Fluorescencia microscopia de Selección y secuenciación de próxima generación: Herramientas útiles para la identificación de genes implicados en la integridad de los Orgánulos

El objetivo de este experimento es identificar el gen o genes responsables de la integridad morfológica y funcional de los orgánulos de las plantas. Esto se logra agregando primero sulfonato de metano Ethel como agente químico a las semillas de atopia mutágena que llevan el marcador fluorescente del orgánulo. El segundo paso es recolectar semillas de plantas individuales de la primera generación de mutágenos para cultivar líneas de la siguiente generación mutante M dos.

A continuación, se observan las semillas de mutágeno de Eliana utilizando un microscopio confocal o fluorescente para identificar el fenotipo organal aberrante. El paso final es generar la tercera generación de mutágenos y confirmar la presencia del fenotipo mutante. En última instancia, la mutación recesiva se puede mapear utilizando herramientas de secuenciación de próxima generación.

Una vez identificada la ubicación del gen mutante, la transformación con el gen de tipo salvaje debería restaurar el fenotipo orgánico aberrante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el mantenimiento de la integridad morfológica y funcional de los orgánulos de las plantas. El tratamiento con metanos y sulfonato de las semillas de atop sta induce cambios en el tiempo de la citosina en el genoma, lo que da como resultado el gwan de la citosina en el tiempo.

Adición de mutaciones. El tratamiento EMS es un paso clave en este protocolo para garantizar una mutación de proporción perfecta dentro de M dos individuos. Para empezar, obtenga semillas de Arabidopsis del tipo silvestre Columbia Ecotype que han sido previamente modificadas para llevar un marcador fluorescente de orgánulo relevante.

Transfiera 0,8 gramos o unas 40.000 semillas a un tubo de halcón de 50 mililitros. A continuación, añade 25 mililitros de agua destilada y sulfonato de metano al 0,2%. Incubar la mezcla durante 16 horas en un mezclador mutante a baja velocidad después de la incubación, aspirar el líquido y desecharlo en un frasco que contenga un hidróxido de sodio molar.

Para inactivar el EMS, agregue 25 mililitros de agua al tubo Falcon que contiene las semillas. Cierra el tubo e invierte cinco veces para lavar las semillas. Después de que todas las semillas se hayan asentado, aspire el agua y deséchela en el matraz de hidróxido de sodio de un molar.

Repita este paso de lavado hasta 10 veces después del lavado final, Reese gasta las semillas en una cantidad mínima de agua. Proceda a la esterilización de las semillas agregando 25 mililitros de lejía al 10% y agitando vigorosamente durante 30 segundos. Una vez que las semillas se asienten en el fondo, vierta la lejía y enjuague con 25 mililitros de agua estéril.

Después de retirar el agua estéril, agregue 25 mililitros de etanol al 70%. Agite los tubos durante 30 segundos y deje que las semillas se asienten en el fondo. Vierta el etanol y enjuague con 25 mililitros de agua estéril.

Repita el lavado con agua estéril dos veces. A continuación, vierte las semillas en una placa de Petri de plástico que contenga papel de filtro de tres mm. Deje que las semillas se sequen bajo el capó después de incubar las semillas durante dos días a cuatro grados centígrados.

Coloque las semillas en una placa de Petri de 150 milímetros a aproximadamente 250 a 300 semillas por placa en medio Magi y scoog que contenga gel de combate. Como agente gelificante, cultive las semillas de la generación M1 en placas durante dos semanas. Trasplante las plántulas a la tierra y permita que las plantas continúen creciendo.

Después de 30 a 45 días, las plantas alcanzarán la etapa madura donde maduran, por lo que las fugas se pueden ver claramente. En este punto, recoja M dos semillas de plantas M1 individuales para generar 1000 M dos líneas independientes. Para observar las plántulas con un microscopio confocal o de fluorescencia, cultive 60 semillas de cada línea M dos durante siete a 10 días en placas de Petri de plástico por la mitad.

El medio Moreish y el medio scoog que contiene gel de combate también cultivan cinco plántulas del control EMS sin tratar en la misma placa. Una vez que las plántulas hayan crecido, monte de cinco a 10 entradas con el lado del sello ABAC hacia la lente de 40 veces en un portaobjetos de microscopio y encerrado con un cubreobjetos bajo fluorescencia, observe cada oleína desde la región cortical hasta la medial para ver si hay una distribución subcelular alterada del marcador de orgánulos. Después del trasplante de plantas positivas en el suelo y el crecimiento de las plántulas, como se acaba de describir, confirman que el fenotipo mutante está en la generación M tres.

Eliminar las mutaciones de fondo contaminantes mediante el retrocruzamiento al menos tres veces con un genoma de tipo salvaje que contenga el marcador fluorescente orgánico deseado, tal como se describe en el protocolo escrito. Para comenzar el mapeo, use el mini kit de planta Cogen DN Easy Z para extraer aproximadamente tres microgramos de ADN genómico de M three, que representa el ADN colombiano mutante homocigótico. Envíe este ADN para el analizador de genoma Illumina dos 14 secuenciaciones.

El siguiente paso es cruzar el mutante zago de Colombia con Las Berger para generar la progenie que sigue a la autopolinización en la que se puede producir la combinación. El resultado será la generación de dientes sordos y, en última instancia, servirá como una población de mapeo que contiene el gen de interés que está causando la mutación. Al comparar el ADN genómico de esta población con el ADN genómico de plantas tipo pozo, se puede identificar la ubicación de la mutación en el genoma.

Después del crecimiento de las dos plantas F, reúna entre 70 y 100 F dos individuos que muestren el fenotipo aberrante y el mismo número de F dos plantas con un fenotipo de tipo silvestre, recoja un disco de hojas de cada planta con un punzón entero. El disco de la hoja debe recogerse de hojas de la misma edad. Para garantizar cantidades similares de ADN, las muestras se pueden procesar para la extracción genómica por separado o en grupos.

En este caso, es posible recolectar de cinco a 10 muestras por cada tubo de orph final para que haya menos tubos de los que se tenga que extraer el ADN genómico. Utilice el kit de purificación de ADN de hoja de planta pura maestra para extraer el ADN genómico. El ADN genómico obtenido de cada muestra se puede cuantificar con un NanoDrop.

Luego, combinando la misma cantidad de ADN de cada muestra hasta un total de 300 nanogramos, manteniendo separadas las muestras de tipo mutante y salvaje para hacer primero la reacción de etiquetado, agregue 60 microlitros de 2,5 x solución de cebador aleatorio y 42 microlitros de agua. Después de desnaturalizar el ADN a más de 95 grados Celsius durante cinco a 10 minutos, llame a las muestras en hielo para desnaturalizar el ADN. Agregue 15 microlitros de 10 x DN tps.

Mezclar con biotina DCTP y completar con tres microlitros. Glen polimerasa. Incubar las muestras durante la noche a 25 grados centígrados.

Al día siguiente, agregue 15 microlitros de acetato de sodio tres molares y 400 microlitros de etanol 100% frío. Incubar las muestras mezcladas a menos 80 grados Celsius durante una hora después de la centrifugación a 20.500 veces G durante 15 minutos. Lavar el pellet con 500 microlitros de etanol en frío al 75% después de un segundo centrifugado.

Seque los gránulos de ADN a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de agua y use cinco microlitros para verificar el rendimiento y la calidad en un gel bio. Las reacciones de marcaje aleatorio primario se cargaron en un gel de aros al 1% de un grupo de plantas silvestres de tipo F dos y de un grupo de plantas mutantes F dos.

Como paso final, envíe 95 microlitros del tipo salvaje y la reacción de etiquetado mutante para el chip genético arabidopsis a través de una hibridación de matriz de genoma. Una vez escaneado el borrador, los archivos CL de puntos resultantes obtenidos se analizan con nuestro software. Después de instalar nuestro software, abra el programa y pegue la cadena de bioconductor que se encuentra en el procedimiento escrito.

A continuación, pulse la tecla de retorno, que instalará los paquetes estándar de BIOCONDUCTOR desde el sitio web de matrices, genotipado y mapeo. Descargue y descomprima los archivos enumerados en el texto en una nueva carpeta en el escritorio. Conserva los datos obtenidos del experimento del chip genético en el tipo salvaje C, L y el mutante C. Ahora copia los datos del chip genético para el tipo salvaje C y el mutante C en la carpeta.

A continuación, abra R para una PC. Haga clic en archivo y, a continuación, haga clic en cambiar directorio. Seleccione la carpeta que contiene los archivos, haga clic en el espacio de trabajo de carga de archivos y, a continuación, seleccione A uno V cinco R datos abiertos leer C do R usando el bloc de notas y copie todo el texto a R para Mac, haga clic en mis y luego haga clic en cambiar directorio de trabajo.

Seleccione la carpeta que contiene los archivos. Haga clic en el área de trabajo, cargue el archivo de área de trabajo y seleccione ATH one V five R data. Del mismo modo, abra SFP R y MAP R usando texto, edite y copie el texto a R en la ventana de la consola.

Aparecerá un mensaje para buscar genes en el recurso de información de Arabidopsis o TAIR. Copie y pegue el enlace que se encuentra en el texto en el navegador de Internet. Aparecerá una ventana y te pedirá que abras o guardes el archivo.

Seleccione Guardar. Elija un nombre de archivo y adjunte la extensión. Do x ls.

A continuación, haga clic en Guardar. Aquí se muestra un resultado típico esperado. Después de analizar los datos obtenidos de la matriz genómica del chip genético Arabidopsis H one, esta figura representa un ejemplo de mapeo de la mutación Columbia cero utilizando el chip genético Arabidopsis, una hibridación del genoma H one, donde las barras horizontales representan los umbrales para la detección.

La mutación en este ejemplo se localiza en el cromosoma uno, delimitado por barras verticales. Abra el archivo dot XLS para encontrar la coordenada del mutante dentro del área mapeada. En las lecturas ensambladas de Illumina del genoma mutante, identifique transiciones EMS específicas entre los polimorfismos de un solo nucleótido.

Una vez dominado, el enfoque que describe este protocolo se puede utilizar para mapear el gen en un período de tiempo corto de tres en comparación con el método de mapeo clásico.