Un método simple para imágenes Arabidopsis Uso de hojas perfluorodecalina como un medio de imágenes infiltrativas

Se describe el uso de perfluorodecalina como un medio de infiltración de montaje. Este es un método sencillo para mejorar la profundidad de la imagen en

El objetivo general de este procedimiento es minimizar la degradación de las imágenes biológicas causada por los espacios aéreos en las hojas de las plantas para adquirir imágenes más claras de las células vivas dentro de la hoja. Si la hoja está montada en un medio de montaje acuoso y un fluoróforo es excitado por un láser, muchos espacios de aire sin llenar y cambios en el índice de refracción dentro del tejido que se muestran en naranja limitan la fuerza de la señal profunda desde el interior del tejido en la imagen resultante. Si, en cambio, la hoja se monta en un revestimiento de flúor o PFD, la excitación láser resultante del fluoróforo es menos atenuada y permite una mejor transmisión de las señales emitidas.

En última instancia, el uso de la microscopía confocal láser de barrido con el medio de montaje PFD proporciona imágenes claras de las células vivas dentro de la hoja de la planta a una profundidad que es más del doble de la posible cuando se utiliza un medio de montaje acuoso. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la fijación o el montaje de hojas y medios acuosos, es que reduce la refracción dentro del relleno meso y permite obtener imágenes más precisas de las células vivas más profundas dentro de la hoja, que se ha convertido en problemática. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la ciencia de las plantas, como abordar el meso relleno, la biología celular y la señalización in vivo, la colonización de las hojas por patógenos y las interacciones de relleno de patógenos, aunque este método puede proporcionar información sobre la biología fundamental de las plantas.

También se puede aplicar a otros tejidos altamente refractivos que son ricos en espacio aéreo, como las espirales de insight o el pulmón de los vertebrados. Para demostrar este procedimiento estará el Dr. George Littlejohn de mi laboratorio To Mount Leaf. Las muestras en PFD comienzan preparando un portaobjetos de microscopio con una junta permeable al gas de polidimetilo Sloane o P-D-M-S-P-D-M-S es un polímero viscoelástico que se puede moldear para proporcionar una cámara adaptada a los requisitos experimentales.

Equilibre el PFD con aire agitando un pequeño volumen de PFD en una botella llena de aire. Esto también se puede lograr haciendo burbujear aire a través del PFD a continuación, decantando el PFD en una placa de Petri abierta y haciendo flotar una plántula entera o una hoja de impuestos especiales sobre el líquido durante cinco minutos. El tejido debe volverse translúcido, lo que recuerda al tejido vitrificado.

Las hojas pueden parecer más oscuras o más claras que antes de la exposición a la PFD, dependiendo de las condiciones de iluminación y la edad del tejido utilizado. Finalmente, llene la cámara de PDMS con PFD aero equiparado y transfiera cuidadosamente las muestras de tejido de la placa de Petri de incubación a la cámara de PDMS. Selle la corredera con una cubierta, un deslizamiento y una imagen.

De acuerdo con los requisitos experimentales, las hojas de meses se incubaron durante cinco minutos en una suspensión de proteína verde fluorescente recombinante o GFP. En PFD, la inspección microscópica de muestras de hojas incubadas con PFD muestra que la mayoría de los espacios de aire están inundados con GFP recombinante suspendido en PFD. La GFP está en verde, y el rojo representa la clorofila, la fluorescencia de lotto y las células de relleno meso.

Es evidente que la hoja se inunda durante la incubación con PFD, pero que pueden quedar bolsas de aire ocasionales. El agua no inunda la hoja en estas condiciones. Aquí, las hojas de Opsys que expresan Venus, una variante de YFP, que se localiza en el citosol se incuban y se montan en aire, agua o escaneo láser PFD. La microscopía confocal de las muestras muestra una ventaja de la PFD sobre el aire y el agua, con un aumento aproximado del doble en la profundidad de las imágenes.

Al comparar el PFD y el agua Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco a 10 minutos si se realiza correctamente. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que el delin periférico disuelve el esmalte de uñas y el teflón, pero es compatible con la grasa de silicona. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar per fluro delin como medio de montaje para mejorar la imagen en las células de las hojas de las plantas.

No olvide que, si bien el per fluoro delin no es tóxico, recomendamos que se adopten prácticas de seguridad estándar al realizar este procedimiento.