Seguimiento de los cambios en la concentración de calcio intracelular y la eficacia sináptica en el molusco

Se ha sugerido que el calcio intracelular desempeña un papel importante en varios mecanismos de plasticidad sináptica. Estas ideas pueden evaluarse mediante el monitoreo simultáneo de los cambios en calcio y las alteraciones en la eficacia sináptica. Aquí demostramos cómo se logra esto combinando la imagen de calcio con el registro intracelular.

Nuestros experimentos se realizan con un ganglio del molusco Aplysia californica. Este preparado presenta varias ventajas, como neuronas grandes e identificadas, las bajas temperaturas naturales para Aplysia, señales lentas y una facilitación del proceso de obtención de imágenes, pero las técnicas generales que demostramos se pueden transferir fácilmente a otros sistemas. Hola, soy Colin Evans en el laboratorio de Elizabeth Cropper en el Departamento de Neurociencia Fishburg y el Instituto Cerebral Freedman en la Escuela de Medicina Mount Sinai en la ciudad de Nueva York.

Hoy, vamos a demostrar la obtención simultánea de imágenes de los cambios en la concentración intracelular de calcio y en la eficacia sináptica en el ganglio bucal del molusco Aplysia cahora. Para detectar el calcio intracelular, inyectaremos una neurona presináptica con el colorante indicador de calcio permeable a IMP celular, calcium orange. Luego, se coloca la preparación bajo el microscopio y se impalan las neuronas pre y postsinápticas con electrodos afilados.

La estimulación presináptica repetida provoca una respuesta postsináptica potenciada, visible como un aumento en la amplitud del potencial postsináptico o PSP. La medición de la señal fluorescente del colorante indicador de calcio nos permitirá detectar cambios simultáneos en el calcio intracelular presináptico. Para comenzar, anestesie un animal adulto que pese aproximadamente 150 gramos mediante la inyección de 75 mililitros de solución isotónica de cloruro de magnesio, sujete el animal anestesiado a un recipiente recubierto de cera, y luego, utilizando pinzas y tijeras gruesas, realice una incisión en el pie del animal y exponga la masa bucal.

El ganglio bucal se encuentra en el lado ventral de la masa bucal y consta de dos hemiganglios conectados. Contiene varios cientos de neuronas que, junto con neuronas de otros ganglios, contribuyen a la generación y control del comportamiento alimentario del animal. Libere cuidadosamente el ganglio cortando todos los nervios doblados con tijeras finas y retírelo del animal.

Luego sujete el ganglio liberado a la base de un platillo recubierto con malla de silicio lleno de agua de mar artificial. El ganglio está envuelto en una vaina de tejido conectivo, que debe eliminarse para exponer las neuronas individuales. Utilice pinzas de disección, tijeras de iris y extremo cuidado para cortar esta vaina.

Para evitar dañar las neuronas, estabilice el ganglio desvainado con alfileres de aproximadamente 15 minutos, ya que cualquier movimiento será problemático durante la obtención de imágenes. Para preparar electrodos afilados para el registro intracelular y la inyección de colorante, tire de los tubos capilares con un tirador de microelectrodos. Utilizamos vidrio de borosilicato con filamento y pared delgada, con un diámetro externo de un milímetro.

Los electrodos de registro deben tener una resistencia de aproximadamente 10 mega cuando se llenan con acetato de potasio tres molar, por lo que ajustamos el extractor en consecuencia para llenar los electrodos D. Sumerja la parte posterior del electrodo extraído en una solución de diez milimolar del colorante naranja de calcio; la acción capilar a lo largo del filamento de vidrio dentro del electrodo arrastrará el colorante hacia la punta, luego rellene el electrodo con cloruro de potasio 200 milimolar para asegurar un buen contacto eléctrico. Utilizamos un Bela construido a medida para mejorar las propiedades del electrodo y reducir la resistencia del electrodo de registro a aproximadamente cinco mega.

El electrodo se mantiene en un ángulo de 45 grados dentro de una corriente de una suspensión de óxido de aluminio. Mezclar cloruro de sodio en la suspensión y conectar un óhmetro permite monitorear la resistencia del electrodo. Durante el proceso de biselado, transferimos el recipiente que contiene los ganglios escapulares a un equipo de electrofisiología y localizamos las neuronas de interés atravesándolas con electrodos y verificando su identidad.

Para preparar la neurona para la imagen de calcio, primero insertamos un electrodo cargado con colorante en el soma celular y cargamos el colorante electroquímicamente mediante pulsos de corriente hiperpolarizantes de 15 nanoamperios durante 30 minutos. A medida que el D naranja de calcio entra en la célula, el SOR adquirirá un color rosa tenue. Luego retiramos cuidadosamente los electrodos de registro y dejamos el preparado reposando durante al menos 30 minutos para permitir que el colorante se difunda hacia los procesos finos de la neurona.

A continuación, transfiera el platillo con la preparación a un microscopio de fluorescencia. Utilizamos un objetivo de inmersión en agua de 10 aumentos y apertura numérica 0,3 en un microscopio vertical con platina fija, que enfoca moviendo el objetivo y no la platina. Esto facilita el montaje de los manipuladores.

Para los electrodos de registro, seleccione un bloque de filtros adecuado. Un bloque de tres filtros SI proporcionará los filtros de excitación y emisión correctos para el naranja de calcio; ajuste los parámetros de la cámara y la intensidad de iluminación mediante filtros de densidad neutra y la abertura de campo. Una mayor cantidad de luz reducirá el ruido, pero podría decolorar la preparación.

La cámara CCD de disparo rápido puede capturar un campo de 500 por 300 píxeles a una velocidad de cuadro de aproximadamente 30 cuadros por segundo, y con una buena relación señal-ruido. Minimice la iluminación de las neuronas fil mediante el mantenimiento del obturador de las fuentes de luz cerrado siempre que sea posible. En el software de imagen, seleccione las regiones de interés o ROIs.

Estas regiones definen dónde el software realizará las mediciones de intensidad. Generalmente, se obtienen imágenes de las ramas primarias, secundarias y terciarias del neurona presináptico. Coloque una ROI adicional junto a la neurona difi para obtener un valor de fondo que luego se restará de todos los demás puntos de datos.

Se utilizan electrodos de registro intracelular en neuronas presinápticas y postsinápticas para inducir y monitorear la transmisión sináptica. Puede garantizar la sincronización entre la adquisición de datos electrofisiológicos y de imágenes si utiliza la señal de disparo de trama de salida de la cámara para iniciar el software de adquisición de datos. Otra forma de asegurar la sincronización consiste en montar un LED dentro del puerto de la cámara.

Este LED se enciende brevemente al comienzo de la sesión de grabación y proporciona así una marca de sincronización. Durante un experimento típico, se desencadenan potenciales de acción en la neurona presináptica mediante la inyección de pulsos breves de corriente. En este ejemplo, mostramos una ráfaga de picos y los aumentos correspondientes en la señal de calcio para probar hipótesis específicas.

La señal de calcio puede manipularse y determinarse sus efectos sobre la transmisión sináptica. Por ejemplo, fármacos como el quelante de calcio EGTA pueden inyectarse o aplicarse de forma presináptica a través del sistema de perfusión. Los datos se analizan exportándolos desde el software de imagen a un archivo de texto y luego al software utilizado para adquirir los datos electrofisiológicos, que en nuestro caso es Spike2 de Cambridge Electronic Design.

Utilizamos un script personalizado para trazar los valores de intensidad de la ROI y los cambios correspondientes en el potencial de membrana, y para cuantificar los cambios en la señal de calcio mediante la resta de la señal de fondo obtenida a partir de la ROI de fondo y el cálculo del cambio relativo con la ecuación mostrada. F cero es la fluorescencia justo antes de la estimulación, y F es la fluorescencia durante la estimulación. Aquí mostramos los resultados de un experimento en el que registramos cambios en la fluorescencia de calcio en la neurona identificada B 21.

La región que observamos se indica en A; en B uno, indujimos un estallido de potenciales de acción en B 21, lo que provocó potenciales postsinápticos en B ocho y un cambio en la señal de calcio. B dos muestra el efecto de la inyección del quelante de calcio. Los potenciales de acción en B 21 ya no inducen aumentos generalizados en la fluorescencia de calcio y la amplitud del potencial postsináptico se reduce.

En conclusión, hemos demostrado técnicas que pueden utilizarse para monitorear simultáneamente la concentración intracelular de calcio y evaluar la eficacia de la transmisión sináptica. Estas técnicas requieren únicamente equipo modesto en comparación con la mayoría de las técnicas de imágenes funcionales y son fáciles y rápidas de aprender.