En fase sólida Submonomer Síntesis de Polímeros peptoide y su auto-ensamblaje en altamente ordenadas nanoláminas

El objetivo general de este procedimiento es describir un método simple y eficiente para la síntesis de péptidos en fase sólida y el autoensamblaje acuoso de péptidos en nano láminas altamente ordenadas. Estructuralmente similares a los polipéptidos, los péptidos se encuentran en polímeros de glicina sustituidos donde las cadenas laterales están unidas al nitrógeno en lugar del carbono alfa. El proceso comienza sintetizando una secuencia peptídica específica a través de otro método de submonómero.

El método del submonómero consta de dos pasos químicos simples que introducen cada monómero en la cadena secuencialmente. En primer lugar, una amina unida a un soporte sólido es bromo acetilada. En segundo lugar, el bromuro se desplaza con una amina primaria.

Estos pasos se repiten hasta que se alcanza la longitud de cadena deseada Después de la elongación de la cadena, el péptido se separa del soporte sólido y el aceite de péptido crudo resultante se purifica mediante HPLC y se caracteriza para iniciar el autoensamblaje de los péptidos en nano láminas. Se prepara una solución tampón acuosa diluida del péptido en un vial de vidrio y se mezcla suavemente. Como paso final.

Las nano láminas se examinan bajo el microscopio. Los resultados demuestran que un ciclo iterativo de dos pasos químicos simples puede producir un polímero específico de secuencia que se autoensambla espontáneamente en nano láminas. Los péptidos son una nueva clase de polímeros bioinspirados con propiedades intermedias entre las de las proteínas y los polímeros tradicionales.

Son robustos y sintéticamente versátiles como los polímeros tradicionales, pero también son altamente ajustables y específicos de secuencia, como las proteínas y los péptidos de ADN, están emergiendo como un material avanzado para abordar problemas clave en biomedicina y ciencia de materiales, como la identificación de fármacos bioactivos o el diseño de proteínas artificiales. Las principales ventajas de los péptidos incluyen el control preciso de la secuencia, la disponibilidad de bloques de construcción increíblemente diversos, la síntesis eficiente y la estabilidad de la proteasa. Se describe el método general de síntesis manual de péptidos que involucra equipo básico y reactivos disponibles comercialmente, lo que permite que los péptidos se sinteticen fácilmente en la mayoría de los laboratorios.

La demostración visual de los pasos sintéticos es fundamental y sirve como una referencia valiosa para las personas que ingresan al campo de la síntesis en fase sólida. Por primera vez aquí, se describe la purificación y caracterización de un péptido anfifílico 36 mers, así como su autoensamblaje en nano láminas altamente ordenadas. Comience este protocolo con la configuración del aparato experimental como se describe en el protocolo escrito.

Los siguientes pasos se realizarán en un recipiente de reacción de vidrio en lugar de un cartucho fritado de polipropileno desechable para mayor claridad. Después de la configuración de 100 miligramos de resina de R amida en un recipiente de reacción fritado, hinche la resina agregando dos mililitros de amida en forma de dimetilo o DMF agite burbujeando durante 10 minutos. A continuación, drene la solución al vacío para aislar la resina hinchada.

A continuación, agregue un mililitro de metilpiridina al 20% completo en DMF para proteger el grupo FM O. Agitar durante dos minutos y escurrir. Repite este proceso durante 12 minutos, luego enjuaga la resina añadiendo dos mililitros de DMF agitando durante 15 segundos y escurriendo .

Comience a hacer crecer la cadena peptídica con el primer ciclo de submonómeros, que incluye una acetilación de bromo y un paso de desplazamiento. Para la acetilación de bromo, agregue un mililitro de ácido bromoacético 0.6 molar en DMF y 86 microlitros de ácaro de carbato di isopropilo. Después de agitar durante 30 minutos, escurrir y enjuagar con dos mililitros de DMF.

A continuación, realice el desplazamiento agregando un mililitro de una a dos aminas molares en la incubación final de metilpirogena durante 30 a 120 minutos después de la incubación, drene y enjuague con dos mililitros de DMF. Nuevamente, continúe haciendo crecer la cadena peptídica repitiendo el ciclo del submonómero. Una vez realizado el desplazamiento final, enjuague con dos mililitros de DMF.

Siga esto con una tapa de lavado de metano diora y guarde el recipiente de reacción hasta que se escinva. Para comenzar la escisión, transfiera toda la resina seca a un vial de vidrio de centelleo de 20 mililitros que funcione dentro de una capucha y, utilizando el equipo de protección personal adecuado, agregue cuatro mililitros de ácido trifluoroacético o cóctel de escisión TFA al frasco y la tapa de vidrio de centelleo. Revuelva firmemente durante 10 minutos a dos horas a temperatura ambiente.

Alternativamente, use un agitador giratorio para mezclar la solución. Recoja la solución de escisión de TFA filtrando la resina a través de un cartucho fritado de polipropileno desechable en un nuevo vial de vidrio de centelleo de 20 mililitros prepesado. A continuación, añade un mililitro de cóctel de escote fresco para enjuagar la resina y recoger cualquier péptido residual.

Repita esto, enjuague dos veces. Evapore el TFA soplando un chorro suave de nitrógeno o utilizando una carga de biot. El evaporador V 10 rojo disuelve el petróleo crudo en seis mililitros de aceto nitrilo uno a uno y agua.

A continuación, congele y liofilice la muestra. Este proceso debe repetirse una vez más después de la segunda liofilización. Registre el peso del almacén de productos crudos como polvo seco a menos 20 grados Celsius a través de una combinación de HPLC analítica mohosa o LCMS por electropulverización.

La pureza del producto crudo y si el peso molecular deseado está presente se pueden determinar siguiendo los procedimientos descritos en el texto. A continuación, la mezcla de péptidos crudos puede purificarse con HPLC de preparación en fase inversa de acuerdo con el procedimiento escrito. En esta sección se describe el protocolo para formar láminas a partir de un péptido anfifílico 36 me específico de una secuencia de cadena única.

Después de sintetizar, purificar y liofilizar la hebra peptídica, el polvo blanco resultante se disuelve en DMSO para formar una solución madre de dos milimolares. A continuación, obtenga una lima Dr.Glass para preparar una solución de péptidos de 20 micromolares. Primero, agregue 445 microlitros de agua mili Q y 50 microlitros de tampón de formación de láminas 10

Agite el vial para mezclar. A continuación, añada cinco microlitros de una solución madre de péptidos de dos milimolares e hinche suavemente. Las hojas de solución resultantes se forman mediante la suave agitación de la solución de péptido acuoso diluido.

Inclinar lentamente el vial de vidrio tapado desde la posición horizontal hasta la posición vertical. El resultado es una suave agitación de las hojas, también produce hojas. Sin embargo, las hojas tienden a ser más pequeñas y con menos bordes rectos para muchas hojas de alta calidad.

Gire los viales de vidrio alrededor del eje horizontal lentamente durante un día usando un rotador de tubo o un balancín personalizado para la tinción fluorescente de nano láminas, agregue un microlitro de 100 micromolares de rojo de Nilo a 100 microlitros de la solución de nano láminas para obtener una concentración final de un micromolar de Nilo. El rojo es un colorante sensible al medio ambiente cuya intensidad de fluorescencia aumenta cuando se localiza en entornos hidrofóbicos. A continuación, prepare una solución de aros al 1% en agua caliente y viértala en una placa de Petri de plástico.

Asegúrese de que la solución de aros tenga aproximadamente un octavo de pulgada de espesor y permita que la solución se enfríe sin ser molestada sobre una superficie plana. Después de que los aros se asienten, use una espátula para cortar cuadrados de un centímetro por un centímetro. A continuación, transfiera los cuadrados cortados a un portaobjetos de vidrio para recoger las hojas en el mismo plano, coloque un microlitro de solución de hoja en la pieza de aros.

Después de dos minutos, los aros deben absorber el tampón dejando las hojas en la superficie. Imagen de la hoja en 15 minutos. Alternativamente, para obtener imágenes de las hojas y la solución, cargue 15 microlitros dentro de una junta de 20 milímetros de diámetro y 0,12 milímetros en un portaobjetos de vidrio.

Cubra la muestra con un cubreobjetos y una imagen dentro de unos días para realizar el SEM de nano láminas. Primeros chips de silicio grabados por plasma para ayudar en la absorción de las nano láminas. A continuación, deje caer 20 microlitros de solución de lámina peptídica sobre un sustrato de silicona tratado con plasma y deje reposar la solución después de tres minutos, retire el exceso de solución con la punta de una pipeta Kim wipe 20 microlitros de agua sobre la superficie y vuelva a absorber el exceso de solución para eliminar el tampón y las sales.

Alternativamente, las soluciones de lámina de péptidos se dializan contra el agua para eliminar el tampón y la sal. En este caso, se pueden dejar caer 20 microlitros de la solución de lámina dializada sobre los sustratos de silicona tratados con plasma y dejar que se sequen al aire. Después de que la solución de lámina se haya secado en los sustratos de silicio tratados con plasma, la lámina se puede visualizar con SEM utilizando un detector en la lente a energías de haz entre un kilovoltio y cinco kilovoltios.

Se realizó la síntesis, caracterización y purificación de un péptido de carga en bloque de 36 me específico de secuencia que se pliega en una nanolámina bidimensional altamente ordenada. Las aminas que utilizan la síntesis del péptido de carga en bloque 36 me bok etilendiamina a fenetilo, amina y t butil beta alanina. Después de la síntesis, el péptido crudo se escindió de la resina con un 95% de TFA acuoso.

Después de que la solución de TFA se recolectó y se evaporó. El péptido crudo de carga en bloque de 36 me se purificó con HPLC de fase inversa. La masa del péptido de carga de bloque purificado fue confirmada por moho.

La masa observada 4981,2 coincide estrechamente con la masa calculada de 4981,74. El polvo liofilizado se disolvió en DMSO para formar una solución madre de dos milimolares y se almacenó a cuatro grados centígrados. Las láminas se elaboraron por el protocolo antes mencionado y la imagen con microscopía óptica de fluorescencia.

Se observa una variedad de formas con tamaños de características que van hasta 300 micras y, en particular, los bordes rectos son prominentes. También se utilizó SEM para obtener imágenes de las láminas de manera similar, revelando bordes rectos prominentes. Este video describe un protocolo sencillo y eficiente para la síntesis de péptidos de cara sólida y el autoensamblaje acuoso de péptidos en nano láminas.

Dado que literalmente cientos de bloques de construcción están disponibles y se pueden usar en este protocolo, el espacio de diseño accesible con polipéptidos es prácticamente ilimitado. Los péptidos son materiales prometedores para la investigación en biomedicina y nanociencia debido a su flexibilidad sintética, robustez y ordenación. A nivel atómico en particular, las nano láminas sirven como una plataforma potencial para andamios de visualización bidimensionales, miméticos de membranas, sensores biológicos, miméticos de proteínas y fabricación de dispositivos.

Trabajar con reactivos corrosivos como trior, ácido acético y ácido bromoacético es extremadamente peligroso para prevenir lesiones, realizar todas las reacciones en una campana extractora y usar el equipo de protección personal adecuado.