Name: Síntesis y caracterización de 1, 2-Dithiolane modifican uno mismo-montaje de péptidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprende a sintetizar péptidos modificados con 1,2-ditiolano y caracterizar sus estructuras supramoleculares mediante autoensamblaje. Este método eficiente permite acoplamiento y deprotección en resina con una sola purificación.

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Los autores desean agradecer al Dr. B. Ellen Scanley su capacitación técnica y ayuda usar la temperatura en el centro de la Universidad (CSCU) y universidades del estado de Connecticut para nanotecnología y Dr. Ishita Mukerji en Universidad de Wesleyan para tener acceso a su CD Espectrofotómetro. El trabajo divulgado fue apoyado en parte por el Instituto de Ciencias en la Universidad de Fairfield, Connecticut NASA espacio Grant consorcio y por la National Science Foundation bajo la beca número-1624774.

1. síntesis y purificación de 1, 2-Dithiolane péptido modificado
<ol><li>Síntesis del precursor dithiolane, 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propanoico ácido19.
	<ol>
<li>Añadir 1 g de 3-bromo - 2-(bromometil) ácido propiónico (1 equivalente) disuelto en una cantidad mínima de 1 M NaOH (aproximadamente 4 mL) a un matraz de reacción de fondo redondo de 25 mL con agitación a 55 ° C. Tapar el matraz de reacción con un septo y bajo atmósfera de nitrógeno.</li>
		<li>Preparar una solución que contiene 1,49 g de potasio thioacetate (3.2 equiv) en 4 mL de agua desionizada y 3 mL de ácido sulfúrico de 2 M (H2SO4) crear thioacetic ácido en situ.</li>
		<li>Tire la solución ácido thioacetic en una jeringa de plástico desechable de 10 mL y colocar una aguja en la jeringa. Añadir gota a gota la mezcla en el matraz de reacción por la perforación a través de los tabiques con la aguja. Continuar la reacción durante la noche a 55 º C.</li>
		<li>Vigilar la reacción por cromatografía en capa fina (CCF) en gel de sílice 60 F254 placas usando una mezcla de metanol y diclorometano (1:9). Visualizar el progreso de la reacción por la mancha verde de bromocresol. El producto tiene un Rf = 0.57.</li>
		<li>Después de la reacción es completa y enfriados a la temperatura ambiente, acidificar la mezcla a pH 1 con 2 M H2hasta4. Un aceite amarillo se separa de la solución.</li>
		<li>Extraer el producto con cloroformo frío (40 mL x 3). Combinar las capas orgánicas y seca sobre sulfato de magnesio. Retire el cloroformo a presión reducida.</li>
		<li>Para confirmar la identidad del producto aislado, 1, espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) como se muestra en las figuras 1B y C. Esperar los resultados siguientes: 1H NMR, CDCl3, 300 MHz: d = 10.1 (b, 1 H), 3.2 (m, 4 H), 2,9 (m, 1 H), 2.4 (s, 6 H); 13 C RMN CDCl3, 75 MHz: d = 195,1 (CH3COS-), 177.6 (-OOHC), 45.1 (-CH2S-), 30.5 (CH) 29.2 (-SCOCH3). Nota: El producto es un aceite amarillo y tiene un rendimiento global del 83%. Utilizar el producto sin una posterior purificación.</li>
	</ol></li>
	<li>SPPS y acoplamiento en resina de Dithiolane Precursor Nota: La síntesis del peptide de la fase sólida que se describe a continuación se llevó a cabo en un sintetizador de péptidos automatizada, siguiendo los protocolos recomendados del fabricante. Configuración y reactivos pueden ser adaptados para otros instrumentos comerciales o al usar aminoácidos especializados.<ol>
<li>Pesar 0,156 g de resina de 4-methylbenzhydrylamine (MBHA) pista amida (0.1 mmol) y colocar en un recipiente de la reacción. Hincharse la resina en dimetilformamida (DMF) para por lo menos 15 minutos antes del inicio de la síntesis.</li>
		<li>Peso a 4 equivalentes de cada fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) protegido del aminoácido (0.4 mmol) en la secuencia y 0,152 g de N, N, N', N'- tetrametil-O-(1H- benotriazol-1-yl) hexafluorofosfato de uranio (0.4 mmol, HBTU) para cada aminoácido en la secuencia. Cada cartucho contiene los aminoácidos Fmoc-protegido y HBTU.</li>
		<li>Después de ejecutar todas la síntesis comprueba en el sintetizador (rellenar reactivos, lavado de líneas de reactivo y a presión todas las botellas de reactivos), coloque los cartuchos del aminoácido en el carrusel en el C' n ' Dirección terminal. Coloque un cartucho vacío después de la posición final del aminoácido para el paso final de la desprotección de N-terminal Fmoc.</li>
		<li>Sintetizar el péptido usando la configuración recomendada estándar.<ol>
<li>Desprotejera el grupo Fmoc de la resina con 5 mL de 20% piperidina en DMF (5 min x 2).</li>
			<li>Lavar la resina con DMF (6 x 5 mL) antes de la etapa de acoplamiento.</li>
			<li>Para un acoplamiento único paso, añadir 4 mL de 0,4 M de N-methylmorpholine en DMF y el protegido de Fmoc Aminoácidos HBTU. Activar la solución de aminoácidos Fmoc-protegido por 30 s antes de transferir la solución al recipiente de reacción. Nota: El sintetizador de péptidos automatizada mezcla la resina y la solución por los burbujeantes N2 gas cada 30 s por 20 min mientras que la reacción de acoplamiento toma lugares. Para síntesis de péptidos manual, coloque el recipiente de la reacción en un agitador orbital a una velocidad baja para la duración de la etapa de acoplamiento.</li>
			<li>Vaciar la solución y lavar la resina con DMF (3 x 5 mL).</li>
			<li>Repita los pasos 1.2.4.1 a través 1.2.4.4 para cada aminoácidos Fmoc-protegidos en el C' n '-dirección de terminus para sintetizar el péptido de interés.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Después de la etapa final de la desprotección de N-terminal, transferencia de la resina en una jeringa desechable de sinterizado. Lavar la resina con el DMF (3 x 5 mL) y diclorometano (DCM, 3 x 5 mL). Nota: La resina se puede almacenar después de DCM en un desecador de vacío. Si la resina ha sido seleccionada antes de acoplamiento, asegúrese de hincharse la resina en DMF antes de la reacción de acoplamiento.</li>
		<li>Pareja dithiolane precursor (1) a N-terminal del péptido de la resina mediante la adición de 4 equivalentes de 1, 5 mL de DMF, 4 equivalentes de HBTU y 10 equivalentes de N, N-diisopropylethylamine (DIPEA). Activar previamente la mezcla de acoplamiento por 10 min antes de agregar a la resina que contiene la jeringa sinterizado.</li>
		<li>Agite la reacción de acoplamiento de 2 h. Después de 2 h, lavar la resina con DMF (3 x 5 mL) y repetir la reacción de acoplamiento con agitación durante la noche.</li>
		<li>Después el segundo acoplamiento, lavar la resina con el DMF (3 x 5 mL) y DCM (3 x 5 mL). Nota: La resina se puede almacenar en este punto bajo vacío hasta el escote.</li>
	</ol></li>
	<li>Thioacetate desprotección y escote de péptido de la resina
	<ol>
<li>Para desprotejera del grupo thioacetate el precursor de dithiolane N-terminal, transferir la resina seca a un tubo de reacción de microondas de 10 mL y añadir 2 mL de DMF. Permita que la resina se hinchan, añadir una barra de agitación magnética pequeña al recipiente y resuspender con baja velocidad de agitación magnética durante 15 minutos.</li>
		<li>Añadir 2 mL de hidróxido de amonio concentrado, tapa el recipiente de la reacción con los tabiques de silicona y coloque el recipiente de la reacción en un reactor de microondas utilizando la configuración de microondas de 75 ° C por 45 min con agitación.</li>
		<li>Una vez finalizada la reacción de la microonda, transferencia de la resina en una jeringa desechable limpias de sinterizado. Lave con DMF (2 x 5 mL) y metanol (MeOH, 2 x 5 mL).</li>
		<li>Agregar una solución de hidróxido de amonio concentrado en metanol (1:4), para un volumen total de 5 mL. Deje a temblar durante la noche para aumentar la oxidación intramolecular del enlace de disulfuro en dithiolane anillo.</li>
		<li>Lavar la resina con MeOH (2 x 5 mL) y DCM (3 x 5 mL). Nota: La resina seca se puede almacenar en un desecador de vacío en este punto.</li>
		<li>Añadir el cóctel de escote a la resina que contiene jeringa con agitándolo suavemente durante 1,5 h. El escote cóctel utilizado es de 95% de ácido trifluoroacético (TFA), Triisopropilsilano (TIPS) de 2,5% y 2.5% de agua en un volumen total de 5 mL. Atención: Trabajar bajo campana química solamente. TFA es volátil y corrosivo. Nota: Para la mayoría de secuencias de péptidos y aminoácidos cadena protección de los grupos, la solución cóctel escote anterior es suficiente; sin embargo, cocteles escote alternativos pueden ser necesaria para cierta cadena lateral del aminoácido protección grupos (en particular péptidos que contienen Cys, Met, Trp y Arg) u otra resina química20.</li>
		<li>Precipitar el péptido crudo en 25 mL de frío éter etílico en un tubo cónico de 50 mL por adición gota a gota desde la jeringa sinterizada. El péptido se precipita como un sólido blanco. Pelotilla del péptido por centrifugación a 1300 x g durante 10 minutos decantar con cuidado el éter dietílico en un contenedor separado para recogida de residuos.</li>
		<li>Agregar otros 25 mL de éter etílico en el tubo cónico y Resuspenda el precipitado con un vórtex. Repetir la centrifugación 1300 x g durante 10 minutos y decantar el éter dietílico otra vez. Secar el precipitado al vacío.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificación de 1, 2-Dithiolane modificado péptido Nota: Purificar el péptido crudo por HPLC de fase reversa. Recoger y combinar los picos del péptido y confirmar la masa por espectrometría de masas MALDI-TOF.<ol>
<li>Disolver los pellets de peptide crudo en cantidad mínima de acetonitrilo con 0,1% TFA. Debido a la hidrofobicidad del péptido y propensión de agregación, calentar suavemente la muestra a 40 º C para facilitar la solubilidad. Nota: Evite mayores temperaturas y sonicación del péptido para evitar potencial intercambio de disulfuro reacciones21,de22,23.</li>
		<li>Para preparar 1 mL de crudo péptido para la purificación del HPLC, añadir 400 μL de caldo concentrado de péptidos en acetonitrilo a 600 μL de H2O con 0,1% TFA y el filtro a través de un filtro de jeringa de 22 μm en un frasco HPLC. Puede añadirse un isopropanol al 5% adicional para prevenir la precipitación y la agregación del péptido.</li>
		<li>Purificar el péptido utilizando columna semi-preparativa C-18 con un caudal de 3 mL/min en un gradiente lineal de acetonitrilo de 15-55% en conjunto de 20 minutos los detectores UV a 222 nm (espina dorsal amida) y 330 nm (Enlace disulfuro). Reunir y combinar los picos de interés (figura 2A).</li>
		<li>Confirmar la masa de producto péptido por espectrómetro de masas MALDI-TOF en el modo reflectron (figura 2B). Para el análisis, mezclar 0,5 μL de pico recogido en la placa MALDI con 0,5 μL de la matriz de ácido (DHB) 2,5-dihydroxybenzoic (10 mg/mL DHB en 50% acetonitrilo, 0.1% TFA). Nota: Común aductos en MALDI-TOF espectrometría de masas son el sodio y potasio aducción ([M + Na]+ y [M + K]+) picos. La muestra antes del análisis de la desalación se recomienda si los picos de aducto de sal suprimen la señal del pico [M + H]+ principal. Además, un pico oxidado [M + o]+ se detecta también en el péptido de 1, 2-dithiolane modificado. Un informe sobre la oxidación inducida por láser de la ionización MALDI utilizando DHB matriz sugiere que factores como la concentración de muestra, solvente y la intensidad de láser pueden ser modificados para limitar el MALDI inducido por oxidación artefacto24.</li>
		<li>Después de la confirmación de MALDI-TOF de la masa correcta, liofilizar el péptido después de congelación flash. Mantenga el polvo liofilizado péptido bajo vacío hasta asamblea.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Caracterización de Supramolecular uno mismo-montaje de estructuras
<ol><li>
Formación de fibras amiloides
	<ol>
<li>Para preparar uno mismo-Asamblea solución, pesar 1 mg de polvo péptido utilizando una balanza analítica. Disolver en una mezcla (pH 7,5) de 20% de acetonitrilo y 10 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, a una concentración final de 1 mg/mL péptido ensamblado de una mezcla. Mezclar la solución de montaje y dejar montar a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caracterización espectroscópica de fibras amiloides
	<ol>
<li>Seguir el proceso de ensamblaje del péptido mediante la espectroscopia infrarrojo de Fourier (FTIR) cada pocos días. Un amplio pico centrado alrededor de 1670 cm-1 es la firma IR derivados de péptidos sin montar en la muestra17. Las muestras de ensamblaje del péptido suelen tener una o dos semanas para el amplio pico sin montar desaparecer y llegar a maduración.<ol>
<li>Una alícuota de 8-10 μL de la solución de montaje en seco como una película fina sobre el cristal de diamante ATR. Seguimiento de la desaparición de un pico de agua grande y amplio de 1640 a 1630 cm-1 como las formas de la película seca.</li>
			<li>Adquisición de espectros IR de 1500-1800 cm-1 con un promedio de 50 escaneos con una resolución de 2 cm-1 . Adquirir y resta el análisis de fondo antes de cada exploración de muestra. La firma de IR para el montaje de la β-hoja es un pico agudo entre 1625 y 1635 cm-1 (Figura 3A)25,26.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Caracterizar el conjunto péptido β-hoja ricas estructuras supramoleculares por dicroísmo circular (CD). Registrar los espectros usando un spectropolarimeter de CD con un sistema de control de temperatura Peltier.<ol>
<li>Tomar con pipeta 30 μL de la solución de montaje en un camino 0,1 mm longitud microcubeta. Nota: Es necesario un soporte de celular a la abrazadera y coloque la celda de longitud de ruta corta en el instrumento.</li>
			<li>Para cada espectro, establece el instrumento de CD en los siguientes parámetros: Análisis de longitudes de onda de 300 nm a 180 nm, velocidad de barrido de 100/min, ancho de banda de 1 nm, 25 ° C, promedio de tres análisis.</li>
			<li>Recoge un espectro del búfer (20% acetonitrilo/10 mM HEPES, pH 7,5) y restar cada scan muestra como control. La firma de CD para las β-hojas es que una elipticidad mínima centrado alrededor 220 nm (figura 3B)27.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopia de fibras amiloides
	<ol>
<li>Permiten dos o tres semanas para las muestras del péptido madurar en β-hoja ricas estructuras supramoleculares. Nota: Las Asambleas pueden ser reflejadas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) en las etapas anteriores del proceso de montaje.<ol>
<li>Pipetear 10 μL de la solución de montaje del péptido en la superficie de la rejilla del carbón TEM. Nota: tenga cuidado para no tocar la punta de la pipeta a la superficie de la rejilla. Alta precisión, cierre pinzas se utilizan para sostener la rejilla TEM durante la preparación.</li>
			<li>Esperar 1-2 minutos para permitir que las Asambleas fijar por adsorción sobre la superficie de la rejilla. Quitar exceso muestra por contacto con papel de filtro en el borde de la cuadrícula.</li>
			<li>Preparar una tinción de acetato de uranilo 2% mediante la adición de 100 μL de agua desionizada para la solución de acetato de uranilo 4% disponible en el mercado. Pipetee 10 μL de la mancha de acetato de uranilo 2% sobre la superficie de la rejilla e incubar durante 2-3 minutos. Después de la incubación, retirar exceso mancha por contacto con papel de filtro en el borde de la cuadrícula.</li>
			<li>Coloque las rejillas TEM en un desecador de vacío durante la noche. Almacenar bajo vacío hasta la proyección de imagen.</li>
			<li>Imagen de las muestras preparadas con TEM (figura 3). Parámetros típicos para microscopía son las siguientes: imágenes con aumentos que van desde 9.300 X 23, 000 X, filamento de tungsteno con un voltaje de aceleración de 120 kV. Nota: ImageJ puede utilizarse para medir el ancho de la fibra media de las estructuras supramoleculares de adquirido TEM imágenes28. PRECAUCIÓN: Por favor consulte todas hojas de datos de seguridad (SDS) antes de su uso. Varios productos químicos utilizan en la síntesis, purificación, y caracterización de los péptidos de uno mismo-montaje descrito 1, 2-dithiolane modificado son tóxicos o corrosivos y debe utilizarse sólo bajo una campana de humos químicos. Utilice siempre equipos de protección personal (incluyendo gafas de seguridad, bata de laboratorio, pantalón largo, zapatos cerrados) cuando se trabaja en el laboratorio.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este artículo discute los detalles de la síntesis y la purificación de un peptide uno mismo-montaje N-terminal 1, 2-dithiolane modificado y la caracterización de las estructuras supramoleculares resultantes. La síntesis del péptido 1, 2-dithiolane divulgado aquí tiene las ventajas, incluyendo una síntesis de un solo paso para producir el precursor dithiolane, 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propanoico ácido y la resina en microondas reacción de desprotección de la precursor thioacetate protección de grupo para produ...

El enlace peptídico sólido formación química implicada en síntesis del peptide de la fase sólida y la capacidad para controlar la composición y la longitud de la secuencia hacen los péptidos que uno mismo-montan en estructuras supramoleculares un campo muy investigado. Los factores que controlan y estabilizan péptido uno mismo-montado estructuras, incluyendo cadena lateral estérico e interacciones electrostáticas, hidrógeno y efectos hidrofóbicos1, servir como un conjunto de reglas de diseño. Como la investigación en estas reglas de diseño fundamental continúa progresando, el siguiente paso lógico en péptido autoensamblaje implica ampliar la diversidad de funciones y estructuras de péptidos. Mientras que uno mismo-montaje de péptidos es un biomaterial versátil que se han utilizado para muchas aplicaciones biomédicas templando el péptido secuencia o conjunto de condiciones2,3,4, el desarrollo de estrategias para la Asamblea modificaciones a péptido nanofibras en5,6,7,8,9 sigue siendo un área relativamente inexplorada.
Química intercambio y tiol disulfuro dinámicos en la superficie de estructuras supramoleculares es un área que tiene el potencial para producir biomateriales nuevos y funcionales. La incorporación de moléculas de 1, 2-dithiolane (comúnmente un derivado de ácido lipoico (la) o ácido asparagusic (aa)) se han divulgado en liposomas sistemas10,11, bloque copolímeros12,13y como Organización de anclajes en superficies14,15. Adjunto, divulgamos la síntesis y caracterización de un peptide uno mismo-montaje derivado del núcleo nucleating del péptido Aβ asociado con la enfermedad de Alzheimer que es modificada en el N-terminal con 1, 2-dithiolane grupo funcional16, 17. Las fibras supramoleculares que ahora sirven como una plataforma experimental para el estudio de la reactividad en la superficie supramolecular de fibras amiloides18intercambio de disulfuro y tiol.

<table><tbody><tr><td>Resina de amida MBHA, alta carga</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>RAM-5-HL</td><td>Evite el contacto con la piel y los ojos; no inhale</td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119-4</td><td>Líquidos y vapores inflamables; irritantes para los ojos y la piel; Usar equipo de protección personal; Manténgase alejado de las llamas</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-V</td><td>Use equipo de protección personal; no inhale</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-L</td><td>Use equipo de protección personal; no inhale</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-KBC</td><td>Use equipo de protección personal; no inhale</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-F</td><td>Use equipo de protección personal; no inhale</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-A</td><td>Use equipo de protección personal; no inhale</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-QT</td><td>Use equipo de protección personal; no inhale</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)hexafluorofosfato de uronio</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>26432</td><td>Causa irritación de la piel, los ojos y las vías respiratorias; no inhalar; usar debajo del capó o en un área bien ventilada</td></tr><tr><td>0.4 M N-metilmorfolina en DMF</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>PS3-MM-L</td><td>altamente inflamable; usar equipo de protección personal; mantener alejado del calor y mantener el recipiente bien cerrado; no inhale ni trague; lavar bien la piel después de manipular</td></tr><tr><td>piperidina al 20% en DMF</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>PS3-PPR-L</td><td>Causa quemaduras graves en los ojos y la piel; Líquidos y vapores inflamables; No inhale</td></tr><tr><td>diclorometano</td><td>Fisher Scientific</td><td>D37-4</td><td>Puede causar cáncer; No inhale; Use equipo de protección personal; úselo solo debajo del capó; si entra en contacto, levántese con agua durante al menos 15 minutos y obtenga atención médica</td></tr><tr><td>acetonitrilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td>Inflamable; irritante para los ojos; Usar equipo de protección personal; Úselo solo debajo de una campana extractora; mantener alejado de llamas abiertas o superficies calientes; En caso de contacto, enjuague con agua durante al menos 15 minutos y busque atención médica</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético Fisher</td><td>Scientific</td><td>A116-50</td><td>Causa quemaduras graves; no inhale; nocivo para la vida acuática; use equipo de protección personal; úselo solo debajo de la campana extractora; si entra en contacto, enjuague con agua durante al menos 15 minutos y obtenga atención médica inmediata</td></tr><tr><td>Acetato de uranilo al 4%</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>22400-4</td><td>No inhale; nocivo para la vida acuática</td></tr><tr><td>Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico</td><td>Acros Organics</td><td>AC172571000</td><td>No inhale; úselo al aire libre o en un área bien ventilada</td></tr><tr><td>nitrógeno Gas</td><td>TechAir</td><td></td><td>Contenido bajo presión, puede explotar si se calienta</td></tr><tr><td>Ácido 3-bromo-2-(bromometil)propiónico</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA1963014</td><td>No inhale; causa irritación en la piel y los ojos; corrosivo</td></tr><tr><td>hidróxido de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td>Use equipo de protección personal; úselo solo debajo de la campana extractora; si entra en contacto con el área de enjuague durante al menos 15 minutos y busque atención médica</td></tr><tr><td>tioacetato de potasio</td><td>Acros Organics AC221300250</td><td></td><td>Causa irritación de la piel y los ojos; no inhale; use equipo de protección personal</td></tr><tr><td>ácido sulfúrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA213</td><td>Provoca quemaduras; mantener alejado del agua; mantener alejado de materiales combustibles; no inhalar; utilizar equipo de protección personal; si entra en contacto con el área de enjuague el área durante al menos 15 minutos y busque atención médica</td></tr><tr><td>cloroformo-d</td><td>Acros Organics</td><td>AC320690075</td><td>Posible peligro de cáncer; irritante para la piel y los ojos; no inhalar; Usar equipo de protección personal; úselo solo debajo de la campana extractora; Si entra en contacto con el área de enjuague el área durante al menos 15 minutos y obtenga atención médica</td></tr><tr><td>cloroformo</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-4</td><td>Posible peligro de cáncer; irritante para la piel y los ojos; no inhale; Usar equipo de protección personal; úselo solo debajo de la campana extractora; En caso de contacto con el área de enjuague durante al menos 15 minutos y busque atención médica</td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina</td><td>Acros Organics</td><td>AC367841000</td><td>Altamente inflamable; nocivo para la vida acuática; use equipo de protección personal; no trague</td></tr><tr><td>hidróxido de amonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>Corrosivo; no inhale</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>Líquidos y vapores inflamables; utilizar equipo de protección personal; no inhalar; En caso de contacto con el área de enjuague durante al menos 15 minutos y obtenga atención médica</td></tr><tr><td>triisopropilsilano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781</td><td>Inflamable; use equipo de seguridad personal de protección; mantenga el recipiente herméticamente cerrado</td></tr><tr>éter<td>dietílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td>Extremadamente inflamable; Irritante para la piel y los ojos; Utilice equipo de protección personal</td></tr><tr><td>Ácido 2,5-dihidroxibenzoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39319-10x10MG-F</td><td>no inhalar; irritante para la piel y los ojos</td></tr><tr><td>ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ67635EXK</td><td></td></tr><tr><td>c18 zip-tip</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>tricis (2-carboxietil) clorhidrato de fosfespina</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI20490</td><td></td></tr><tr><td>gel de sílice 60 F254 láminas TLC recubiertas de aluminio</td><td>EMD Millipore</td><td>1.05549.0001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de RMN de precisión de pared delgada</td><td>Bel-Art</td><td>663000585</td><td>5 mm de diámetro exterior.</td></tr>En el informe se utilizaron <tr><td>jeringas Norm-Ject totalmente de plástico Air</td><td>Tite</td><td>AL10</td><td></td></tr><tr><td>aguja de un solo uso</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>BD 305185</td><td>las agujas usadas se desechan en el contenedor de residuos punzantes</td></tr><tr><td>Jeringa fritada desechable</td><td>Torviq</td><td>SF1000LL</td><td>jeringas fritas de 10 ml, pero se dispone de jeringas más grandes si es necesario para la síntesis a mayor escala.</td></tr><tr><td>rejilla de carbono</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>CF200-CU</td><td>Asegúrese de preparar las muestras y la tinción en el lado de la rejilla de carbono, no en el lado de cobre brillante de</td></tr><tr><td>las pinzas de cierre automático</td> de la rejilla <td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>78318-3X</td><td>puntas muy afiladas, longitud: 120 mm</td></tr><tr><td>0,1 mm Longitud de camino corto celda</td><td>Starna Cells, Inc.</td><td>20/C-Q-0.1</td><td>Frágiles</td></tr><tr><td>tapas de recipientes de 10 ml</td><td>CEM</td><td>909210</td><td></td></tr><tr><td>Recipientes a presión de 10 ml</td><td>CEM</td><td>908035</td><td></td></tr><tr><td>Aeris Columna de HPLC de semipreparación</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4632-N0 Soporte de</td> celdas de <td>150 x 10 mm</td></tr><tr><td></td><td>Starna Cells, Inc.</td><td>CH-2049</td><td>Necesario cuando se utilizan celdas de longitud de paso corto</td></tr><tr><td>Sintetizador de péptidos PS3</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactor de microondas DiscoverSP</td> centrífuga <td>CEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>HERMLE</td><td>Z 206 A</td><td>utilizó un rotor fijo de 6x50 mL</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>Detector UV</td></tr><tr><td>espectrómetro de resonancia magnética nuclear</td><td>Avance, Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas MALDI-TOF de</td> 300 MHz<td>, Axima Confidence, liofilizador Shimadzu</td><td></td><td></td>,</tr><tr><td></td><td>Millrock Technology</td>, <td>BT85A</td><td></td></tr><tr>,<td>espectrómetro infrarrojo por transformada de Fourier</td><td>, Alpha Tensor,</td> microscopio electrónico de transmisión Bruker<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>, Tecnai Spirit, FEI</td><td></td><td>utilizado con la cámara digital CCD de fibra óptica Gatan Orius. Accedido en el Centro de Nanotecnología de CSCU</td></tr><tr><td>Espectropolarímetro de dicroísmo circular</td><td>J-810, JASCO</td><td></td><td>Se utiliza con un controlador de temperatura Peltier de seis celdas. Consultado en la Universidad Wesleyan.</td></tr></tbody></table>

síntesis y caracterización de 1, 2-dithiolane modifican uno mismo-montaje de péptidos

Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides

Este informe se centra en la síntesis de un N-terminal 1, 2-dithiolane modificado peptide uno mismo-montaje y la caracterización de la resultante uno mismo-montar estructuras supramoleculares. La ruta sintética aprovecha la síntesis de péptidos de fase sólida con el acoplamiento en la resina de la molécula del precursor dithiolane, 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propanoico ácido y la thioacetate asistida por microondas deprotection del péptido N-terminal antes de la división final de la resina para dar 1, 2-dithiolane modificado péptido. Después de la purificación de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) del péptido 1, 2-dithiolane, derivado de la base nucleating del péptido Aβ asociado con la enfermedad de Alzheimer, el péptido aparece uno mismo-montar en fibras amiloideas Cruz-β. Protocolos para la caracterización de las fibras amiloides por espectroscopia infrarroja de Fourier (FT-IR), espectroscopía de dicroísmo circular (CD) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) se presentan. Ahora pueden explorar los métodos de modificación de la N-terminal con una molécula de 1, 2-dithiolane a péptidos uno mismo-montaje bien caracterizados como sistemas modelo para desarrollar estrategias de modificación de la Asamblea y explorar la química covalente dinámica en superficies de nanofibras de péptido supramolecular.

Aparte de la síntesis de un paso inicial de la molécula del precursor dithiolane, el resto de la síntesis del péptido 1, 2-dithiolane modificado se realiza en soporte sólido (figura 1A). La conversión de 3-bromo - 2-(bromometil) ácido propiónico para 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propanoico ácido dithiolane precursor, es confirmado por 1H y 13C NMR (figura 1B y C) antes de que se acop...

Un protocolo para la síntesis de un 1, 2-dithiolane modificada de péptidos y la caracterización de las estructuras supramoleculares resultantes del peptide uno mismo-Asamblea.

Síntesis y caracterización de 1, 2-Dithiolane modifican uno mismo-montaje de péptidos

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting ...

A medida que crecen las estructuras para aumentar la funcionalidad de las estructuras supermoleculares, este método de incorporar grupos 1,2-ditiolano con péptidos autoensamblables puede ayudar a responder preguntas clave sobre la reactividad en superficies supermoleculares. La principal ventaja de esta técnica es que el acoplamiento y la desprotección de la molécula precursora 1,2-ditiolano se produce en la resina con un solo paso de purificación del péptido modificado final. A medida que varía el tiempo que tardan los ensamblajes en madurar hasta convertirse en sus estructuras supermoleculares finales, es fundamental la demostración visual de los métodos de caracterización y los resultados de los ensamblajes supermoleculares.Para sintetizar el precursor de ditiolane, primero disuelva un gramo de ácido 3-bromo-2-propriónico en aproximadamente cuatro mililitros de hidróxido de sodio de un molar en un matraz de reacción de fondo redondo de 50 mililitros a 55 grados Celsius con agitación. Cuando todo el reactivo se haya suspendido en solución, selle el matraz de reacción con un septo y coloque el matraz bajo atmósfera de nitrógeno. A continuación, agregue 1,49 gramos de tioacetato de potasio y tres mililitros de ácido sulfúrico bimolar a cuatro mililitros de agua desionizada para crear ácido tioacético in situ.Aspire la solución de ácido tioacético en una jeringa de plástico desechable de 10 mililitros y equipe la jeringa con una aguja de calibre 18, luego perfore los tabiques con la aguja para agregar la mezcla gota a gota al matraz de reacción y continúe la reacción durante la noche a 55 grados Celsius. A la mañana siguiente, monitoree la reacción por cromatografía en capa fina en placas de gel de sílice 60 F254 utilizando una mezcla de metanol y diclorometano y visualice el progreso de la reacción mediante la tinción verde de bromocresol. Cuando la reacción completa se haya enfriado a temperatura ambiente, acidifique la mezcla con ácido sulfúrico de dos molares hasta un pH de uno.Un aceite amarillo debe separarse de la solución, luego extraer el producto con tres adiciones de 40 mililitros de cloroformo frío y combinar las capas orgánicas para el secado sobre sulfato de magnesio, eliminando el cloroformo a presión reducida. El producto debe ser un aceite amarillo con un rendimiento total del 83% y puede utilizarse sin más purificación. Para acoplar el precursor de ditiolano al extremo N-terminal del péptido en resina, agregue cuatro equivalentes de precursor de ditiolano a cinco mililitros de dimetilformamida, cuatro equivalentes de HBTU y 10 equivalentes de DIPEA.Deje que la mezcla de acoplamiento se preactive durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de agregar la muestra a la jeringa fritada que contiene resina N-terminal. Agite la reacción de acoplamiento durante dos horas, seguida de tres lavados de cinco mililitros con dimetilformamida fresca y repita la reacción de acoplamiento y agite durante la noche. Después del segundo acoplamiento, lave la resina con tres lavados de dimetilformamida de cinco mililitros seguidos de tres lavados de resina de diclorometano de cinco mililitros y transfiera la resina seca a un tubo de reacción de microondas de 10 mililitros.Luego, para desproteger el grupo tioacetato del precursor de ditiolano N-terminal, agregue dos mililitros de dimetilformamida al tubo. Deje que la resina se hinche, agregue una pequeña barra de agitación magnética al recipiente y vuelva a suspender la resina con agitación magnética de baja velocidad. Después de 15 minutos, agregue dos mililitros de hidróxido de amonio concentrado al tubo, tape el recipiente de reacción con un tabique de silicona y coloque el recipiente en un reactor de microondas durante 45 minutos a 75 grados Celsius con agitación.Cuando se complete la reacción de microondas, transfiera la resina a una jeringa limpia, desechable y fritada y lave la resina con dos lavados de dimetilformamida de cinco mililitros y dos lavados de metanol de cinco mililitros. Después del último lavado, agregue cinco mililitros de cóctel de escote a la jeringa que contiene resina para una incubación de 1 1/2 hora con una agitación suave a temperatura ambiente. Para preparar un mililitro de péptido crudo para cromatografía líquida de alta resolución o purificación por HPLC, agregue 400 microlitros de caldo peptídico concentrado en acetonitrilo a 600 microlitros de agua suplementada con 0,1% de ácido trifluoroacético y filtre la solución a través de un filtro de jeringa de 22 micrómetros en un vial de HPLC.Para purificar el péptido, use una columna semipreparativa C18 a un caudal de tres mililitros por minuto en un gradiente lineal de 15 a 55% de acetonitrilo en 20 minutos con los detectores UV configurados a 222 nanómetros y 330 nanómetros. A continuación, recoge y combina los picos de interés. Para la confirmación del producto peptídico mediante tiempo de vuelo/ionización por láser asistido por matriz o espectrometría de masas MALDI-TOF, mezcle 0,5 microlitros del pico recogido en una placa de desorción/ionización láser asistida por matriz que contenga 0,5 microlitros de matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico.Para preparar una solución de autoensamblaje, disuelva un miligramo del polvo de péptido liofilizado en una mezcla de acetonitrilo al 20% y HEPES 10 milimolares en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, luego agite la solución de ensamblaje y deje que la muestra se ensamble a temperatura ambiente. Cuando el ensamblaje de péptidos alcance la maduración, seque de ocho a 10 microlitros de la solución de ensamblaje como una película delgada sobre el cristal de diamante de reflexión total atenuado y controle la desaparición de un pico de agua grande y ancho de 1640 a 1631 centímetros inversos a medida que se forma la película seca. Adquiera espectros de fondo e infrarrojos de 1500 a 1800 centímetros inversos con un promedio de 50 escaneos con una resolución de dos centímetros inversos, restando los escaneos de fondo antes de cada escaneo de muestra.La firma infrarroja para el ensamblaje de la lámina beta debe observarse como un pico agudo entre 1625 y 1635 centímetros inversos. Cuando las muestras de péptidos hayan madurado en estructuras supermoleculares ricas en láminas beta, cargue 10 microlitros de la solución de ensamblaje de péptidos en la superficie de una rejilla de carbono de microscopio electrónico de transmisión y permita que los ensamblajes se adsorban en la superficie de la rejilla durante uno o dos minutos. Toque el papel de filtro con el borde de la rejilla para eliminar el exceso de muestra y agregue 10 microlitros de tinción de acetato de uranilo al 2% recién preparada a la superficie de la rejilla para una incubación de dos a tres minutos, luego elimine el exceso de mancha con papel de filtro y coloque la rejilla en un desecador al vacío durante la noche antes de la obtención de imágenes al día siguiente por microscopía electrónica de transmisión.Aparte de la síntesis inicial en un solo paso de la molécula precursora de ditiolane, el resto de la síntesis de péptidos modificados con 1,2-ditiolano se produce en soporte sólido. La conversión del ácido 3-bromo-2-propriónico en ácido 3-2-propanoico, el precursor del ditiolano, se confirma mediante resonancia magnética nuclear de protones y carbono-13 antes de acoplarlo a la amina N-terminal libre de un péptido aún en resina. Después de la desprotección, el péptido crudo se purifica mediante HPLC de fase inversa y la masa del producto se confirma mediante espectrometría de masas MALDI-TOF.La espectroscopia infrarroja y de dicroísmo circular por transformada de Fourier se puede utilizar para monitorear el autoensamblaje del péptido 1,2-ditiolano purificado en fibras amiloides maduras para caracterizar su conformación de lámina beta extendida. A continuación, se pueden obtener imágenes de las fibras mediante microscopía electrónica de transmisión. Si bien estos métodos se pueden usar para modificar el extremo N-terminal de cualquier secuencia de péptidos que aún esté en la resina, es importante recordar que las condiciones de autoensamblaje del péptido deben optimizarse para cada péptido.Estas técnicas, que añaden grupos 1,2-ditiolano a péptidos autoensamblables, permitirán a los investigadores en el campo de los biomateriales explorar la reactividad de la superficie supermolecular.

synthesis-characterization-12-dithiolane-modified-self-assembling

Research

Investigación

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Chemistry

Química

Un simple y general método manual peptoide síntesis referida a un equipo y reactivos básicos, disponibles en el mercado se perfila, lo que permite peptoides para ser fácilmente sintetizada en la mayoría de los laboratorios. La síntesis, purificación y caracterización de un 36mer peptoide anfifílicas se describe, así como su auto-ensamblaje en muy ordenada nanoláminas.

En fase sólida Submonomer Síntesis de Polímeros peptoide y su auto-ensamblaje en altamente ordenadas nanoláminas

Este video demuestra el autoensamblaje de péptidos amiloides en una estructura supramolecular rica en láminas beta utilizando espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier. Se pasa un rayo infrarrojo a través de un cristal con un alto índice de refracción y se registra la absorción de energía a través de la interfaz del cristal y la muestra. Las estructuras secundarias de las proteínas de la muestra se identifican analizando sus picos de absorción característicos en regiones específicas...

Una técnica de espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier para estudiar el autoensamblaje de péptidos

En este trabajo se describe la formación de estructuras a base de péptidos altamente ordenadas por el proceso espontáneo de auto-ensamblaje. El método utiliza péptidos disponibles comercialmente y equipo de laboratorio común. Esta técnica se puede aplicar a una gran variedad de péptidos y puede conducir al descubrimiento de nuevos conjuntos basados ​​en péptidos.

Formación de estructuras biomoleculares ordenada por el auto-ensamblaje de péptidos cortos

Presentamos un protocolo para la construcción de vinilo thioether sulfuro atado helicoidales péptidos mediante foto-inducida tiol-ene/tiol-Ino hydrothiolation.

Construcción de Thioether/sulfuro de vinilo-atado Hydrothiolation de péptidos helicoidales mediante foto-inducida tiol-eno/Ino

Este protocolo describe un método eficiente para sintetizar una nanoemulsión de un conjugado de ácido oleico acids-platinum(II) estabilizado con un tripéptido de lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Las formas de nanoemulsión condiciones suaves sintético a través de autoensamblaje de lo KYF y el conjugado.

Una nanoemulsión tripéptido-estabilizado del ácido oleico

Se presenta un protocolo para la síntesis de oligómeros peptoides codificados con información y para el autoensamblaje dirigido por secuencia de estos peptoides en escaleras moleculares utilizando aminas y aldehídos como pares reactivos covalentes dinámicos y Lewis de tierras raras ácidas metal triflos como reactivos multifunción.

Síntesis de peptoides que llevan información y su autoensamblaje covalente dinámico dirigido por secuencia

Este protocolo presenta la síntesis de péptidos cíclicos a través de la bisalquilación entre cisteína y metionina y la reacción fácil tiol-yne desencadenada por el centro de propargil sulfonio.

Construcción de péptidos cíclicos usando un centro de sulfonio en la correa

Este protocolo tiene como objetivo evaluar péptidos biofuncionales autoensamblables para la adhesión celular, la morfología de organoides y la expresión génica mediante inmunotinción. Utilizaremos una línea celular de cáncer colorrectal para proporcionar una forma rentable de obtener organoides para pruebas intensivas.

Fabricación y caracterización de organoides de cáncer colorrectal de la línea celular SW1222 en matriz de péptidos autoensamblables ultracortos

Este protocolo presenta tres métodos de preparación rápidos y sencillos que utilizan las condiciones ambientales para desencadenar el autoensamblaje de péptidos en hidrogeles. Además, se describe la caracterización de los hidrogeles peptídicos, demostrando que se pueden formar hidrogeles peptídicos mecánicamente estables en estas sencillas condiciones.

Preparación de hidrogeles de péptidos autoensamblados mecánicamente estables

Amidas terciarias péptido (PTA) son una superfamilia de peptidomiméticos que incluyen pero no se limitan a péptidos, peptoides y péptidos N-metilado. Aquí se describe un método de síntesis que combina estrategias de sub-monómero división y piscina y para sintetizar un solo grano de la biblioteca de un compuesto de las PTA.

Síntesis Split-y-piscina y caracterización del péptido Terciario Amida Biblioteca

Aprende a sintetizar péptidos modificados con 1,2-ditiolano y caracterizar sus estructuras supramoleculares mediante autoensamblaje. Este método eficiente permite acoplamiento y deprotección en resina con una sola purificación.

Síntesis y caracterización de 1, 2-Dithiolane modifican uno mismo-montaje de péptidos

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