Un método simple para imágenes Arabidopsis Uso de hojas perfluorodecalina como un medio de imágenes infiltrativas

El objetivo general de este procedimiento es minimizar la degradación de las imágenes biológicas causada por los espacios aéreos en las hojas de las plantas, con el fin de obtener imágenes más nítidas de las células vivas dentro de la hoja. Si la hoja se monta en un medio acuoso y un fluoróforo se excita mediante un láser, muchos espacios aéreos no llenos y los cambios en el índice de refracción dentro del tejido, mostrados en naranja, limitan la intensidad de la señal procedente de las regiones profundas del tejido en la imagen resultante. Si, en cambio, la hoja se monta en perfluorodecalina (PFD), la excitación láser resultante del fluoróforo se atenúa menos y permite una mejor transmisión de las señales emitidas.

En última instancia, el uso de microscopía confocal con barrido láser y el medio de montaje PFD proporciona imágenes nítidas de células vivas dentro de la hoja de la planta a una profundidad que es más del doble de la posible cuando se utiliza un medio de montaje acuoso. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la fijación o el montaje de hojas con medios acuosos es que reduce la refracción dentro del parénquima en empalizada y permite una visualización más precisa de células vivas más profundas en la hoja, lo cual ha sido un problema hasta ahora. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la ciencia de plantas, como abordar el parénquima en empalizada, la biología celular y la señalización in vivo, la colonización de hojas por patógenos y las interacciones entre patógenos y parénquima, aunque este método también puede aportar información sobre la biología vegetal fundamental.

También puede aplicarse a otros tejidos altamente refractivos que son ricos en espacios aéreos, como las espirales intestinales o el pulmón de vertebrados. Esta técnica será demostrada por el Dr. George Littlejohn de mi laboratorio To Mount Leaf. La preparación de muestras en PFD comienza con la elaboración de una preparación microscópica que incluya una junta permeable a los gases, hecha de poli(dimetilsiloxano) o P-D-M-S. El P-D-M-S es un polímero viscoelástico que puede moldearse para crear una cámara adaptada a los requisitos experimentales.

Equilibre el PFD con aire agitando un pequeño volumen de PFD en un frasco lleno de aire. Esto también puede lograrse burbujeando aire a través del PFD a continuación, decante el PFD en una placa de Petri abierta y coloque a flote una plántula entera o una hoja seccionada sobre el líquido durante cinco minutos. El tejido debe volverse translúcido, similar a un tejido vitrificado.

Las hojas pueden aparecer más oscuras o más claras que antes de la exposición al PFD, dependiendo de las condiciones de iluminación y de la edad del tejido utilizado. Finalmente, llene la cámara de PDMS con PFD equilibrado con aire y transfiera cuidadosamente las muestras de tejido desde la placa de Petri de incubación hasta la cámara de PDMS. Selle el portaobjetos con un cubreobjetos e image.

Según los requisitos experimentales, hojas de meses de edad fueron incubadas durante cinco minutos en una suspensión de proteína verde fluorescente recombinante o GFP. En el examen microscópico de muestras de hojas incubadas en PFD, se observa que la mayoría de los espacios aéreos están inundados con GFP recombinante suspendida en PFD. La GFP aparece en verde, y el rojo representa la clorofila, la fluorescencia lotto y las células del mesófilo delits.

Es evidente que la hoja se inunda al incubarla con DFP, pero que pueden quedar bolsas ocasionales de aire. El agua no inunda la hoja bajo estas condiciones. Aquí, hojas de opsys que expresan Venus, una variante de YFP, que se localiza en el citosol, se incuban y montan en aire, agua o DFP para escaneo láser. La microscopía confocal de las muestras muestra una ventaja del DFP frente al aire y al agua, con un aumento aproximado de dos veces en la profundidad de imagen.

Al comparar PFD y agua, una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco a diez minutos si se realiza adecuadamente. Durante la realización de este procedimiento, es importante recordar que el perfluorodecalina disuelve el esmalte de uñas y el teflón, pero es compatible con la grasa de silicona. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el perfluorodecalina como medio de montaje para mejorar el análisis de imágenes en células de hojas de plantas.

No olvide que, aunque el perfluorodecalina es no tóxico, se recomienda adoptar las prácticas estándar de seguridad al realizar este procedimiento.