Protocolo fácil para la síntesis de uno mismo-montaje base poliamina péptido Anfífilos (PPAs) y relacionados con biomateriales

Este método puede responder a preguntas clave sobre cómo decorar anfifilos peptídicos a poliaminas y sobre el uso de grupos protectores octogonales La principal ventaja de esta técnica es que se pueden generar anfífilos peptídicos híbridos con bloques de construcción químicos no protegidos que contienen múltiples lados reactivos. Los que demuestren el procedimiento serán Mehdi, Nathalia y Krishnaiah, estudiantes de laboratorio del Laboratorio Conda Sheridan. Primero, pese cuidadosamente la resina de cloruro de 2-clorotritilo y coloque la resina en un recipiente de síntesis fritado, de porocidad media, con una capacidad de 50 mililitros.

A continuación, fije el recipiente de sinétesis a un agitador mecánico de velocidad variable y gire el recipiente en un ángulo de 45 grados para maximizar la agitación. A continuación, añade 15 mililitros de DCM a la resina. Después de dejar que las perlas de resina se hinchen durante 15 minutos, agregue ocho equivalentes de la poliamina deseada a la resina y deje que reaccione durante cinco horas.

Después de cinco horas, realice una prueba kaiser para confirmar una reacción exitosa de la poliamina a la resina. A continuación, proteja el grupo amina primario añadiendo cuatro equivalentes de DDE en metanol anhidro y agitando la mezcla de reacción durante la noche. Al día siguiente, realice una prueba kaiser para confirmar el éxito de la protección por la ausencia de color azul de la perla de resina.

A continuación, escurre el DCM y lava la resina dos veces con una mezcla de dos a uno de DCM y DMF. Ahora, agregue 20 equivalentes de anhídrido Boc en DCM a la resina y deje que la reacción continúe durante tres horas. Después de realizar una prueba de cloranil para confirmar la protección de la amina secundaria, drene la mezcla de solventes y lave la resina dos veces con una mezcla de dos a uno de DCM y DMF.

A continuación, agregue 10 mililitros de una solución al 2% de hidracina en DMF a la resina. Después de agitar durante una hora, realice una prueba de Kaiser para confirmar la desprotección exitosa de la amina primaria. A continuación, mezcle cuatro equivalentes del aminoácido protegido por Fmoc, 3,95 equivalentes de HBTU y 15 equivalentes de DIPEA.

Agregue una mezcla uno a uno de DCM y DMF y sonique el cóctel hasta la disolución completa. Asegúrese de que el aminoácido, el agente de acoplamiento y el DIPEA estén realmente mezclados y activados antes de agregar la mezcla a la resina. Después de esperar de tres a cinco minutos para asegurar la activación del ácido carboxílico, agregue la mezcla de reacción al recipiente que contiene la resina y deje que la reacción continúe durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente.

Realice una prueba de káiser o cloranil en cada paso para confirmar el acoplamiento exitoso. Después de realizar una prueba de Kaiser para confirmar el acoplamiento exitoso, desproteja el grupo Fmoc del aminoácido agregando 10 mililitros de una solución al 20% de 4-metilpiridina en DMF. Una vez finalizada la reacción, realice una prueba kaiser para confirmar el éxito de la desprotección del aminoácido.

A continuación, lava la resina dos veces con 10 mililitros de DMF cada lavado de 5 minutos, y finalmente con 10 mililitros de DCM durante 10 minutos. Después de acoplar todos los aminoácidos requeridos, conjugue la cola hidrofóbica con el último aminoácido agregando 10 equivalentes de la funcionalidad de ácido carboxílico deseada a 9.5 equivalentes de HBTU y 12 equivalentes de DIPEA. Sonicar el cóctel hasta la disolución completa, luego agregar el cóctel al recipiente.

Llevar a cabo la reacción durante al menos cinco horas, aunque es recomendable realizarla durante la noche para obtener el mayor rendimiento. Lavar la resina con ocho mililitros de DMF durante dos minutos, y dos veces con ocho mililitros de DCM durante cinco minutos. Antes de cada adición, drene el solvente del recipiente.

Una vez realizado el último lavado, seca la resina al vacío durante 15 minutos. Para preparar 15 mililitros de cóctel de escote, agregue 14 mililitros de TFA a 0,5 mililitros de agua y 0,5 mililitros de triisopropilsilano. Agregue este cóctel de escote a la resina y agite durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente.

Una vez completada la reacción de escisión, recoja la solución en un matraz de fondo redondo de 50 mililitros. A continuación, concentre el AGT en vacío a uno o dos mililitros utilizando un evaporador rotativo a presión reducida, mientras calienta la mezcla a 40 grados centígrados Después de la evaporación, añada la solución de AGT obtenida, gota a gota, a un matraz de fondo redondo que contenga 15 mililitros de éter frío anhidro para precipitar el PPA. A continuación, añada 5 mililitros de éter frío anhidro al matraz original que contiene la solución concentrada de TFA.

Sonicato para recuperar sólidos adicionales. Luego, combínelo con la solución de éter del paso anterior. Cubra el matraz y colóquelo dentro del refrigerador durante la noche para maximizar la precipitación.

Al día siguiente, recoja el material precipitado por filtración al vacío utilizando un embudo de filtro de disco central de tamaño de vertido fino o mediano. Finalmente, lave el precipitado dos veces con cinco a diez mililitros de éter frío para eliminar cualquier residuo orgánico. La traza de HPLC y el espectro MALDI confirman la presencia del producto PPA, que debe tener una pureza superior al 95% para la caracterización del material o la evaluación biológica.

Se observa un solo pico agudo en la traza de HPLC basada en UV y el espectro MALDI corresponde al del peso molecular calculado del PPA dentro de más o menos un dalton. El autoensamblaje de los PPA se puede visualizar y analizar mediante microscopía electrónica de transmisión, microscopía de fuerza atómica, dispersión de rayos X de ángulo pequeño, microscopía electrónica de barrido y dispersión dinámica de luz. El autoensamblaje exitoso dará como resultado nanoestructuras bien definidas, tanto en microscopía electrónica de transmisión como en microscopía de fuerza atómica.

Una vez dominado, este protocolo se puede realizar en tres días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, recuerde purificar los productos y evaluar su pureza antes de cualquier estudio posterior. Siguiendo este procedimiento, se pueden preparar otras moléculas, como péptidos anfifílicos, péptidos e híbridos péptido-poliamina.

Después de su desarrollo, esta técnica ayuda a la investigación en el campo de los anfifilos peptídicos de autoensamblaje para explorar la influencia de las nanoestructuras de poliaminas en áreas como la administración de fármacos, la obtención de imágenes o la catálisis Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo llevar a cabo la síntesis de anfifilos peptídicos a base de poliaminas y anfifilos peptídicos relacionados. El ácido trifluoroacético y la 4-metilpiridina pueden ser peligrosos, y se deben tomar precauciones como el uso de guantes, batas de laboratorio y trabajar en la campana extractora mientras se realiza este procedimiento.