En fase sólida Submonomer Síntesis de Polímeros peptoide y su auto-ensamblaje en altamente ordenadas nanoláminas

El objetivo general de este procedimiento es describir un método sencillo y eficiente para la síntesis de péptidos en fase sólida y la autoensamblaje acuoso de péptidos en láminas nano altamente ordenadas. Estructuralmente similares a los polipéptidos, los péptidos son polímeros de glicina sustituida en los que las cadenas laterales están unidas al nitrógeno en lugar del carbono alfa. El proceso comienza sintetizando una secuencia peptídica específica mediante el método de submonómero.

El método del submonómero consiste en dos pasos químicos sencillos que introducen cada monómero en la cadena de forma secuencial. Primero, se bromoacetila una amina unida a un soporte sólido. Segundo, el bromuro se desplaza con una amina primaria.

Estos pasos se repiten hasta alcanzar la longitud de cadena deseada. Después de la elongación de la cadena, el péptido se escinde del soporte sólido y el aceite peptídico crudo resultante se purifica mediante HPLC y se caracteriza para iniciar la autoensamblaje de péptidos en láminas nano. Se prepara una solución acuosa diluida del péptido en un vial de vidrio y se mezcla suavemente. Como paso final.

Las nano láminas se examinan bajo el microscopio. Los resultados demuestran que un ciclo iterativo de dos pasos químicos simples puede producir un polímero específico por secuencia que se autoensambla espontáneamente en nano láminas. Los péptidos son una clase novedosa de polímeros inspirados en la biología con propiedades intermedias entre las de las proteínas y los polímeros tradicionales.

Son resistentes y sintéticamente versátiles como los polímeros tradicionales, pero también altamente ajustables y específicos en secuencia, como las proteínas y el ADN; los péptidos están emergiendo como un material avanzado para abordar problemas clave en biomedicina y ciencia de materiales, tales como la identificación de fármacos bioactivos o el diseño de proteínas artificiales. Las principales ventajas de los péptidos incluyen el control preciso de la secuencia, la disponibilidad de bloques de construcción increíblemente diversos, síntesis eficiente y estabilidad frente a proteasas. Se describe un método general de síntesis manual de péptidos que implica equipo básico y reactivos disponibles comercialmente, lo que permite sintetizar fácilmente péptidos en la mayoría de los laboratorios.

La demostración visual de los pasos sintéticos es fundamental y sirve como referencia valiosa para personas que ingresan al campo de la síntesis en fase sólida. Aquí, por primera vez, se describe la purificación y caracterización de un péptido anfifílico de 36 residuos, así como su autoensamblaje en láminas nano altamente ordenadas. Comience este protocolo con la preparación del aparato experimental según se describe en el protocolo escrito.

Los siguientes pasos se realizarán en un recipiente de reacción de vidrio en lugar de un cartucho fritado de polipropileno desechable, por claridad. Tras el montaje, añada 100 miligramos de resina de amida R a un recipiente de reacción fritado e hincha la resina agregando dos mililitros de dimetilformamida o DMF, agitando mediante burbujeo durante 10 minutos. Luego, drene la solución al vacío para aislar la resina hinchada.

A continuación, agregue un mililitro de piridina al 20% completa en DMF para desproteger el grupo FM O. Agite durante dos minutos y drene. Repita este proceso durante 12 minutos, luego enjuague la resina agregando dos mililitros de DMF, agitando durante 15 segundos y drenando.

Comience a sintetizar la cadena peptídica con el primer ciclo de submonómero, que incluye una bromoacetilación y una etapa de desplazamiento. Para la bromoacetilación, agregue un mililitro de ácido bromoacético 0,6 molar en DMF y 86 microlitros de dicarbonimida de diisopropilo. Después de agitar durante 30 minutos, drene y enjuague con dos mililitros de DMF.

A continuación, realice el desplazamiento añadiendo un mililitro de una amina de uno a dos molar en metil pirógeno final, incube durante 30 a 120 minutos. Tras la incubación, drene y enjuague con dos mililitros de DMF. Nuevamente, continúe el crecimiento de la cadena peptídica repitiendo el ciclo de submonómero. Una vez finalizado el desplazamiento final, enjuague con dos mililitros de DMF.

A continuación, coloque una tapa de lavado con metano diora y almacene el recipiente de reacción hasta la escisión. Para iniciar la escisión, transfiera toda la resina seca a un vial de vidrio para centelleo de 20 mililitros, trabajando dentro de una campana y utilizando el equipo de protección personal adecuado; agregue cuatro mililitros de ácido tri fluor acético, o cóctel de escisión TFA, al vial de vidrio para centelleo y tápelo. Agite firmemente durante 10 minutos a 2 horas a temperatura ambiente.

Alternativamente, utilice un agitador rotatorio para mezclar la solución. Recopile la solución de escisión con TFA filtrando la resina a través de un cartucho empastado de polipropileno desechable hacia un nuevo vial de vidrio de centelleo de 20 mililitros previamente pesado. A continuación, añada un mililitro de cóctel de escisión fresco para enjuagar la resina y recoger cualquier péptido residual.

Repita esto, enjuague dos veces. Evapore el TFA soplando una corriente suave de nitrógeno o utilizando una carga de biot. Evapore el solvente con un evaporador V 10 y disuelva el aceite crudo en seis mililitros de una mezcla de acetonitrilo y agua en proporción uno a uno.

Luego, congele y liofilice la muestra. Este proceso debe repetirse una vez más tras la segunda liofilización. Registre el peso del producto crudo y almacénelo como un polvo seco a menos 20 grados Celsius mediante una combinación de HPLC analítica de moho y/o LCMS con ionización por pulverización electrostática.

La pureza del producto crudo y si está presente el peso molecular deseado se puede determinar siguiendo los procedimientos descritos en el texto. La mezcla cruda de péptidos luego puede purificarse mediante HPLC preparativa de fase reversa según el procedimiento escrito. Esta sección describe el protocolo para formar láminas a partir de una secuencia de cadena única de un péptido anfifílico 36 me específico.

Después de que se sintetiza, purifica y liofiliza la cadena de péptidos, el polvo blanco resultante se disuelve en DMSO para obtener una solución stock de dos milimolar. A continuación, obtenga un archivo de Dr.Glass para preparar una solución de péptido de 20 micromolar. Primero, agregue 445 microlitros de agua milli Q y 50 microlitros de tampón 10 x para la formación de láminas.

Vortex la ampolla para mezclar. A continuación, agregue cinco microlitros de una solución stock de péptido de dos milimolares y humedezca suavemente. Las láminas de la solución resultante se forman mediante la agitación suave de la solución acuosa diluida de péptido.

Incline lentamente el vial de vidrio con tapa desde la posición horizontal hasta la posición vertical. Esto provoca una agitación suave en forma de hojas, lo que también produce hojas. Sin embargo, las hojas tienden a ser más pequeñas y con menos bordes rectos en comparación con muchas hojas de alta calidad.

Gire lentamente los viales de vidrio alrededor del eje horizontal durante un día utilizando un rotador de tubos o un agitador personalizado para la tinción fluorescente de láminas nano, agregue un microlitro de rojo Nilo 100 micromolar a 100 microlitros de la solución de láminas nano para obtener una concentración final de un micromolar de rojo Nilo. El rojo Nilo es un colorante sensible al entorno cuya intensidad de fluorescencia aumenta cuando se localiza en ambientes hidrofóbicos. A continuación, prepare una solución de aros al 1% en agua caliente y viértala en una placa de Petri de plástico.

Asegúrese de que la solución de aros tenga aproximadamente un octavo de pulgada de espesor y deje que se enfríe sin perturbar sobre una superficie plana. Una vez que la solución de aros haya cuajado, use una espátula para cortar cuadrados de un centímetro por un centímetro. Luego, transfiera los cuadrados cortados a una laminilla de vidrio para recoger las láminas en el mismo plano y coloque un microlitro de solución de lámina sobre el trozo de aros.

Después de dos minutos, los aros deben absorber el tampón, dejando las láminas en la superficie. Capture una imagen de la lámina dentro de los 15 minutos. Alternativamente, para obtener imágenes de láminas y solución, cargue 15 microlitros dentro de una junta de 0,12 milímetros de espesor y 20 milímetros de diámetro sobre un portaobjetos de vidrio.

Cubra la muestra con un cubreobjetos e image en unos pocos días para realizar el MEB de las láminas nano. Primero, realice un ataque por plasma en obleas de silicio para favorecer la absorción de las láminas nano. Luego, agregue 20 microlitros de solución de láminas de péptidos sobre un sustrato de silicio tratado con plasma y deje reposar la solución durante tres minutos; elimine el exceso de solución con la punta de un hisopo de papel Kim. Añada 20 microlitros de agua sobre la superficie y nuevamente retire el exceso de solución por capilaridad para eliminar el tampón y las sales.

Alternativamente, las soluciones de láminas peptídicas se dializan frente a agua para eliminar el tampón y la sal. En este caso, se pueden depositar 20 microlitros de la solución de láminas dializada sobre sustratos de silicio tratados con plasma y dejar secar al aire. Después de que la solución de láminas se ha secado sobre los sustratos de silicio tratados con plasma, la lámina puede visualizarse mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) utilizando un detector de lente interna a energías de haz entre uno y cinco kilovoltios.

Se realizó la síntesis, caracterización y purificación de un péptido bloque de carga específico de secuencia de 36 me que se pliega en una lámina nano bidimensional altamente ordenada. Las aminas utilizadas en la síntesis del péptido bloque de carga de 36 me unirán etilendiamina a fenetilamina y a la beta alanina t butílica. Después de la síntesis, el péptido crudo se escindió de la resina con TFA acuoso al 95 %.

Después de que se recogió y evaporó la solución de TFA, el péptido bruto con carga del bloque 36 me se purificó mediante HPLC de fase reversa. Luego, la masa del péptido con carga del bloque purificado se confirmó mediante moldy.

La masa observada de 4981,2 coincide estrechamente con la masa calculada de 4981,74. El polvo liofilizado se disolvió en DMSO para obtener una solución stock de dos milimoles y se almacenó a cuatro grados Celsius. Las láminas se prepararon mediante el protocolo antes mencionado y se analizaron mediante microscopía óptica de fluorescencia.

Se observan una variedad de formas con tamaños de características que van hasta 300 micrones, y notablemente, bordes rectos son prominentes. También se utilizó SEM para obtener imágenes de las láminas, revelando de manera similar bordes rectos prominentes. Este video describe un protocolo sencillo y eficiente para la síntesis en fase sólida de péptidos y la autoensamblaje acuoso de péptidos en láminas nanoestructuradas.

Dado que literalmente cientos de aminoácidos constitutivos están fácilmente disponibles y pueden utilizarse en este protocolo, el espacio de diseño accesible con polipéptidos es prácticamente ilimitado. Los péptidos son materiales prometedores para la investigación en biomedicina y nanociencia debido a su flexibilidad sintética, robustez y capacidad de ordenamiento. En particular, a nivel atómico, las nano láminas sirven como una plataforma potencial para andamios de exhibición bidimensional, miméticos de membranas, sensores biológicos, miméticos de proteínas y fabricación de dispositivos.

Trabajar con reactivos corrosivos como trior, ácido acético y ácido bromoacético es extremadamente peligroso; para prevenir lesiones, realice todas las reacciones en una campana extractora y use equipo de protección personal adecuado.