegure la conexión con una película de sellado. Inyecte 100 microlitros de la emulsión peptídica de glicoproteína oligodendrocitos de mielina por vía subcutánea a cada lado de la columna dorsal de un ratón. Después de la inyección, observe la formación automática de masas bulbosas debajo de la piel y el dorso.

Luego, por vía intraperitoneal, inyecte 100 microlitros de toxina pertussis en el mismo ratón. Prepare una cámara de reacción de campo abierto y configure un sistema de análisis de video para grabar la locomoción del ratón. Para limpiar la cámara de reacción antes del experimento, rocíe etanol al 70% en toda el área y limpie con una toalla de papel limpia.

A continuación, coloque un ratón en la esquina de una cámara de reacción. Para comenzar a disparar, haga clic en el botón de inicio de captura en la barra de menú del sistema de grabación de video y grabe la hora. Manteniendo el silencio en la sala de pruebas, deje que el mouse se mueva libremente durante cinco minutos.

Luego detenga la grabación y guarde el video. Vuelva a colocar el ratón en su jaula. Luego limpie el área de prueba con etanol al 70% y continúe con el siguiente ratón.

Mantenga el ratón sacrificado plano en una bandeja de disección y fije las extremidades. Sostenga la piel de las extremidades posteriores en el ratón con fórceps y abra la piel y los músculos con tijeras. A continuación, separe el fémur de la tibia y el hueso de la cadera usando cuidadosamente las tijeras.

Retire los músculos adheridos al fémur con tijeras. Luego coloque el fémur en etanol al 70% a temperatura ambiente. En este estudio, se evaluó la capacidad del péptido derivado de la glicoproteína oligodendrocitos de mielina para inducir EAE.

Los ratones inyectados con el péptido experimentaron una pérdida de peso progresiva. Después de seis a nueve días de inyección, desarrollaron síntomas de EAE que alcanzaron su punto máximo después de 14 a 16 días. Los gráficos de seguimiento de la prueba de campo abierto demostraron que EAE altera el comportamiento exploratorio normal de los ratones.

En comparación con los ratones normales, los ratones con EAE viajaron significativamente menos distancia en las fases tempranas de inicio, pico y remisión. Los ratones con EAE también tuvieron una duración significativamente reducida de la actividad en las fases pico y de remisión de la enfermedad. Además, en las tres fases los ratones EAE tuvieron significativamente menos distancia de viaje y tiempo pasado en el centro.

Las tomografías microcomputarizadas de fémures de ratones EAE revelaron una arquitectura trabecular diferente a la de ratones normales. Los fémures de ratones EAE tenían significativamente menos densidad mineral ósea y proporción de volumen óseo a volumen de tejido que los de ratones normales. Además, los fémures de ratones con EAE tenían menos densidad de conexión trabecular, número trabecular y grosor trabecular que los de ratones normales.

En comparación con los ratones normales, el espaciamiento trabecular se mejoró y el grosor del hueso cortical se redujo en ratones EAE. También podemos aislar el cerebro y el código espinal de ratones EAE en el pico de la enfermedad y analizar la producción de células inmunes y citoquinas mediante citometría gripal.