Name: Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprende a medir la fuerza proteólisis a nivel de molécula única usando pinzas magnéticas con colágeno y MMP-1. Este método paralelo y rentable permite estudiar el efecto de la carga mecánica en la actividad enzimática.

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Este trabajo fue apoyado por el premio a la Trayectoria Burroughs Wellcome en la interfaz de la Ciencia (ARD), los Institutos Nacionales de Salud a través de Nuevo Director del NIH Programa Premio a la Innovación 1-DP2-OD007078 (ARD), el William Bowes, Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), y el Instituto Cardiovascular de Stanford beca predoctoral Joven (JC). Los autores agradecen a James Spudich por el préstamo de equipos de microscopía.

1. Flujo de Preparación de la célula <ol><li> Cubreobjetos (# 1.5, 22x22 mm y 22x40 mm, VWR) se limpian con ultrasonidos. <ol><li> Añadir los cubreobjetos a un pequeño envase de cristal capaz de mantener cubreobjetos y equipamiento en el baño de ultrasonidos (ver paso 2). </li><li> Llenar el recipiente con isopropanol y sonicar en un sonicador de baño durante 20 minutos. </li><li> Deseche el isopropanol y lavar los cubreobjetos con grandes cantidades de agua desionizada producida por un aparato de Barnsted MilliQ o dispositivo similar. Llene el recipiente con agua y déjelos en remojo durante 20 minutos. </li><li> Después de ultrasonidos, secar los cubreobjetos en una corriente de agua filtrada, libre de polvo del aire. Utilice sólo los que aparecen cubreobjetos limpio (es decir, sin manchas). </li><li> Con cuidado la llama de los cubreobjetos durante unos segundos para limpiarlos de cualquier resto de polvo y la humedad: pasar los cubreobjetos a través de una llama de gas que se produce con un mechero Bunsen, teniendo cuidado de no deformar el cubreobjetos, debido al exceso de calor. Este paso elimina residual en la superficiecontaminantes. </li></ol></li><li> Utilizando cinta de doble cara adhesiva, fije los dos cubreobjetos juntos. Corte la cinta ~ 3 cm de longitud y 0,3 cm de ancho. Coloque la cinta sobre el cubreobjetos mm 22x40 dejando un canal cm 1,6 en el medio. Utilice una punta de pipeta para presionar suavemente sobre el cubreobjetos para asegurarse de que la cinta se ha adherido correctamente. </li></ol> 2. Configuración magnética Pinzas y Calibración <ol><li> Pinzas magnéticas eran de configuración usando permanentes imanes de tierras raras como se describió anteriormente 10,12. Un soporte de aluminio L-fue construido con un orificio de 1 mm de diámetro y montado sobre un eje vertical Z-traductor (Thorlabs) para modular la altura de las pinzas. Dos permanentes imanes de tierras raras se adjunta a la ménsula a cada lado de la estenopeica para crear la trampa magnética (Figura 1). </li><li> Preparación de ADN: ADN de fago lambda marcado en su extremo 5 'y 3' termina con biotina y digoxigenina (IDT ADN, San Diego, CA) se utiliza para calibrar la magnitudpinzas de genética. <ol><li> Mezclar 50 l de 4 nM λ-DNA con 2 l de 40 nM biotina oligonucleótido conjugado y se calienta a 60 ° C durante 10 minutos. Luego enfriar lentamente a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Añadir ADN ligasa de acuerdo con las especificaciones del fabricante y ligar a temperatura ambiente durante 3 horas. </li><li> Añadir 2 l de 400 nM oligonucleótido digoxigenina conjugado e incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos. </li><li> Añadir 1,5 l de 10 mM de ATP y continuar ligación del oligonucleótido conjugado con digoxigenina a la λ-DNA durante 3 horas. </li><li> Retire el exceso de los oligonucleótidos y la ADN ligasa con 100 filtros de espín kDa (Microcon Ultracell YM-100). Un total de intercambio de tampón de 1000 veces en buffer TE es suficiente para eliminar el exceso de los oligos. Nota: Es importante no utilizar velocidades de centrifugado&gt; 500xG porque va a llevar a la rotura del ADN. </li><li> Examinar una muestra del ADN mediante electroforesis en un gel de agarosa 0,7% para asegurar que el ADN is no desnaturalizado o cortadoras. </li><li> Medir la concentración de ADN. El uso de un Nanodrop UV-Vis espectrómetro (Thermo Scientific) se recomienda ya que el volumen de muestra disponible puede ser muy pequeña. </li></ol></li><li> Prepare las celdas de flujo como se describe en la sección 1. </li><li> Para la fijación del ADN a la celda de flujo, añadir anticuerpos anti-digoxigenina (IgG de oveja; 1 mg ml -1; Roche Bioscience, Manheim, Alemania) y permitir que se adhieren a la superficie de vidrio durante 15 minutos. </li><li> Pasivar la superficie de la celda de flujo para evitar que se pegue no específica de ADN mediante la adición de 2 mg ml -1 de BSA, 0,1% de Tween-20 en PBS 1x. Incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos. </li><li> Repita el paso 2.5. </li><li> Añadir 50 pM de fuctionalized λ-DNA y permiten asociar al cubreobjetos durante 15 minutos. </li><li> Eliminar el exceso de ADN con 1x PBS. </li><li> Añadir streptavidina revestida de piedras superparamagnéticas (1 cuentas micras = 2 mg ml -1; 2,8 micras cuentas = 20 mg ml -1 </li><li> Eliminar el exceso de cuentas con 1x PBS. </li><li> La calibración magnética Pinzas <ol><li> Mueva los imanes permanentes a una posición que está lejos de la superficie de la muestra (&gt; 15 mm). </li><li> Colocar la celda de flujo preparada en el microscopio. </li><li> Mueva los imanes permanentes en su posición por encima de la celda de flujo. </li><li> Elegir el plano focal de cuentas de ADN λ-funcionalizados, centrándose en las cuentas de distancia de las dos superficies de vidrio. El plano focal correcta es aquella en la que las perlas deseadas tienen un centro brillante. </li><li> Tome un video de movimiento cordón a 80 Hz o superior a 500 marcos. </li><li> Mueva el imán más cerca de la superficie de la muestra. Para distancias más allá de 5 mm, se mueven en incrementos de 1 mm. Para distancias de entre 1 y 5 mm, se mueven en incrementos de 0,5 mm. Para distancias de menos de 1 mm, se mueven en incrementos de 0,25 mm. </li><li> Repita los pasos 2.11.5 y 2.11.6 en cada posición del imán nuevo. </li><li> Para cada conjunto de datosestablecido, rastrear el centro de las perlas usando un ajuste 2D gaussiana. </li><li> Calcular la fuerza a través de las fluctuaciones browniano con: </li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Ecuación 1"> donde k B T es la energía térmica de Boltzmann, L es la longitud de λ-DNA, y &lt;x 2&gt; es la variación en la posición centroide. <ol start="10"><li> Confirmar la exactitud de las fuerzas comprobando el cálculo de la fuerza a través de un espectro de ajuste de potencia de Lorentzian con el fin de encontrar la frecuencia de corte. Fuerza aplicada está relacionada con la frecuencia de corte por la relación: </li></ol><img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Ecuación 2"> Cuando 0 ƒ es la frecuencia de corte, uno es el radio de talón, y μ es la viscosidad del fluido 12. </li></ol> 3. El colágeno péptido adjunto a las celdas de flujo A fin de proporcionar un ejemplo concreto de aplicación de nuestra metodología, se describen los trabajos recientes en nuestro laboratorio que caracteriza a la proteolisis de un péptido de colágeno modelo trimérica. Creemos que este enfoque general se puede aplicar ampliamente a otras proteínas y polinucleótidos. <ol><li> El péptido modelo colágeno consta de un N-terminal de 6x Su etiqueta para la purificación, seguido por una etiqueta 5x myc, (CPE) 10 para hacer cumplir la formación de triple hélice, el colágeno a1 residuos 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), que forman la MMP- 1 sitio de reconocimiento, la secuencia foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), y un KKCK C-terminal para facilitar el etiquetado con biotina-maleimida. Foldon deriva de la proteína fibritin T4-fago, y se estabiliza trímeros de colágeno del modelo cuando se fusiona en cualquiera de la N - o C-terminal 13,14. </li><li> El péptido de colágeno y proteínas MMP-1 se expresa y se purificó como se describió anteriormente 4,15. &lt;/ Li&gt; </li><li> Añadir anti-myc (15 mg ml -1) a la celda de flujo y se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que el anti-myc para sujetar a la superficie de la celda de flujo. </li><li> Pasivar la celda de flujo para evitar fijación no específica de proteínas utilizando 5 mg mL -1 de BSA en la misma forma como se describe en el paso 2,5. </li><li> Añadir 150 péptido de colágeno pM y permitir que se conecte al anticuerpo a través de la etiqueta myc durante 45 minutos. </li><li> Eliminar el exceso de colágeno utilizando tampón PBS. </li><li> Añadir cuentas de streptavidin cubierto superparamagnéticas (1 cuentas micras = 2 mg ml -1 y 2,8 micras cuentas = 20 mg ml -1) y permitir que se adhieren a las moléculas de colágeno durante 45 minutos. Las perlas de 1 micras debe diluirse a la concentración deseada en PBS. Las perlas de 3 micras debe ser separado de la solución utilizando imanes fuertes, entonces resolubilizado en PBS. Este proceso debe ser repetido 3 veces. Nos dimos cuenta de que este paso es esencial para GEt las perlas 3 micras para unirse a la superficie inmovilizada péptido de colágeno. </li></ol> 4. Equipo de ensayo proteólisis <ol><li> Una vez que la celda de flujo se ensambla con el péptido de colágeno y perlas magnéticas, la imagen de la celda de flujo magnético en la trampa bajo bajo, ~ 1 fuerza pN. En nuestra experiencia, una subpoblación de las perlas es a veces débilmente adherido a la superficie en una forma no específica. La aplicación de la fuerza modesta asegura que estas perlas son liberados. </li><li> Añadir enzima activa a la celda de flujo. En este caso MMP-1 fue pre-activadas mediante la adición de 3,5 mM de APMA (4-aminofenilmercúrico acetato) y se incubaron a 37 ° C durante 3 horas. La activación se verificó mediante SDS-PAGE. </li><li> Tan pronto como la celda de flujo se vuelve a introducir en el aparato magnético pinzas, grabar un vídeo que abarca unos pocos campos de vista, dando típicamente varios cientos de perlas adjuntos. Esto será t = 0. </li><li> Repita el mismo proceso de grabación de varios campos de la vista (cuando regresaba to el mismo campo de visión) en los puntos regulares de tiempo, hasta que todas las cuentas de separar o no la proteólisis adicional es discernible. </li><li> Análisis de datos cinéticos <ol><li> Contar los granos en los diversos campos de la vista en momentos diferentes y un promedio de ellos. Normalizar el número de cuentas dividiendo el número medio de bolas en cada momento por el número de perlas en el instante t = 0. Esto asegura que podamos comparar las tasas de la proteólisis de distintos experimentos, debido a que el número absoluto de cuentas será diferente de experimento a experimento. </li><li> Trazar la relación como una función del tiempo. En este caso, se ajustaba a un decaimiento exponencial más una constante. </li></ol><img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Ecuación 3"> donde f (t) es la relación de las perlas unidas (o moléculas de colágeno unproteolyzed), t es el tiempo, una es la fracción de perlas unidas por una correa de sujeción colágeno, b es la tasa constante de desintegración, y ces la fracción de perlas que están unidos no específicamente. <ol start="3"><li> El mismo experimento se repitió en diferentes concentraciones y fuerza de MMP-1 para dilucidar el efecto de la fuerza en la proteólisis de colágeno por la MMP-1. </li></ol></li></ol> 5. Los resultados representativos El protocolo anterior describe un nuevo uso de pinzas magnéticas (Figura 1) para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis enzimática. Hemos calibrado las pinzas para 1 y 3 micras perlas micras utilizando tanto la magnitud de las fluctuaciones observadas browniano y el cálculo de la frecuencia de corte en las posiciones del imán diferentes (Figura 2). En los experimentos de fuerza proteolisis, la configuración es similar, excepto que el ADN se sustituye con colágeno (Figuras 3, 4). El número normalizado de perlas restantes se pueden representar como función del tiempo para encontrar las tasas de proteolisis (Figura 5), y este proceso puede serrepite para diferentes concentraciones de la enzima y las fuerzas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquemática del proceso de calibración trampa magnética (no a escala). Dos imanes permanentes de tierras raras crear un campo magnético que tira de la superparamagnético talón. Traducir el imán hacia arriba y abajo se ajusta la fuerza aplicada. Las cuentas se visualizan con un brillante convencional microscopio de campo con la luz que pasa a través de un agujero entre los dos imanes Recuadro:. Imagen tomada con un objetivo de 40x de aire. Los puntos cortantes, redondos corresponden a las perlas unidas a la superficie cubreobjetos. Los objetos fuera de foco son cuentas separadas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Los gráficos de la fuerza calibrada como una función de la distancia del imán de la superficie de la muestra durante 1 micras (izquierda) y 2.8 micras (derecha) de talóns. Los datos se ajustaron a la función empírica <img alt="Ecuación4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Ecuación4"> , Donde x es la distancia desde el imán. Una = 31,8, b = 5,61, y c = 4,39 para las perlas de 1 micras y con una = 140, b = 3,10 y c = 1,86 para los 3 perlas de micras. Estos valores son específicos para nuestro instrumento específico y la geometría experimental, y cada instrumento debe ser calibrado individualmente. Las barras de error en cada punto representa una variabilidad ~ 10% en la fuerza aplicada sobre un talón a base de bolas, debido a la variabilidad en el tamaño de talón. La fuerza aplicada es proporcional al volumen de las perlas, y el volumen de bolas varía ~ 9% con respecto a la media (de acuerdo con las especificaciones del fabricante). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Proteólisis Fuerza ensayo de la instalación (no a escala). El trímero modelo colágeno está unido a la superficie del cubreobjetos a través de myc / conjugación de anti-myc. Las perlas superparamagnéticas estreptavidina-revestidas se adjunta a los trímeros de colágeno a través de un enlace biotina-estreptavidina. Activada la MMP-1 corta el colágeno a través del tiempo, provocando que las perlas se desprenden de la superficie y se alejan del plano focal. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Dibujos animados esquemática de la proteolisis como una función del tiempo. La caricatura muestra un campo de muestra de vista con el tiempo, se produce la proteólisis. Con el tiempo, la MMP-1 cortes de colágeno y las perlas de la separe y se alejan del plano focal bajo la influencia del campo magnético. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Las tasas de la Figura 5. Proteólisis dependerá de la fuerza aplicada 16. Se muestran los datos recogidos en el 1,0 pN (3 mM MMP-1, el negro), 6,2 pN (3 mM MMP-1, roja) y 13 pN (0,2 mM MMP-1, magoNTA). Las tasas de proteólisis (parámetros de ajuste) son los siguientes: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min-1 (6,2 PN), y 2,08 ± 0,18 min-1 (13 PN). La fracción de perlas unproteolyzed en puntos de tiempo largos (&gt; 15 minutos) se mantiene aproximadamente constante a través de ~ 0,25 experimentos diferentes. Las barras de error corresponden a la estadística de Poisson que refleja el número de observaciones en cada momento. El error en cada punto de tiempo para perlas n es n 1/2. El error en la fracción de perlas unidas se calculó por error propagation.1 perlas micras fueron utilizados para experimentos y 1,0 pN 6.2 pN y 2,8 micras perlas fueron utilizados para experimentos pN 13.

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No hay conflictos de interés declarado.

Este protocolo se describe un nuevo uso para una sola molécula técnica clásica. Pinzas magnéticas permiten a medio y alto rendimiento de los ensayos de una sola molécula de una manera costo-eficiente. Sin embargo, como todas las técnicas experimentales que hay desafíos y peligros potenciales. Limitaciones de pinzas magnéticas En comparación con una trampa óptica de la resolución espacial y temporal de un aparato de TA es baja. Por otra parte, las fuerzas generadas p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Micro cubierta del cristal # 1.5 (22x22) </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td> Micro cubierta del cristal # 1.5 (22x40) </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td> Lambda ADN </td><td> Invitrogen </td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> T4 ADN ligasa </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> Microcon Ultracel YM-100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenina </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> Anticuerpos anti-myc </td><td> Invitrogen </td><td> 46-0603 </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma </td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 estreptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne T1 estreptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> p-aminofenilmercúrico Acetato </td><td> Calbiochem </td><td> 164610 </td></tr><tr><td> Biotina-maleimida </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B1267 </td></tr><tr><td> La biotina marcada oligo </td><td> IDT ADN </td><td> La síntesis </td></tr><tr><td> Digoxigenina marcado oligo </td><td> IDT ADN </td><td> La síntesis </td></tr><tr><td> El colágenogen del péptido </td><td> ADN 2.0 </td><td> La síntesis </td></tr><tr><td> MMP-1 cDNA </td><td> Harvard plásmido de base de datos </td><td></td></tr><tr><td> z-traductor </td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td> Servo control para el traductor </td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

multiplexado de una sola molécula de mediciones de la fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

La generación y detección de las fuerzas mecánicas es un aspecto omnipresente de la fisiología celular, con relación directa con la metástasis del cáncer 1, 2 y aterogénesis cicatrización de la herida 3. En cada uno de estos ejemplos, las células tanto de ejercer la fuerza de su entorno y al mismo tiempo enzimáticamente remodelación de la matriz extracelular (MEC). El efecto de las fuerzas de ECM se ha convertido en un área de considerable interés debido a su probable importancia biológica y médica 4-7. Técnicas de una sola molécula, tales como la captura óptica 8, microscopía de fuerza atómica 9, y pinzas magnéticas 10,11 permitirá a los investigadores para probar la función de las enzimas a nivel molecular, al ejercer fuerzas sobre las proteínas individuales. De estas técnicas, pinzas magnéticas (MT) se caracterizan por su bajo costo y alto rendimiento. MT ejercen fuerzas en el rango de 1-100 ~ pN y puede proporcionar milisegundo resolución temporal,cualidades que son bien emparejados para el estudio del mecanismo de la enzima en el nivel de una sola molécula de 12. Aquí mostramos un ensayo altamente paralelizable MT para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis de las moléculas de proteínas individuales. Se presenta el ejemplo específico de la proteolisis de un péptido de colágeno trimérica por metaloproteinasas de matriz 1 (MMP-1), sin embargo, este ensayo se puede adaptar fácilmente para estudiar otros sustratos y proteasas.

En este artículo se describe el uso de pinzas magnéticas para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis enzimática a nivel sola molécula de una manera altamente paralelizable.

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

La generación y detección de fuerzas mecánicas es un aspecto ubicuo de la fisiología celular, con relevancia directa en la metástasis del cáncer1, la aterogénesis2...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el efecto de la carga mecánica sobre la escisión proteolítica de proteínas individuales de manera altamente paralela y rentable. En esta demostración, en una primera etapa se examina la escisión del colágeno por la metaloproteasa matricial uno; los fragmentos de colágeno se fijan al cubreobjetos de vidrio de una celda de flujo, seguido por la unión de microesferas magnéticas de tamaño micrométrico a las moléculas individuales de colágeno. El segundo paso consiste en montar la celda de flujo en el aparato de pinzas magnéticas y verificar que las microesferas adheridas de forma no específica hayan sido eliminadas de la superficie del cubreobjetos.A continuación, se añade la proteasa a las celdas de flujo. El paso final consiste en determinar la velocidad de proteólisis mediante el seguimiento en tiempo real de la disociación de los microesferas. Al medir las tasas de disociación de las microesferas a diferentes concentraciones de proteasa y fuerzas, es posible obtener parámetros cinéticos zoologicos estándar utilizando cantidades mínimas de sustrato y proteasa.Además, esta técnica proporciona información única sobre el efecto de la fuerza mecánica en la velocidad de la proteólisis y en los cambios estructurales de la proteína sustrato que acompañan al corte. La principal ventaja de esta técnica en comparación con otros métodos como los trazos ópticos T y la microscopía de fuerza atómica es que esta técnica es de alto rendimiento y rentable. Aunque este método puede ofrecer información sobre la fuerza efectiva en el corte proteolítico de proteínas individuales, los instrumentos y técnicas pueden aplicarse a una amplia gama de problemas biofísicos, incluido el efecto de la fuerza sobre el plegamiento y la conformación de proteínas.Comience la preparación de la celda de flujo limpiando las laminillas mediante sonicación. Añada las laminillas a un recipiente de vidrio pequeño que pueda contenerlas y que quepa en el sonicador. Llene el recipiente con isopropanol y sométalo a sonicación en un baño sonicador durante 20 minutos, luego deseche el isopropanol y enjuague las laminillas con abundante agua desionizada.Llene el recipiente con agua y someta a ultrasonido durante 20 minutos. Después de la sonicación, seque las laminillas con un flujo de aire filtrado libre de polvo. Inspeccione las laminillas y utilice únicamente aquellas que estén libres de manchas.Caliente suavemente las laminillas con la llama durante unos segundos para limpiarlas del polvo y la humedad residual, pasándolas por una llama de gas producida por un mechero Bunsen, teniendo cuidado de no deformar la laminilla debido al exceso de calor. Este paso elimina los contaminantes superficiales residuales.A continuación, utilice cinta adhesiva transparente de doble cara para unir los dos cubreobjetos. Primero, corte la cinta en un trozo de aproximadamente tres centímetros de longitud y 0,3 centímetros de ancho, y colóquela sobre un cubreobjeto de 22 por 40 milímetros, dejando un canal de 1,6 centímetros en el centro. Utilice la punta de una pipeta para presionar suavemente el cubreobjeto y asegurarse de que la cinta se haya adherido correctamente.El aparato de pinzas magnéticas fue construido por este laboratorio utilizando un soporte en forma de L de aluminio con un orificio de un milímetro de diámetro, montado sobre un traductor vertical en Z para modular la altura de las pinzas. Dos imanes permanentes de tierras raras se fijaron al soporte a ambos lados del orificio para crear el gradiente de campo magnético. La calibración adecuada de la trampa magnética es esencial para este procedimiento.Para garantizar el éxito, utilizamos dos métodos diferentes, como se describe en esta sección. Para calibrar la trampa magnética, utilice ADN previamente preparado del fago Lambda marcado en sus extremos cinco prima y tres prima con biotina y digoxigenina, tal como se detalla en el protocolo escrito. Para fijar el ADN a la celda de flujo, primero llene la celda de flujo con solución de anticuerpo antidual y permita que el anticuerpo se adhiera a la superficie de vidrio durante 15 minutos.A continuación, pase el flujo de la celda para evitar la adhesión no específica del ADN añadiendo una solución de albúmina sérica bovina (BSA) a la celda de flujo. Tenga en cuenta que para este paso de pasivación y todos los pasos posteriores, el volumen del reactivo añadido a la celda de flujo debe ser al menos el doble del volumen de la celda de flujo, que en esta demostración es de 75 microlitros; incube la celda de flujo a temperatura ambiente durante 45 minutos.Después de repetir este paso, agregue 50 picomolares de ADN lambda funcionalizado y permita que se adhiera al cubreobjetos durante 15 minutos; luego, elimine el exceso de ADN con un lavado de XPBS. Finalmente, agregue perlas superparamagnéticas recubiertas con estreptavidina y permita que se adhieran al ADN inmovilizado durante 15 minutos. En esta demostración, se utilizan perlas de 2,8 micrómetros.Lave los excesos de perlas con un XPBS. A continuación, realice la calibración de los pinzas magnéticas moviendo los imanes permanentes a una posición alejada de la superficie de la muestra. Luego coloque la celda de flujo preparada en el microscopio.Coloque los imanes permanentes en posición sobre la celda de flujo. Elija el plano focal de las perlas funcionalizadas con ADN Lambda enfocando las perlas alejadas de ambas superficies de vidrio. El plano focal correcto es aquel en el que las perlas deseadas tienen un centro brillante.Grabe un video del movimiento de las perlas en el que las frecuencias superen los 80 hercios durante 500 cuadros. Acerque el imán a la superficie de la muestra y registre un video del movimiento de las perlas en cada posición. Para distancias superiores a cinco milímetros, muévase en incrementos de un milímetro; para distancias entre uno y cinco milímetros, hágalo también en incrementos de un milímetro.Mueva en incrementos de 0,5 milímetros para distancias menores a un milímetro, muévase en incrementos de 0,25 milímetros. Para cada conjunto de datos, rastree el centro de las perlas utilizando un ajuste gaussiano 2D. Calcule la fuerza mediante fluctuaciones brownianas, como se describe en el procedimiento escrito. Confirme la precisión de las fuerzas verificando el cálculo de la fuerza mediante un ajuste espectral de potencia de Lian.Para hallar la frecuencia de desprendimiento, puede determinarse la relación entre la fuerza aplicada y la frecuencia de desprendimiento en el texto anterior a la fijación del péptido de colágeno en las celdas de flujo, expresar y purificar las proteínas del péptido de colágeno y de la MMP-1. Comience añadiendo la solución de anticuerpo anti-MIC a la celda de flujo e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que el anticuerpo anti-MIC se fije a la superficie de la celda de flujo. Bloquee la celda de flujo para prevenir la fijación no específica de proteínas usando BSA al cinco miligramos por mililitro. Añada 150 picomolares de péptido de colágeno y permita que se fije al anticuerpo mediante la etiqueta MTTAG durante 45 minutos.Lave el exceso de colágeno utilizando tampón PBS antes de agregar las microesferas de 2,8 micrómetros a la celda de flujo. Deben separarse de la solución de microesferas recubiertas con strep divid mediante imanes potentes y luego resuspenderse en PBS. Este proceso debe repetirse tres veces.Este paso es esencial para lograr que las microesferas de 2,8 micrómetros se unan al péptido de colágeno inmovilizado en la superficie. A continuación, agregue microesferas superparamagnéticas recubiertas con estreptavidina y permita que se adhieran a las moléculas de colágeno durante 45 minutos. Una vez que la celda de flujo esté ensamblada con el péptido de colágeno y las microesferas magnéticas, obtenga imágenes de la celda de flujo en la trampa magnética.Bajo una fuerza baja, una subpoblación de las perlas a veces es débil, adherida a la superficie de manera no específica. La aplicación de una fuerza moderada asegura que estas perlas sean liberadas. Añada la enzima activada a la celda de flujo.En este caso, la MMP uno se preactivó mediante la adición de 3,5 milimolares de PMA y se incubó a 37 grados Celsius durante tres horas. Tan pronto como se reintroduce una cámara de flujo en el aparato de pinzas magnéticas, registre un video que abarque varios campos de visión, obteniendo típicamente varios cientos de microesferas unidas. Esta medición corresponde a tiempo igual a cero.Repita el mismo proceso de grabación de varios campos de visión en intervalos de tiempo regulares hasta que todas las perlas se desprendan o no se observe más proteólisis. Las pinzas magnéticas fueron calibradas para perlas de un micrómetro y 2,8 micrómetros. Utilizando tanto la magnitud de las fluctuaciones brownianas observadas como el cálculo de la frecuencia de corte a diferentes posiciones del imán en los experimentos de proteólisis forzada, se puede graficar el número normalizado de perlas restantes en función del tiempo para determinar la velocidad de proteólisis.Y este proceso puede repetirse con diferentes concentraciones de enzima y fuerzas. Las tasas de proteólisis dependen de la fuerza aplicada. Las tasas de proteólisis se determinaron a un picoNewton, 6,2 picoNewtons y 13 picoNewtons.La fracción de microesferas no protegidas, que persiste durante más de 15 minutos, permanece aproximadamente constante en 0,25 en diferentes experimentos. En nuestro caso, el ensayo nos permitió medir la eficiencia catalítica de la MMP-1 en función de la fuerza aplicada. Al analizar los datos, descubrimos que la hélice triple del colágeno debe desenrollarse localmente antes de la proteólisis.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco a seis horas si se realiza correctamente. Es importante recordar que se requieren al menos de 30 a 50 perlas por campo de visión para obtener una buena significancia estadística de sus datos. No olvide que el A PMA puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, batas de laboratorio y mascarilla facial, al realizar este experimento.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir el efecto de la fuerza sobre la escisión proteolítica de proteínas individuales utilizando pinzas magnéticas. Las pinzas magnéticas son una excelente herramienta para comprender experimentos biofísicos de molécula individual. Esta técnica puede extenderse a otras combinaciones de proteasa y sustrato.Además, se pueden utilizar técnicas similares para comprender la dinámica estructural de proteínas, así como para estudiar otras proteínas que se unen a o modifican el ARN y/o el ADN.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Pinzas magnéticas, una técnica de la manipulación de una sola molécula de gran alcance, pueden ser adaptadas para las mediciones directas de la torsión (usando una configuración llamada libremente en órbita alrededor de pinzas magnéticas) y el par (usando una configuración denominado pinzas de par magnético) en macromoléculas biológicas. Se dan directrices para efectuar estas mediciones, incluidas las aplicaciones para el estudio de ADN y filamentos de núcleo-proteínas asociadas.

Pinzas Magnéticas para la Medición de Twist and Torque

Una plataforma de una sola molécula magnética Pinzas para manipular G-quadruplexes se divulga, que permite el estudio de estabilidad de G4 y regulación por diversas proteínas.

Manipulación de una sola molécula de G-quadruplexes por pinzas magnéticas

Se describe un método altamente paralelo para medir el escote específico del sitio del ADN a nivel de molécula única. Este protocolo muestra la técnica mediante la restricción endonucleasa NdeI. El método se puede modificar fácilmente para estudiar cualquier proceso que resulte en una escisión de ADN específica del sitio.

Ensayo cinético de molécula única de alto rendimiento paralelo para la escoja de ADN específica del sitio

Este protocolo presenta un flujo de trabajo experimental completo para estudiar las interacciones ARN-proteína utilizando pinzas ópticas. Se describen varias configuraciones experimentales posibles, incluida la combinación de pinzas ópticas con microscopía confocal.

Pinzas ópticas para estudiar las interacciones ARN-proteína en la regulación de la traducción

La bioquímica visual de una sola molécula estudiada a través de cámaras microfluídicas se facilita enormemente utilizando barriles de vidrio, jeringas herméticas al gas, conexiones estables de tubos a células de flujo y eliminación de burbujas mediante la colocación de válvulas de conmutación entre las jeringas y el tubo. El protocolo describe trampas ópticas duales que permiten la visualización de transacciones de ADN e interacciones intermoleculares.

Uso de pinzas ópticas duales y microfluídica para estudios de moléculas individuales

Aquí, describimos una configuración de pinza magnética de alta velocidad que realiza mediciones nanomecánicas en biomoléculas sensibles a la fuerza a la velocidad máxima de 1.2 kHz. Introducimos su aplicación a horquillas de ADN y complejos SNARE como sistemas modelo, pero también será aplicable a otras moléculas involucradas en eventos mecanobiológicos.

Pinzas magnéticas de alta velocidad para mediciones nanomecánicas en elementos sensibles a la fuerza

Este protocolo demuestra el uso de pinzas magnéticas de una sola molécula para estudiar las interacciones entre las proteínas teloméricas de unión al ADN (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] y TRF2) y los telómeros largos extraídos de células humanas. Describe los pasos preparatorios para los telómeros y los factores de unión de repetición telomérica, la ejecución de experimentos de una sola molécula y los métodos de recopilación y análisis de datos.

Análisis de las interacciones teloméricas proteína-ADN utilizando pinzas magnéticas de una sola molécula

Se ilustra el uso de una fuerza constante pinzas ópticas axial para explorar las propiedades mecánicas de las moléculas cortas de ADN. Por el estiramiento del ADN axialmente, podemos minimizar los obstáculos estéricos y artefactos procedentes de la manipulación lateral convencional, lo que nos permite estudiar las moléculas de ADN tan corto como ~ 100 nm.

Estiramiento secuencias cortas de ADN con fuerza constante pinzas axial óptico

Un método para medir la longitud de persistencia o rigidez a la flexión de los biopolímeros se describe. El método utiliza una quinesina impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento para determinar experimentalmente la longitud de persistencia de los microtúbulos individuales y es adaptable a actina ensayos basados ​​en deslizamiento.

Medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de Vuelo a Vela

Los celulosomas son complejos multienzimáticos diseñados para digerir la celulosa. Se utilizó SMFS basado en AFM para estudiar las propiedades mecánicas y la configuración de plegamiento de los ensamblajes de proteínas asociados al celulosoma. Presentamos un flujo de trabajo completo para la inmovilización de proteínas, la adquisición de datos y el análisis de datos para estudiar las interacciones de los complejos receptor-ligando individuales involucrados en el ensamblaje del celulosoma.

Investigación de sistemas receptores-ligandos del celulosoma con espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM

Aprende a medir la fuerza proteólisis a nivel de molécula única usando pinzas magnéticas con colágeno y MMP-1. Este método paralelo y rentable permite estudiar el efecto de la carga mecánica en la actividad enzimática.

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

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