Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el efecto de la carga mecánica en la escisión proteolítica de proteínas individuales de una manera altamente paralela y rentable. En esta demostración, se examina la escisión del colágeno por la metaloproteinasa de la matriz uno en el primer paso, los recortadores de colágeno se unen al cubreobjetos de vidrio de una celda de flujo, seguido de la unión de perlas magnéticas del tamaño de un micrómetro a las moléculas individuales de colágeno. El segundo paso es montar la celda de flujo en el aparato de pinzas magnéticas y verificar que los cordones no adheridos específicamente se hayan eliminado de la superficie del cubreobjetos.

A continuación, la proteasa se añade a las células de flujo. El paso final es determinar la tasa de proteólisis mediante el monitoreo del desprendimiento de cordones en tiempo real. Al medir las tasas de desprendimiento de cordones a diferentes concentraciones y fuerzas de proteasa, es posible derivar parámetros cinéticos zoológicos estándar utilizando cantidades diminutas de sustrato y proteasa.

Además, esta técnica proporciona información única sobre el efecto de la fuerza mecánica en la tasa de proteólisis y en los cambios estructurales en la proteína sustrato que acompañan a la escisión. La principal ventaja de esta técnica en comparación con otros métodos como las trazas ópticas de T y la microscopía de fuerza atómica, es que esta técnica es de alto rendimiento y rentable. Aunque este método puede proporcionar información sobre la fuerza efectiva en la escisión proteolítica de proteínas individuales, la instrumentación y las técnicas se pueden aplicar a una amplia gama de problemas biofísicos, incluido el efecto de la fuerza en el plegamiento y la confirmación de proteínas.

Comience la preparación de la celda de flujo limpiando los cubreobjetos mediante sonicación. Agregue las fundas a un pequeño recipiente de vidrio capaz de contenerlas que quepa en el ator. Llene el recipiente con isopropanol y sonicate en un bañador durante 20 minutos y enjuague las cubrebotellas con abundantes cantidades de agua desionizada.

Llene el recipiente con agua y sonique durante 20 minutos. Después del secado por sonicación, la cubierta se desliza en un chorro de aire filtrado y libre de polvo. Inspeccione los cubreobjetos y use solo los que estén libres de manchas.

Flamee suavemente los deslizadores de la cubierta durante unos segundos para limpiarlos de cualquier resto de polvo y humedad al pasar la cubierta. Se desliza a través de una llama de gas producida por un quemador Bunsen, teniendo cuidado de no deformar el cubreobjetos debido al exceso de calor. Este paso elimina los contaminantes residuales de la superficie.

A continuación, utilice cinta adhesiva de doble cara para unir los dos cubreobjetos. Cortando primero la cinta de aproximadamente tres centímetros de largo y 0,3 centímetros de ancho, fije la cinta a un cubreobjetos de 22 por 40 milímetros, dejando un canal de 1,6 centímetros en el medio. Utilice una punta de pipeta para presionar suavemente el cubreobjetos para asegurarse de que la cinta se ha adherido correctamente.

El aparato de pinzas magnéticas fue construido por este laboratorio utilizando un soporte en L de aluminio con un orificio de un milímetro de diámetro y montado en un traductor vertical en Z para modular la altura de las pinzas. Dos imanes permanentes de tierras raras se unieron al soporte a cada lado del agujero para crear el gradiente del campo magnético. La calibración adecuada de la trampa magnética es esencial para este procedimiento.

Para garantizar el éxito, utilizamos dos métodos diferentes, como se describe en esta sección. Para calibrar la trampa magnética Para la calibración, utilice ADN previamente preparado del fago Lambda marcado en sus cinco extremos primos y tres primos con biotina y doxygen como se describe en el protocolo escrito. Para unir primero el ADN a la celda de flujo, llene la celda de flujo con oxígeno anti-D y solución de anticuerpos y permita que el anticuerpo se adhiera a la superficie del vidrio durante 15 minutos.

A continuación, coma la superficie de la celda de flujo para evitar la adherencia inespecífica del ADN agregando una solución de BSA a la celda de flujo. Tenga en cuenta que para este paso y todos los pasos siguientes, el volumen de reactivo agregado a la celda de flujo debe ser al menos el doble. El volumen de la celda de flujo, que en esta demostración es de 75 microlitros, incube la celda de flujo a temperatura ambiente durante 45 minutos.

Después de repetir este paso, agregue 50 picomolares de ADN lambda funcionalizado y deje que se adhiera al cubreobjetos durante 15 minutos, lave el exceso de ADN con un XPBS. Por último, añade perlas superparamagnéticas recubiertas de estreptavidina y deja que se adhieran al ADN inmovilizado durante 15 minutos. En esta demostración, se utilizan perlas de 2,8 micrómetros.

Lave el exceso de perlas con un XPBS. A continuación, realice la calibración de las pinzas magnéticas moviendo los imanes permanentes a una posición que esté lejos de la superficie de la muestra. A continuación, coloque la celda de flujo preparada en el microscopio.

Mueva los imanes permanentes a su posición por encima de la celda de flujo. Elija el plano focal de las cuentas funcionalizadas de ADN Lambda enfocándose en las cuentas lejos de ambas superficies de vidrio. El plano focal correcto es aquel en el que las cuentas deseadas tienen un centro brillante.

Tome un video del movimiento de las cuentas que 80 hercios son mayores para 500 fotogramas. Acerque el imán a la superficie de la muestra y grabe un video del movimiento del cordón en cada posición. Para distancias superiores a cinco milímetros, muévase en incrementos de un milímetro para distancias entre uno y cinco milímetros.

Muévase en incrementos de 0,5 milímetros para distancias inferiores a un milímetro, muévase en incrementos de 0,25 milímetros Para cada conjunto de datos, rastree el centro de las cuentas mediante un ajuste gaussiano 2D. Cálculo de la fuerza a través de las fluctuaciones brownianas como se describe en el procedimiento escrito. Confirme la precisión de las fuerzas comprobando el cálculo de la fuerza a través de un ajuste Lian del espectro de potencia.

Para encontrar la frecuencia de caída, la relación entre la fuerza aplicada y la frecuencia de caída se puede encontrar en el texto antes de la unión del péptido de colágeno a las células de flujo, exprese y purifique el péptido de colágeno y las proteínas MMP uno. Comience agregando la solución de anticuerpos antimicrófono a la celda de flujo e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que el antimicrófono se adhiera a la superficie de la celda de flujo para evitar la unión inespecífica de proteínas usando cinco miligramos por mililitro. BSA: Agregue 150 péptidos de colágeno picomolar y deje que se adhiera al anticuerpo a través de la etiqueta M durante 45 minutos.

Lave el exceso de colágeno con un tampón PBS antes de agregar perlas de 2,8 micrómetros a la celda de flujo. Deben separarse de la solución de perlas divididas por estreptococos y recubrirse con imanes potentes, y luego resuspenderse en PBS. Este proceso debe repetirse tres veces.

Este paso es esencial para que las perlas de 2,8 micrómetros se unan al péptido de colágeno inmovilizado de la superficie. A continuación, agregue perlas superparamagnéticas recubiertas de estreptavidina divididas por estreptococos y deje que se adhieran a las moléculas de colágeno durante 45 minutos. Una vez que la celda de flujo esté ensamblada con péptido de colágeno y perlas magnéticas, imagine la celda de flujo en la trampa magnética.

Bajo baja fuerza, una subpoblación de las cuentas a veces es débil, adherida a la superficie de manera inespecífica. La aplicación de una fuerza modesta asegura que estas cuentas se liberen. Agregue la enzima activada a la celda de flujo.

En este caso, MMP one se preactivó añadiendo 3,5 milimolares A PMA y se incubó a 37 grados centígrados durante tres horas. Tan pronto como se vuelva a introducir una celda de flujo en el aparato de pinzas magnéticas, grabe un video que abarque algunos campos de visión, lo que generalmente produce varios cientos de cuentas adjuntas. Esta medida corresponde a que el tiempo es igual a cero.

Repita el mismo proceso de registrar varios campos de visión en puntos de tiempo regulares hasta que todas las perlas se desprendan o no se pueda discernir más proteólisis. Las pinzas magnéticas se calibraron para cuentas de un micrómetro y 2,8 micrómetros. Utilizando tanto la magnitud de las fluctuaciones brownianas observadas como el cálculo de la frecuencia de caída en diferentes posiciones de los imanes en los experimentos de proteólisis forzada, el número normalizado de perlas restantes se puede trazar en función del tiempo para encontrar la tasa de proteólisis.

Y este proceso se puede repetir para diferentes concentraciones y fuerzas enzimáticas. Las tasas de proteólisis dependen de la fuerza aplicada. Las tasas de proteólisis se determinaron en un pico Newton, 6,2 Pico Newtons y 13 Pico Newtons.

La fracción de cuentas no producidas es superior a 15 minutos, se mantiene aproximadamente constante en 0,25 en diferentes experimentos. En nuestro caso, el ensayo nos permitió medir la eficiencia catalítica de MMP uno en función de la fuerza aplicada. Al analizar los datos, descubrimos que la triple hélice de colágeno debe desenrollarse localmente antes de la proteólisis.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco o seis horas si se hace correctamente. Es importante recordar que se requieren al menos de 30 a 50 cuentas por combustible de vista para obtener una buena significación estadística de sus datos. No olvide que un PMA puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben usar precauciones como guantes, batas de laboratorio y mascarilla mientras se realiza este experimento.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir el efecto de la fuerza en la escisión proteolítica de proteínas individuales usando pinzas magnéticas. Las pinzas magnéticas son una gran herramienta para comprender los experimentos biofísicos de una sola molécula. Esta técnica puede extenderse a otras combinaciones de proteasas y sustratos.

Además, se pueden utilizar técnicas similares para comprender la dinámica estructural de las proteínas, así como para comprender otras proteínas que se unen o modifican el ARN o el ADN.