Síntesis y caracterización de 1, 2-Dithiolane modifican uno mismo-montaje de péptidos

A medida que crecen las estructuras para aumentar la funcionalidad de las estructuras supermoleculares, este método de incorporar grupos 1,2-ditiolano con péptidos autoensamblables puede ayudar a responder preguntas clave sobre la reactividad en superficies supermoleculares. La principal ventaja de esta técnica es que el acoplamiento y la desprotección de la molécula precursora 1,2-ditiolano se produce en la resina con un solo paso de purificación del péptido modificado final. A medida que varía el tiempo que tardan los ensamblajes en madurar hasta convertirse en sus estructuras supermoleculares finales, es fundamental la demostración visual de los métodos de caracterización y los resultados de los ensamblajes supermoleculares.

Para sintetizar el precursor de ditiolane, primero disuelva un gramo de ácido 3-bromo-2-propriónico en aproximadamente cuatro mililitros de hidróxido de sodio de un molar en un matraz de reacción de fondo redondo de 50 mililitros a 55 grados Celsius con agitación. Cuando todo el reactivo se haya suspendido en solución, selle el matraz de reacción con un septo y coloque el matraz bajo atmósfera de nitrógeno. A continuación, agregue 1,49 gramos de tioacetato de potasio y tres mililitros de ácido sulfúrico bimolar a cuatro mililitros de agua desionizada para crear ácido tioacético in situ.

Aspire la solución de ácido tioacético en una jeringa de plástico desechable de 10 mililitros y equipe la jeringa con una aguja de calibre 18, luego perfore los tabiques con la aguja para agregar la mezcla gota a gota al matraz de reacción y continúe la reacción durante la noche a 55 grados Celsius. A la mañana siguiente, monitoree la reacción por cromatografía en capa fina en placas de gel de sílice 60 F254 utilizando una mezcla de metanol y diclorometano y visualice el progreso de la reacción mediante la tinción verde de bromocresol. Cuando la reacción completa se haya enfriado a temperatura ambiente, acidifique la mezcla con ácido sulfúrico de dos molares hasta un pH de uno.

Un aceite amarillo debe separarse de la solución, luego extraer el producto con tres adiciones de 40 mililitros de cloroformo frío y combinar las capas orgánicas para el secado sobre sulfato de magnesio, eliminando el cloroformo a presión reducida. El producto debe ser un aceite amarillo con un rendimiento total del 83% y puede utilizarse sin más purificación. Para acoplar el precursor de ditiolano al extremo N-terminal del péptido en resina, agregue cuatro equivalentes de precursor de ditiolano a cinco mililitros de dimetilformamida, cuatro equivalentes de HBTU y 10 equivalentes de DIPEA.

Deje que la mezcla de acoplamiento se preactive durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de agregar la muestra a la jeringa fritada que contiene resina N-terminal. Agite la reacción de acoplamiento durante dos horas, seguida de tres lavados de cinco mililitros con dimetilformamida fresca y repita la reacción de acoplamiento y agite durante la noche. Después del segundo acoplamiento, lave la resina con tres lavados de dimetilformamida de cinco mililitros seguidos de tres lavados de resina de diclorometano de cinco mililitros y transfiera la resina seca a un tubo de reacción de microondas de 10 mililitros.

Luego, para desproteger el grupo tioacetato del precursor de ditiolano N-terminal, agregue dos mililitros de dimetilformamida al tubo. Deje que la resina se hinche, agregue una pequeña barra de agitación magnética al recipiente y vuelva a suspender la resina con agitación magnética de baja velocidad. Después de 15 minutos, agregue dos mililitros de hidróxido de amonio concentrado al tubo, tape el recipiente de reacción con un tabique de silicona y coloque el recipiente en un reactor de microondas durante 45 minutos a 75 grados Celsius con agitación.

Cuando se complete la reacción de microondas, transfiera la resina a una jeringa limpia, desechable y fritada y lave la resina con dos lavados de dimetilformamida de cinco mililitros y dos lavados de metanol de cinco mililitros. Después del último lavado, agregue cinco mililitros de cóctel de escote a la jeringa que contiene resina para una incubación de 1 1/2 hora con una agitación suave a temperatura ambiente. Para preparar un mililitro de péptido crudo para cromatografía líquida de alta resolución o purificación por HPLC, agregue 400 microlitros de caldo peptídico concentrado en acetonitrilo a 600 microlitros de agua suplementada con 0,1% de ácido trifluoroacético y filtre la solución a través de un filtro de jeringa de 22 micrómetros en un vial de HPLC.

Para purificar el péptido, use una columna semipreparativa C18 a un caudal de tres mililitros por minuto en un gradiente lineal de 15 a 55% de acetonitrilo en 20 minutos con los detectores UV configurados a 222 nanómetros y 330 nanómetros. A continuación, recoge y combina los picos de interés. Para la confirmación del producto peptídico mediante tiempo de vuelo/ionización por láser asistido por matriz o espectrometría de masas MALDI-TOF, mezcle 0,5 microlitros del pico recogido en una placa de desorción/ionización láser asistida por matriz que contenga 0,5 microlitros de matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico.

Para preparar una solución de autoensamblaje, disuelva un miligramo del polvo de péptido liofilizado en una mezcla de acetonitrilo al 20% y HEPES 10 milimolares en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, luego agite la solución de ensamblaje y deje que la muestra se ensamble a temperatura ambiente. Cuando el ensamblaje de péptidos alcance la maduración, seque de ocho a 10 microlitros de la solución de ensamblaje como una película delgada sobre el cristal de diamante de reflexión total atenuado y controle la desaparición de un pico de agua grande y ancho de 1640 a 1631 centímetros inversos a medida que se forma la película seca. Adquiera espectros de fondo e infrarrojos de 1500 a 1800 centímetros inversos con un promedio de 50 escaneos con una resolución de dos centímetros inversos, restando los escaneos de fondo antes de cada escaneo de muestra.

La firma infrarroja para el ensamblaje de la lámina beta debe observarse como un pico agudo entre 1625 y 1635 centímetros inversos. Cuando las muestras de péptidos hayan madurado en estructuras supermoleculares ricas en láminas beta, cargue 10 microlitros de la solución de ensamblaje de péptidos en la superficie de una rejilla de carbono de microscopio electrónico de transmisión y permita que los ensamblajes se adsorban en la superficie de la rejilla durante uno o dos minutos. Toque el papel de filtro con el borde de la rejilla para eliminar el exceso de muestra y agregue 10 microlitros de tinción de acetato de uranilo al 2% recién preparada a la superficie de la rejilla para una incubación de dos a tres minutos, luego elimine el exceso de mancha con papel de filtro y coloque la rejilla en un desecador al vacío durante la noche antes de la obtención de imágenes al día siguiente por microscopía electrónica de transmisión.

Aparte de la síntesis inicial en un solo paso de la molécula precursora de ditiolane, el resto de la síntesis de péptidos modificados con 1,2-ditiolano se produce en soporte sólido. La conversión del ácido 3-bromo-2-propriónico en ácido 3-2-propanoico, el precursor del ditiolano, se confirma mediante resonancia magnética nuclear de protones y carbono-13 antes de acoplarlo a la amina N-terminal libre de un péptido aún en resina. Después de la desprotección, el péptido crudo se purifica mediante HPLC de fase inversa y la masa del producto se confirma mediante espectrometría de masas MALDI-TOF.

La espectroscopia infrarroja y de dicroísmo circular por transformada de Fourier se puede utilizar para monitorear el autoensamblaje del péptido 1,2-ditiolano purificado en fibras amiloides maduras para caracterizar su conformación de lámina beta extendida. A continuación, se pueden obtener imágenes de las fibras mediante microscopía electrónica de transmisión. Si bien estos métodos se pueden usar para modificar el extremo N-terminal de cualquier secuencia de péptidos que aún esté en la resina, es importante recordar que las condiciones de autoensamblaje del péptido deben optimizarse para cada péptido.

Estas técnicas, que añaden grupos 1,2-ditiolano a péptidos autoensamblables, permitirán a los investigadores en el campo de los biomateriales explorar la reactividad de la superficie supermolecular.