Fijación de etanol y tinción con DAPI: un método para visualizar el ADN en C. elegans

- Comience con una gota de solución tampón en un portaobjetos de microscopio y transfiera los gusanos intactos a la gota. Una vez que los gusanos estén en su lugar, use un pañuelo sin pelusa para absorber y eliminar el tampón. Fije la muestra bañando las muestras con etanol al 90% varias veces, permitiendo que se evapore después de cada aplicación.

Una vez que el etanol se haya evaporado después del enjuague final, agregue una solución que contenga el colorante de ácido nucleico, DAPI, a la muestra. DAPI se une preferentemente a las bases de adenina y timina en el surco menor del ADN. Cuando se une, el complejo DAPI-ADN absorbe la luz ultravioleta y emite luz azul visible.

A continuación, agregue un conservante anti-decoloración para prolongar la vida útil de la muestra. Aplique un cubreobjetos y séllelo al portaobjetos. A continuación, utilice un microscopio fluorescente con un filtro azul para visualizar los cuerpos DAPI, que, dependiendo de la célula y su estado de ciclo, pueden representar cromosomas individuales, pares de cromátidas hermanas o núcleos completos. En este experimento, contaremos pares de cromátidas hermanas teñidas con DAPI en ovocitos, para identificar cepas tetraploides de Caenorhabditis elegans.

- Las cepas tetraploides tienen 12 pares de cromosomas, que se pueden validar contando los cuerpos teñidos con DAPI en ovocitos no fertilizados. Para hacerlo, deje caer de cinco a diez microlitros de tampón M9 en un portaobjetos y transfiera de seis a 10 tetraploides putativos a la gota. Bajo un microscopio de disección, absorba cuidadosamente la mayor parte del M9 en un pañuelo de limpieza sin pelusa.

A continuación, deje caer 10 microlitros de etanol al 90% sobre los gusanos y observe cómo el etanol se evapora por completo. Tan pronto como termine la evaporación, repita el proceso de agregar etanol y observe cómo se evapora. En total, agregue 10 microlitros en cuatro aplicaciones. Después de que la última gota se evapore, agregue seis microlitros de DAPI a dos nanogramos por microlitro, o una mancha similar.

Para el almacenamiento a largo plazo de los portaobjetos, monte los gusanos en un anti-decoloración disponible comercialmente o casero. A continuación, añade un cubreobjetos y sella los bordes con esmalte de uñas. Una vez que el esmalte de uñas se haya secado, las diapositivas se pueden marcar. Utilice un microscopio fluorescente y un aumento de 100x.

Primero, encuentre el ovocito no fertilizado más maduro, que está inmediatamente adyacente a la espermateca, y que aún no ha entrado ni en la espermateca ni en el útero. Los cuerpos DAPI aquí son presumiblemente pares de cromosomas individuales. A continuación, concéntrese en el núcleo del ovocito y utilice el enfoque fino del microscopio para escanearlo lentamente, de arriba a abajo, mientras cuenta los cuerpos DAPI. A continuación, vuelva a contar los cuerpos DAPI en el mismo núcleo moviendo el foco de abajo hacia arriba.

Los ovocitos de tipo salvaje tienen un promedio de seis cuerpos DAPI. La presencia de 12 cuerpos de DAPI indica que los animales de esta cepa son tetraploides parciales o completos. Analice al menos 10 animales por cepa. A menudo, los pares de cromosomas estarán muy cerca o se tocarán, por lo que el número de cuerpos DAPI suele ser menor que el número real de pares de cromosomas.