Name: Protocolo fácil para la síntesis de uno mismo-montaje base poliamina péptido Anfífilos (PPAs) y relacionados con biomateriales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprende a sintetizar anfífilos peptídicos basados en poliaminas (PPAs) mediante un método simplificado que utiliza bloques químicos sin proteger. Esta técnica facilita la creación de biomateriales híbridos para aplicaciones en nanotecnología.

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Este proyecto fue financiado por la Universidad de Nebraska Medical Center (fondos de arranque, MC-S); NIH-COBRE, 5P20GM103480 (T. Bronich) y la American Chemical Society, PRF # 57434-DNI7(MC-S).

1. general protocolo para síntesis de PPA
<ol><li>Calcular la escala de síntesis (generalmente mmol). Esta escala se basa en la masa de la cantidad de PPA de destino. Tenga en cuenta que la eficiencia de la reacción de SPPS gradualmente disminuye con un aumento de la secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, la eficiencia de la reacción exacta es difícil de calcular.</li>
	<li>Calcular el peso de la resina que se utiliza según la carga de la resina. La carga se encuentra en el contenedor o el protocolo de análisis de la resina y expresada en mmol/g. Puede utilizarse la siguiente fórmula para calcular el peso de la resina:</li>
	<li>Cuidadosamente pesar resina del cloruro de 2-chlorotrityl (en nuestro caso la carga es ~0.85 mmol)</li>
	<li>Colocar la resina en un recipiente de sinterizado síntesis con las siguientes especificaciones: capacidad: 50 mL, Fritted Disc – 25 mm, porosidad – medio.</li>
	<li>Añadir 15 mL de diclorometano (DCM) a la resina.</li>
	<li>Coloque el recipiente de la síntesis de un agitador mecánico de velocidad variable (frasco agitador/agitador) y gire los vasos a un ángulo de 45° (u horizontalmente) para maximizar la agitación.</li>
	<li>Permitir que los granos de la resina se hinche durante 15 minutos hinchazón mejora el rendimiento de la reacción ya que facilita la difusión molecular y la accesibilidad al sitio activo, mejora de la eficiencia de acoplamiento.</li>
	<li>Añadir 8 equivalentes (2 mmol de escala 0.25 mmol) de la deseada poliaminas (espermina, espermidina, Diethyelenetriamine, diaminopropane 1, 3, etc.) a la resina y dejarlo reaccionar durante 5 h. Nota: Un menor período de reacción reduciría el rendimiento.</li>
	<li>Un Kaiser de prueba (véase Tabla de materiales) para confirmar el exitoso acoplamiento de la poliamina a la resina. Exitoso acoplamiento de las aminas primarias produce un color violeta/azul, que corresponde a la amina libre.</li>
	<li>Proteger el grupo de la amina primaria utilizando 4 equivalentes de 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), disueltos en metanol anhidro (15 mL), agitando la mezcla de reacción durante la noche11. Nota: Un menor tiempo de reacción reduce el rendimiento.</li>
	<li>Realice una prueba de Kaiser. La ausencia de color azul de la perla de resina confirma protección acertada. En caso de protección de la amina primaria, repita el paso anterior.</li>
	<li>El DCM de drenaje y lave las resinas dos veces con una mezcla de DCM y DMF (2:1, 15 mL).</li>
	<li>Disolver 20 equivalentes (5 mmol) de di-terc butil di-carbonato (Boc) en DCM (20 mL) y permitir la reacción proceder durante 3 horas.</li>
	<li>Hacer un cloranilo (véase Tabla de materiales) de prueba para confirmar la protección completa de la amina secundaria. Una prueba positiva (protección) produce un color amarillo claro o incoloro. Aminas secundarias gratis dan un color verde/azul oscuro, mientras que aminas primarias dan un color rojo.</li>
	<li>Escurrir la mezcla solvente y lavar dos veces con una mezcla de DCM y DMF (2:1, 15 mL).</li>
	<li>Añadir una solución al 2% de hidracina en DMF (10 mL) y agitar durante 1 hora.</li>
	<li>Hacer la prueba para confirmar éxito desprotección de la amina primaria un Kaiser.</li>
	<li>
Añadir el deseado aminoácidos en la secuencia inversa en el cual usted escribir o dibujarles. Péptidos son atraídos desde el termini N a la termini C pero se sintetizan en la dirección opuesta, C y N. Por ejemplo, para un PPA que requieren el siguiente péptido base - GLFD-, añadir el ácido aspártico (D), seguido de fenilalanina (F), leucina (L) y finalmente glicina (G). Nota: Para la mayoría de los aminoácidos, el siguiente Cóctel de acoplamiento es apropiado para la fijación en las resinas poliaminas cargado.<ol>
<li>Mezclar 4 equivalentes (1 mmol) de los aminoácidos Fmoc-protegido, 3,95 equivalentes de 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexaﬂuorophosphate (HBTU) y 15 equivalente de Amina diisopropylethyl (DIPEA).</li>
		<li>Disolver en una mezcla de DCM y DMF (1:1, 15 mL) y someter a ultrasonidos el cóctel por 2 min (hasta disolución completa).</li>
		<li>Espere un min de 3 a 5 adicional para asegurar la activación de los ácidos carboxílicos en el aminoácido.</li>
		<li>Añadir la mezcla de reacción a la embarcación. Llevar a cabo la reacción de 2-4 h a temperatura ambiente. Nota: Hemos encontrado los siguientes alternativas eficientes al HBTU (que generalmente requiere menos cantidad de los aminoácidos y el agente de acoplamiento): COMU, PyBOP, HATU, DIC/Oxima.</li>
		<li>Hacer la prueba para confirmar el acoplamiento exitoso un Kaiser.</li>
		<li>-Proteger el grupo Fmoc del aminoácido mediante la adición de una solución al 20% de 4-metil piperidina (10 mL) en DMF. Hacerlo dos veces, cada vez agitando la mezcla de reacción durante 15 minutos. Nota: Una alternativa eficiente para la eliminación de Fmoc es piperazina/DBU12.<ol>
<li>Realizar un lavado con DCM (15 mL) entre adiciones.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hacer la prueba para confirmar la protección acertada la del aminoácido un Kaiser.</li>
		<li>Lavar la resina a fin de eliminar los restos de 4-metil. Lavar la resina dos veces con DMF (10 mL), cada colada dura 5 min y finalmente con DCM (10 mL) durante 10 minutos.</li>
		<li>Añadir todos los aminoácidos restantes repitiendo sucesivamente el acoplamiento y protección de pasos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Finalmente, después de todos los aminoácidos necesarios, enganche, conjugar la cola hidrofóbica en el último aminoácido de la construcción de la poliamina-péptido:
	<ol>
<li>Añadir 10 equivalentes de la funcionalidad deseada ácido carboxílico 9,5 equivalentes de HBTU y 12 equivalentes de DIPEA disolución en mezcla de DCM y DMF (1:1, 20 mL). Nota: Tenga en cuenta que algunas colas pueden necesitar una diferente proporción de disolvente (generalmente un mayor % de DCM) o la adición de otro solvente como N-methylpyrrolidone (NMP).</li>
		<li>Someter a ultrasonidos el cóctel durante 5 – 10 minutos hasta disolución (hemos visto tarda más para la cola completamente disolver) y agregar al recipiente. Nota: Para colas que contienen múltiples sitios reactivos, deben ser protegidos antes acoplándolos.</li>
		<li>Llevar a cabo esta reacción (la cola hidrofóbica de acoplamiento) durante al menos 5 h, aunque es aconsejable llevarla a cabo durante la noche para el mayor rendimiento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PPA escote de soporte sólido
El propósito de este paso es la ruptura de la PPA de la resina y eliminar los grupos de protección Boc de los amino ácidos y residuos de poliaminas.
<ol><li>Lavar la resina con DMF (8 mL en 2 minutos) y dos veces con DCM (8 mL, cada vez durante 5 minutos). Antes de cada adición, drenar el solvente desde el buque. Una vez que se realiza el último lavado, seque la resina bajo vacío durante 15 minutos.</li>
	<li>Preparar la solución de escote usando la siguiente proporción de mezcla: 28:1:1 ácido trifluoroacético (TFA): H2O: Triisopropyl silano (TIPS). Para hacer 15 mL del escote cocktail añadir 14 mL de TFA, 0,5 mL de H2O y 0.5 mL de consejos.</li>
	<li>Añadir esta solución de escote a la resina y agitar por 2 – 4 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Recoger la solución en un 25 o matraz de fondo redondo de 50 mL.</li>
	<li>Concentrar la TFA en vacío a 1 – 2 mL utilizando un evaporador rotatorio a presión reducida y calentar la mezcla a 40 ° C (no superar los 55 ° C para evitar la descomposición de la PPA).</li>
	<li>Después de la evaporación, añadir la solución obtenida de TFA (gota a gota) a un matraz de fondo redondo que contiene éter anhidro frío (15 mL). Esto precipitará inmediatamente la PPA.</li>
	<li>Además, añadir éter anhidro frío (5 mL) al matraz original donde se concentraba el TFA.</li>
	<li>Someter a ultrasonidos este matraz para recuperar sólidos adicionales y para combinar con la solución de éter en el paso 2.6. Nota: Se puede lavar la pipeta de transferencia con un volumen pequeño de DCM. Evitar la introducción de DMF durante el proceso porque tiende a formar una gel como sustancia.</li>
	<li>Coloque el matraz (cubierto) dentro del refrigerador y déjela reposar durante la noche para maximizar la precipitación.</li>
	<li>Recoger el material precipitado por filtración de vacío utilizando un embudo de filtro de disco sinterizado. Los tamaños de poro ideal son finos o medios.</li>
	<li>Lavar el precipitado dos veces con éter frío (5-10 mL) para eliminar cualquier materia orgánica residual.</li>
</ol>3. identificación del producto crudo utilizando el método de la gota seca de MALDI
<ol><li>
Preparación de la matriz para el análisis en modo positivo:
	<ol>
<li>Para iniciar el análisis del peso molecular mediante espectrometría de masas matriz asistida por láser de desorción/ionización (MALDI), agregue 10 a 20 mg de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico a un tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Agregar una solución de agua/acetonitrilo (1:1, 1,0 mL) con 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA). Mezclar bien todo con un vórtex. Nota: Esta matriz debe utilizarse para péptidos cargados positivamente. Modo negativo MALDI es similar, pero requiere una matriz que contiene 9-aminoacridina con 0.1% amoníaco como solvente aditivo.</li>
		<li>Añadir 1-2 μl de la muestra a la placa de la blanco de acero inoxidable para MALDI y secar la muestra en aire. Añadir 1-2 μl de la matriz y secar otra vez. Nota: Las placas tienen marcas circulares cuadriculadas a lo largo de la placa de la blanco para ayudar a localizar el lugar en particular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizar las muestras en instrumento MALDI para verificar su identidad. Ionización por electrospray (ESI) es una alternativa válida para confirmar la identidad de las PPA.</li>
</ol>4. purificación de la PPA mediante la purificación de la reverso-fase preparativa alto rendimiento cromatografía líquida (HPLC)
<ol><li>
Disolver el precipitado de PPA en una mínima cantidad de agua y acetonitrilo.
	<ol>
<li>Como regla general, se disuelven 100 mg de PPA crudo seco en menos de 5 mL de acetonitrilo y agua. Más hidrofóbicos PPA podrían requerir un mayor porcentaje de acetonitrilo para disolver y también pueden requerir un volumen mayor de solvente en general, dependiendo de la carga neta de las PPA (tabla 1).</li>
		<li>Si la disolución completa no ocurre, agregar 1% TFA (ACN o H2O). También es posible añadir cantidades de rastro de otros disolventes compatibles incluyendo dimetilsulfóxido, metanol o isopropanol (limitar su contenido a un 5%).</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solvente</td>
			<td colspan="2">PPAs cargados positivamente</td>
			<td colspan="2">PPA con carga negativa</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">0.1% TFA en el agua</td>
			<td colspan="2">0.1% NH3 en el agua</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">0.1% TFA en ACN</td>
			<td colspan="2">0.1% NH3 en ACN</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: sistemas de solvente. Propuesta sistema de solventes para positivamente y negativamente cargados PPA.
<ol start="2"><li>Someter a ultrasonidos la PPA utilizando un sonicador cuerno por 20 min a 10 impulsos de s con Amp1 del 48% o de 2-3 h en un baño ultrasónico.</li>
	<li>
Luego, filtrar usando un filtro de jeringa de 0.45 μm seguido por filtración usando un filtro de jeringa de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0.20 μm. La solución PPA debe ser clara y libre de todos los materiales de partículas.
	<ol>
<li>Si la filtración es demasiado difícil, someter a ultrasonidos para un período prolongado de tiempo. Se recomienda que la solución de PPA es purificada inmediatamente después de la filtración de la jeringa, ya que un almacenamiento prolongado puede Agregar a gelate, que necesitarán volver a sonicación y, tal vez, la filtración.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durante y después de la purificación, utilizar solventes de grado HPLC o los que se filtran a través de un 0.25 μm jeringa filtro de membrana. Nota: Las condiciones solvente más común para purificar PPAs consisten en un gradiente de H2O y ACN.</li>
	<li>Utilizar un instrumento estándar de HPLC de fase inversa de este protocolo. Debe incluir un programador de gradiente de elución, un sistema binario de solvente, capaz de detectar en el 220 y 254 nm y un colector de fracciones programable de detección de UV. El caudal máximo debe ser 50 mL/min.</li>
	<li>Uso un C-18 invertida columna para separación de fase. Columnas de las siguientes dimensiones se pueden utilizar dependiendo de la masa del sólido se purifica y la red de carga de la PPA (tabla 2).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Carga de PPA</td>
			<td>Tamaño de partícula</td>
			<td>Tamaño de la columna</td>
			<td>Masa de crudo PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ ve cargadas</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>-ve cargadas</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ ve cargadas</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 21,2 mm</td>
			<td>90 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>-ve cargadas</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 21,2 mm</td>
			<td>90 mg</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: sugiere columnas: Dimensiones de columnas, tamaños de partícula y la capacidad de carga máxima por inyección para C18 columnas HPLC de fase reversa
<ol start="7"><li>Inyectar el PPA con un volumen determinado por tanto la capacidad de la columna y por el volumen del loop de inyección de la HPLC. Ejecutar el método de gradiente HPLC según la configuración que se observa en la tabla 3 (tiempo de elución de 40 min).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tiempo</td>
			<td>Solvente (acetonitrilo)</td>
			<td>B solvente (agua)</td>
			<td>Caudal (mL/min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
			<td rowspan="5">Velocidad de flujo depende de su tamaño y el embalaje de la columna.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
<tr>
<td>35</td>
			<td>95%</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>38</td>
			<td>100%</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: gradiente sugerida: Gradiente de fase inversa sugiere que muestra la composición relativa de agua vs acetonitrilo durante un período de tiempo. El caudal depende de las especificaciones de la columna.
<ol start="8"><li>
Analizar las fracciones recogidas en los diferentes tubos de ensayo usando MALDI y determinar que tubo (o tubos) contienen la PPA. Esto se evalúa estudiando el peso molecular encontrado en cada tubo.
	<ol>
<li>Compruebe la pureza de las fracciones en un HPLC analítico. Utilizar un sistema de HPLC-gradiente equipado con un detector de ultravioleta a 220 nm.</li>
		<li>Si hay impurezas, no un ciclo adicional de la purificación por HPLC. El degradado anterior utilizado para HPLC preparativa puede reducido para utilizar con el HPLC analítica utilizando la columna convertidor en línea de software. Cada fracción mucho ser ≥ 95% puro para la caracterización física o evaluación biológica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger las fracciones en un gran matraz o frasco de evaporación y retire el acetonitrilo y la mayoría del agua. La solución final de PPA debería ser no más de 10 mL.</li>
	<li>Transferir esta concentrado en un tubo de centrífuga de 50 mL. Tenga en cuenta que los PPA son sustancias detergente; así, se generarán burbujas durante la evaporación del disolvente. Hemos encontrado que la adición de alcohol etílico disminuye la formación de burbujas.</li>
	<li>Vacío concentrado concentrado. Durante la evaporación al vacío, una gran cantidad de la PPA podría adherirse a las paredes del recipiente. Recuperar esta enjuagando repetidamente la pared del matraz con agua HPLC. El volumen combinado de la PPA concentrada y el agua de enjuague debe ser no más de 30 mL.</li>
	<li>Colocar la solución acuosa dentro de un tubo de 50 mL.</li>
	<li>
Flash freeze esta solución PPA en nitrógeno líquido: Nota: Flash congelación resultados en pequeños cristales de hielo que se sublime más rápido en el liofilizador. Por otra parte, la congelación lenta puede permitir la formación de uno mismo-montado estructuras supramoleculares. Otra alternativa (pero menos deseable) es poco a poco se congela en un congelador de-80 ° C o congelar con un hielo seco + mezcla de acetona<ol>
<li>Antes de colocar el tubo de centrífuga en el liofilizador, perforar o afloje el tapón del tubo para permitir que la humedad escape la muestra y recogido en la unidad de refrigeración. Establezca la unidad de liofilización a-54 ° C y 0.016 mbar. Nota: Otra opción es quitar la tapa y colocar un paño (con una banda elástica) sobre la apertura. También, hemos encontrado que congelar las muestras en un ángulo o el hielo se rompe en pequeñas porciones permite una liofilización más rápida y mejor debido a un aumento en la superficie.</li>
		<li>Si el sólido empieza a fundirse, esto puede indicar que existen rastros de un solvente orgánico (generalmente acetonitrilo). Repita el paso congelación y evaluar la condición de liofilización.</li>
		<li>Si el deshielo continúa, hay dos posibles soluciones:<ol>
<li>Dividir la muestra en dos porciones (para ser colocados en tubos), diluir con agua y congelar otra vez. No utilice esta solución a menudo porque grandes cantidades de solventes orgánicos pueden dañar el equipo.</li>
			<li>Alternativamente, coloque la muestra en un matraz y más se evapora el solvente orgánico bajo vacío. Lyophilizing una muestra que está en la forma líquida generalmente conduce a golpes y la pérdida del recinto de las PPA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. almacenamiento de PPA
<ol><li>Guarde el PPA en a-20 ° C con las tapas apretadas y selladas con Parafilm en un tubo con una etiqueta apropiada.</li>
	<li>Antes de su uso, llevar la PPA a temperatura ambiente en una cámara de vacío para evitar la condensación del vapor de agua en el PPA.</li>
</ol>

<ol><li>Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+x-ray-triggered+crystallization+at+long+range+in+self-assembling+filament+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks.</a> Science. 327, 555-559 (2010).</li>
<li>Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+supramolecular+rigidity+of+peptide+fibers+through+molecular+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).</li>
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</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses

Los protocolos descritos aquí pueden utilizarse para sintetizar los PPA como pozos como PAs y relacionados con moléculas basadas en péptidos (como híbrido peptoides PA). Aunque la síntesis de péptidos mediante SPPS es un procedimiento sencillo, la síntesis de péptidos que contiene moléculas biológicas autoguiados hacia el blanco puede ser particularmente difícil. Poliaminas como espermina, espermidina, diethyelenetriamine, etc., pueden funcionar como moléculas autoguiados hacia el blanco para apuntar las células...

Anfífilos peptide uno mismo-montaje (PAs) son una clase de biomateriales, normalmente conformada de los siguientes segmentos: jefe (a) hidrofílico, (b) vinculador región y cola (c) hidrofóbica. PAs la mayoría descritos en la literatura poseen una cabeza hidrofílica compuesta por aminoácidos cargados o polares residuos1,2,3,4. PAs han encontrado una amplia gama de aplicaciones en biomedicina, incluyendo el suministro de medicamentos, diagnóstico de la enfermedad, medicina regenerativa, etc.5. De acuerdo con su secuencia de aminoácidos, PAs puede formar una variedad amplia de nanoestructuras como micelas esféricas, nano-filamentos. Recientemente hemos reportado una clase de híbrido péptido base poliamina Anfífilos, denominado PPA6. Las morfologías, cinética de la uno mismo-montaje y degradación metabólica, de estos biomateriales, fueron encontrados para ser relacionado con su grupo de cabeza solubilización. Por otra parte, las nanoestructuras de PPA no mostraron toxicidad hacia células de mamífero (líneas MiaPaCa2 y HeLa de la célula) en las concentraciones probadas. Nanocarriers basados en PPA son vehículos de fármaco atractivo porque: poliaminas (1) absorción y metabolismo se ha demostrado para ser aumentada en las células cancerosas, nanoestructuras (2) catiónico pueden lograr endosomal escape7,8, que conduce a mayor circulación y residencia dentro de una célula y (3) deben tener un perfil metabólico distinto en comparación con PA; por ejemplo, será más estables a las proteasas que se encuentran en el cuerpo humano (aunque ellos tal vez sensibles a otras enzimas, como oxidasas amina)9,10. Además, los PPA se han encontrado diversas morfologías, propiedades fisicoquímicas, rigidez de nanopartículas y cinética de montaje dependiendo de la longitud y la carga de cada molécula de PPA6. Adjunto, describimos un protocolo detallado de síntesis, identificación y purificación de los PPA que puede aplicarse también a la preparación de PAs o moléculas de péptidos híbridos similares.
Porque poliaminas no están comúnmente disponibles en el mercado en sus formas protegidas y porque proteger las aminas primarias y secundarias de poliaminas es de suma importancia para conjugar con los aminoácidos y otras moléculas, hemos descrito el medidas sintéticas para lograr su protección. El objetivo general de este protocolo es proporcionar un método simple para conjugar poliaminas a aminoácidos. Poliaminas carecen de un grupo carboxílico; por lo tanto, no puede acoplarse a pista de amida o resinas de Wang. En cambio, resinas como el cloruro de 2-chlorotrityl se recomiendan el protocolo sintético. El desafío principal para la síntesis de la PPA es la presencia de grupos funcionales de aminas primarias y secundarias. Para nuestros propósitos, hemos protegido todas las aminas secundarias de la poliamina manteniendo el grupo amino primario de la poliamina libre permitir la reacción de acoplamiento. La reacción se realizó sobre un soporte sólido siguiendo los principios de síntesis de péptidos de fase sólida (SPPS) para facilitar el trabajo después de cada etapa de acoplamiento y desprotección. El protocolo siguiente es para la síntesis manual y automatizada de PPAs (aunque la verificación de algunos pasos será difícil en un sistema automatizado). La síntesis de estas moléculas puede también ser realizada en un sintetizador automático o con la ayuda de un reactor de microondas (automático o semiautomático). El esquema de la reacción ha sido resumido en la figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57908/57908fig1.jpg"> Figura 1: (A) A esquema general de la reacción para la síntesis de los PPA. Poliaminas representante (B) que pueden utilizarse para sintetizan PPAs se describe aquí. <a href="/files/ftp_upload/57908/57908fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>2-Resina de cloruro de clorotritilo &nbsp;</td><td>Recipiente de síntesis AappTec</td><td>RTZ001</td><td></td></tr><tr><td>SynthwareTM&nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>SYNP120050M</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Acros AC406920250</td><td></td><td>Fisher Sci. Catálogo #</td></tr><tr><td>Wrist Shaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>401000-2</td><td></td></tr><tr><td>Kit de prueba Kaiser</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>2-[(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno)etil-amino]-etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS004772</td><td></td></tr><tr><td>Metanol anhidro</td><td>Acros</td><td>AC610981000</td><td>Fisher Sci. Catálogo #</td></tr><tr><td>Kit de prueba de cloranil</td><td>TCI</td><td>TCC1771-KIT</td><td>Catálogo VWR #</td></tr><tr><td>Di-tert dicarbonato de butilo&nbsp;</td><td>Acros</td><td>AC194670250</td><td>Fisher Sci. Catálogo #</td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td></td></tr><tr><td>Hidracina</td><td>Acros</td><td>AC296815000</td><td>FIsher Sci. Catálogo #</td></tr><tr><td>(2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametileluronio hexafluorofosfato)</td><td>p3biosystems</td><td>31001</td><td></td></tr><tr><td>4-metilpiperidina&nbsp;</td><td>Acros</td><td>AC127515000</td><td>FIsher Sci. Catálogo #</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>AappTec</td><td>CXZ035</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropil Silano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td>&alpha<td></td></tr><tr><td>;-Ciano-4-hidroxicinámico</td><td>ácido Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>9-Aminoacridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92817</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Filtros de jeringa: Membrana de PTFE</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-730-21</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo fácil para la síntesis de uno mismo-montaje base poliamina péptido anfífilos (ppas) y relacionados con biomateriales

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) and Related Biomaterials

Base poliamina péptido Anfífilos (PPA) son una nueva clase de uno mismo-montaje anfifílicas biomateriales relacionadas con el péptido Anfífilos (PAs). Tradicionales PAs poseen aminoácidos cargados como grupos (lisina, arginina), que están conectados directamente a un segmento de lípidos o pueden contener una región vinculador de los aminoácidos neutros de solubilización. Ajuste de la secuencia del péptido de PAs puede producir diversas morfologías. Asimismo, los PPA poseen un segmento hidrofóbico y aminoácidos neutros, pero también contienen poliamina moléculas como el agua (hidrofílicos) grupos de solubilización. Como es el caso de PAs, PPA también pueden uno mismo-montar en diversas morfologías, incluyendo barras pequeñas, trenzados cintas de nano y fundidas hojas de nano, cuando está disuelto en agua. Sin embargo, la presencia de aminas primarias y secundarias en una molécula de poliamina solo plantea un desafío significativo al sintetizar los PPA. En este documento, se muestra un protocolo simple, basado en precedentes de la literatura, para lograr una síntesis fácil de PPA usando síntesis peptídica en fase sólida (SPPS). Este protocolo puede ampliarse a la síntesis de PAs y otros sistemas similares. También ilustran los pasos que son necesarios para el escote de la resina, la identificación y la purificación.

Después de la síntesis y purificación y antes de la evaluación físico-química o biológica, se recomienda las masas de las PPA son comprobarse y la pureza comprobada mediante análisis de HPLC. Caracterización de materiales o evaluación biológica, PPA tiene que tener una pureza de &gt; 95%. La figura 2 muestra los espectros MALDI (abajo) confirmando la presencia del producto y del rastro HPLC (arriba). Sistemas de análisis de HPLC integran el área bajo la curva...

La síntesis del péptido base poliamina Anfífilos (PPA) es un reto importante debido a la presencia de múltiples nitrógenos de Amina, que requiere un uso juicioso de la protección de los grupos para enmascarar estas funcionalidades reactivas. En este papel, describimos un método fácil para la preparación de estas nueva clase de moléculas de uno mismo-montaje.

Protocolo fácil para la síntesis de uno mismo-montaje base poliamina péptido Anfífilos (PPAs) y relacionados con biomateriales

Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) are a new class of self-assembling amphiphilic biomaterials-related to the peptide amphiphiles (PAs). ...

Este método puede responder a preguntas clave sobre cómo decorar anfifilos peptídicos a poliaminas y sobre el uso de grupos protectores octogonales La principal ventaja de esta técnica es que se pueden generar anfífilos peptídicos híbridos con bloques de construcción químicos no protegidos que contienen múltiples lados reactivos. Los que demuestren el procedimiento serán Mehdi, Nathalia y Krishnaiah, estudiantes de laboratorio del Laboratorio Conda Sheridan. Primero, pese cuidadosamente la resina de cloruro de 2-clorotritilo y coloque la resina en un recipiente de síntesis fritado, de porocidad media, con una capacidad de 50 mililitros.A continuación, fije el recipiente de sinétesis a un agitador mecánico de velocidad variable y gire el recipiente en un ángulo de 45 grados para maximizar la agitación. A continuación, añade 15 mililitros de DCM a la resina. Después de dejar que las perlas de resina se hinchen durante 15 minutos, agregue ocho equivalentes de la poliamina deseada a la resina y deje que reaccione durante cinco horas.Después de cinco horas, realice una prueba kaiser para confirmar una reacción exitosa de la poliamina a la resina. A continuación, proteja el grupo amina primario añadiendo cuatro equivalentes de DDE en metanol anhidro y agitando la mezcla de reacción durante la noche. Al día siguiente, realice una prueba kaiser para confirmar el éxito de la protección por la ausencia de color azul de la perla de resina.A continuación, escurre el DCM y lava la resina dos veces con una mezcla de dos a uno de DCM y DMF. Ahora, agregue 20 equivalentes de anhídrido Boc en DCM a la resina y deje que la reacción continúe durante tres horas. Después de realizar una prueba de cloranil para confirmar la protección de la amina secundaria, drene la mezcla de solventes y lave la resina dos veces con una mezcla de dos a uno de DCM y DMF.A continuación, agregue 10 mililitros de una solución al 2% de hidracina en DMF a la resina. Después de agitar durante una hora, realice una prueba de Kaiser para confirmar la desprotección exitosa de la amina primaria. A continuación, mezcle cuatro equivalentes del aminoácido protegido por Fmoc, 3,95 equivalentes de HBTU y 15 equivalentes de DIPEA.Agregue una mezcla uno a uno de DCM y DMF y sonique el cóctel hasta la disolución completa. Asegúrese de que el aminoácido, el agente de acoplamiento y el DIPEA estén realmente mezclados y activados antes de agregar la mezcla a la resina. Después de esperar de tres a cinco minutos para asegurar la activación del ácido carboxílico, agregue la mezcla de reacción al recipiente que contiene la resina y deje que la reacción continúe durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente.Realice una prueba de káiser o cloranil en cada paso para confirmar el acoplamiento exitoso. Después de realizar una prueba de Kaiser para confirmar el acoplamiento exitoso, desproteja el grupo Fmoc del aminoácido agregando 10 mililitros de una solución al 20% de 4-metilpiridina en DMF. Una vez finalizada la reacción, realice una prueba kaiser para confirmar el éxito de la desprotección del aminoácido.A continuación, lava la resina dos veces con 10 mililitros de DMF cada lavado de 5 minutos, y finalmente con 10 mililitros de DCM durante 10 minutos. Después de acoplar todos los aminoácidos requeridos, conjugue la cola hidrofóbica con el último aminoácido agregando 10 equivalentes de la funcionalidad de ácido carboxílico deseada a 9.5 equivalentes de HBTU y 12 equivalentes de DIPEA. Sonicar el cóctel hasta la disolución completa, luego agregar el cóctel al recipiente.Llevar a cabo la reacción durante al menos cinco horas, aunque es recomendable realizarla durante la noche para obtener el mayor rendimiento. Lavar la resina con ocho mililitros de DMF durante dos minutos, y dos veces con ocho mililitros de DCM durante cinco minutos. Antes de cada adición, drene el solvente del recipiente.Una vez realizado el último lavado, seca la resina al vacío durante 15 minutos. Para preparar 15 mililitros de cóctel de escote, agregue 14 mililitros de TFA a 0,5 mililitros de agua y 0,5 mililitros de triisopropilsilano. Agregue este cóctel de escote a la resina y agite durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente.Una vez completada la reacción de escisión, recoja la solución en un matraz de fondo redondo de 50 mililitros. A continuación, concentre el AGT en vacío a uno o dos mililitros utilizando un evaporador rotativo a presión reducida, mientras calienta la mezcla a 40 grados centígrados Después de la evaporación, añada la solución de AGT obtenida, gota a gota, a un matraz de fondo redondo que contenga 15 mililitros de éter frío anhidro para precipitar el PPA. A continuación, añada 5 mililitros de éter frío anhidro al matraz original que contiene la solución concentrada de TFA.Sonicato para recuperar sólidos adicionales. Luego, combínelo con la solución de éter del paso anterior. Cubra el matraz y colóquelo dentro del refrigerador durante la noche para maximizar la precipitación.Al día siguiente, recoja el material precipitado por filtración al vacío utilizando un embudo de filtro de disco central de tamaño de vertido fino o mediano. Finalmente, lave el precipitado dos veces con cinco a diez mililitros de éter frío para eliminar cualquier residuo orgánico. La traza de HPLC y el espectro MALDI confirman la presencia del producto PPA, que debe tener una pureza superior al 95% para la caracterización del material o la evaluación biológica.Se observa un solo pico agudo en la traza de HPLC basada en UV y el espectro MALDI corresponde al del peso molecular calculado del PPA dentro de más o menos un dalton. El autoensamblaje de los PPA se puede visualizar y analizar mediante microscopía electrónica de transmisión, microscopía de fuerza atómica, dispersión de rayos X de ángulo pequeño, microscopía electrónica de barrido y dispersión dinámica de luz. El autoensamblaje exitoso dará como resultado nanoestructuras bien definidas, tanto en microscopía electrónica de transmisión como en microscopía de fuerza atómica.Una vez dominado, este protocolo se puede realizar en tres días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, recuerde purificar los productos y evaluar su pureza antes de cualquier estudio posterior. Siguiendo este procedimiento, se pueden preparar otras moléculas, como péptidos anfifílicos, péptidos e híbridos péptido-poliamina.Después de su desarrollo, esta técnica ayuda a la investigación en el campo de los anfifilos peptídicos de autoensamblaje para explorar la influencia de las nanoestructuras de poliaminas en áreas como la administración de fármacos, la obtención de imágenes o la catálisis Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo llevar a cabo la síntesis de anfifilos peptídicos a base de poliaminas y anfifilos peptídicos relacionados. El ácido trifluoroacético y la 4-metilpiridina pueden ser peligrosos, y se deben tomar precauciones como el uso de guantes, batas de laboratorio y trabajar en la campana extractora mientras se realiza este procedimiento.

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Investigación

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Chemistry

Química

Un simple y general método manual peptoide síntesis referida a un equipo y reactivos básicos, disponibles en el mercado se perfila, lo que permite peptoides para ser fácilmente sintetizada en la mayoría de los laboratorios. La síntesis, purificación y caracterización de un 36mer peptoide anfifílicas se describe, así como su auto-ensamblaje en muy ordenada nanoláminas.

En fase sólida Submonomer Síntesis de Polímeros peptoide y su auto-ensamblaje en altamente ordenadas nanoláminas

En este trabajo se describe la formación de estructuras a base de péptidos altamente ordenadas por el proceso espontáneo de auto-ensamblaje. El método utiliza péptidos disponibles comercialmente y equipo de laboratorio común. Esta técnica se puede aplicar a una gran variedad de péptidos y puede conducir al descubrimiento de nuevos conjuntos basados ​​en péptidos.

Formación de estructuras biomoleculares ordenada por el auto-ensamblaje de péptidos cortos

Presentamos un nuevo hidrogel de poliacrilamida, llamado hidroxi-Paam, que permite una unión directa de las proteínas ECM con costo o experiencia mínima. La combinación de hidroxi-Paam hidrogeles con impresión por microcontacto facilita el control independiente de muchas señales del microambiente celular natural para el estudio de mechanostransduction celular.

Preparación de hidroxi-Paam hidrogeles para desacoplar los efectos de mecanotransducción Cues

Amidas terciarias péptido (PTA) son una superfamilia de peptidomiméticos que incluyen pero no se limitan a péptidos, peptoides y péptidos N-metilado. Aquí se describe un método de síntesis que combina estrategias de sub-monómero división y piscina y para sintetizar un solo grano de la biblioteca de un compuesto de las PTA.

Síntesis Split-y-piscina y caracterización del péptido Terciario Amida Biblioteca

Se presenta un protocolo para sintetizar peptoides con funcionalidad catiónica mixta en la misma secuencia (monómeros de tipo lisina y arginina). También se describen los ensayos posteriores de estos compuestos contra Leishmania mexicana, los parásitos protozoarios causantes de la leishmaniasis cutánea.

Un método eficaz para la síntesis de peptoides con monómeros de tipo mixto lisina / arginina del tipo y la evaluación de su actividad anti-Leishmania

Divulgamos los protocolos para la síntesis y purificación de oligómeros del péptido de ácido nucleico (PNA) incorporando modificado residuos. Se describen los métodos bioquímicos y biofísicos para la caracterización del reconocimiento de dúplex RNA por las PNAs modificados.

Reconocimiento de secuencia específica y selectivo de RNAs de doble cadena sobre ARN monocatenario de modifica químicamente los ácidos nucleicos péptidos

Un protocolo para la síntesis de un 1, 2-dithiolane modificada de péptidos y la caracterización de las estructuras supramoleculares resultantes del peptide uno mismo-Asamblea.

Síntesis y caracterización de 1, 2-Dithiolane modifican uno mismo-montaje de péptidos

Este protocolo describe un método eficiente para sintetizar una nanoemulsión de un conjugado de ácido oleico acids-platinum(II) estabilizado con un tripéptido de lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Las formas de nanoemulsión condiciones suaves sintético a través de autoensamblaje de lo KYF y el conjugado.

Una nanoemulsión tripéptido-estabilizado del ácido oleico

Se presenta un protocolo para la síntesis de oligómeros peptoides codificados con información y para el autoensamblaje dirigido por secuencia de estos peptoides en escaleras moleculares utilizando aminas y aldehídos como pares reactivos covalentes dinámicos y Lewis de tierras raras ácidas metal triflos como reactivos multifunción.

Síntesis de peptoides que llevan información y su autoensamblaje covalente dinámico dirigido por secuencia

Este artículo proporciona protocolos para el diseño y autoensamble de nanoestructuras a partir de oligómeros de ácido nucleico modificados gamma en mezclas de disolventes orgánicos.

Autoensamble de ácidos nucleicos de péptidos modificados con gamma en nanoestructuras complejas en mezclas de disolventes orgánicos

Este protocolo presenta tres métodos de preparación rápidos y sencillos que utilizan las condiciones ambientales para desencadenar el autoensamblaje de péptidos en hidrogeles. Además, se describe la caracterización de los hidrogeles peptídicos, demostrando que se pueden formar hidrogeles peptídicos mecánicamente estables en estas sencillas condiciones.

Preparación de hidrogeles de péptidos autoensamblados mecánicamente estables

Aprende a sintetizar anfífilos peptídicos basados en poliaminas (PPAs) mediante un método simplificado que utiliza bloques químicos sin proteger. Esta técnica facilita la creación de biomateriales híbridos para aplicaciones en nanotecnología.

Protocolo fácil para la síntesis de uno mismo-montaje base poliamina péptido Anfífilos (PPAs) y relacionados con biomateriales

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