Seguimiento de los cambios en la concentración de calcio intracelular y la eficacia sináptica en el molusco Aplysia

El calcio intracelular se ha implicado como una parte importante de varios mecanismos de plasticidad sináptica. Estas ideas se pueden probar mediante el seguimiento simultáneo de los cambios en el calcio y las alteraciones en la eficacia sináptica. Aquí demostramos cómo se logra esto mediante la combinación de imágenes de calcio con el registro intracelular.

Nuestros experimentos se llevan a cabo con un ganglio del molusco Aplysia Cahora. Esta preparación tiene una serie de ventajas, como las neuronas grandes identificadas, las bajas temperaturas que son naturales para la apia, las señales lentas y facilitan la obtención de imágenes, pero las técnicas generales que demostramos se transfieren fácilmente a otros sistemas. Hola, soy Colin Evans y trabajo en el laboratorio de Elizabeth Cropper en el Departamento de Neurociencia de Fishburg y en el Instituto del Cerebro Freedman de la Escuela de Medicina Mount Sinai en la ciudad de Nueva York.

Hoy vamos a demostrar la imagen simultánea de los cambios en la concentración de calcio intracelular y la eficacia sináptica en el ganglio bucal del molusco Aplysia cahora. Para detectar el calcio intracelular, inyectaremos una neurona presináptica con el tinte indicador de calcio permeant IMP de la célula naranja cálcico. A continuación, la preparación se pasa al microscopio y las neuronas pre y postsinápticas se empalan con electrodos afilados.

La estimulación presináptica repetida da como resultado una respuesta postsináptica mejorada, visible como un aumento del potencial postsináptico o de la amplitud de la PSP. La medición de la señal fluorescente del colorante indicador de calcio nos permitirá detectar cambios simultáneos en el calcio intracelular presináptico. Para comenzar a anestesiar a un animal adulto que pesa alrededor de 150 gramos, inyecte 75 milésimas de pulgada de solución isotónica de cloruro de magnesio, sujete al animal anestesiado a un plato cubierto de cera, luego, con pinzas y tijeras gruesas, haga una incisión en el pie del animal y exponga la masa bucal.

El ganglio bucal se encuentra en el lado ventral de la masa bucal y consta de dos hemioganglios conectados. Contiene varios cientos de neuronas que, junto con las neuronas de otros ganglios, contribuyen a la generación y control del comportamiento alimentario del animal. Libere con cuidado el ganglio cortando todos los nervios doblados con unas tijeras finas y retírelo del animal.

A continuación, sujeta el ganglio liberado a la base de un plato recubierto de sil guard lleno de agua de mar artificial. El ganglio está envuelto en una vaina de tejido conectivo, que debe eliminarse para exponer las neuronas individuales. Use pinzas de verificación, tijeras para iris y extreme cuidado para cortar esta vaina.

Para evitar dañar las neuronas, estabilice el ganglio de la vaina con alfileres de unos 15 minutos, ya que cualquier movimiento será problemático durante la toma de imágenes. Para preparar electrodos afilados para el registro intracelular y la inyección de tinte, tire del tubo capilar con un extractor de microelectrodos. Utilizamos vidrio de silicato boa de filamento de pared delgada con un diámetro exterior de un milímetro.

Los electrodos de registro deben tener una resistencia de aproximadamente 10 mega cuando se llenan con acetato de potasio de tres molares, por lo que ajustamos el extractor en consecuencia para llenar los electrodos D. Sumerja la parte posterior del electrodo tirado en una solución de 10 milimolares del colorante de naranja cálcico La acción capilar a lo largo del filamento de vidrio dentro del electrodo atraerá el tinte hacia la punta, luego rellene el electrodo con cloruro de potasio de 200 milimolares para garantizar un buen contacto eléctrico. Utilizamos un Bela hecho a medida para mejorar las propiedades del electrodo y reducir la resistencia del electrodo de registro a unos cinco megas.

El electrodo se mantiene en un ángulo de 45 grados en una corriente de una suspensión de óxido de aluminio. La mezcla de cloruro de sodio en la suspensión y la conexión de un medidor de agua permite monitorear la resistencia del electrodo. Durante el proceso de biselado, transferimos la placa que contiene los ganglios de hebilla engañados a un equipo de electrofisiología y localizamos las neuronas de interés empalándolas con electrodos y verificando su identidad.

Para preparar la neurona para la obtención de imágenes de calcio, primero insertamos un electrodo lleno de tinte en el soma de la célula y cargamos el tinte electroteóricamente con 30 minutos de pulsos de corriente hiperpolarizantes de 15 nanoamperios. A medida que el naranja calcio D ingresa a la célula, el SOR adquirirá un color rosa tenue. A continuación, retraemos con cuidado los electrodos de registro y dejamos reposar la preparación durante al menos 30 minutos para permitir que el tinte se difunda en los procesos finos de la neurona.

A continuación, transfiera el plato con la preparación a un microscopio fluorescente. Utilizamos una lente de inmersión en agua 10 veces NA 0.3 en un microscopio de platina fija vertical, que enfoca moviendo la lente y no la platina. Esto facilita el montaje de los manipuladores.

Para los electrodos de registro, seleccione un bloque de filtro adecuado. Un bloque de tres filtros SI proporcionará los filtros de excitación y emisión correctos para el naranja cálcico, ajustará los parámetros de la cámara y la intensidad de la iluminación con filtros de densidad neutra y la apertura de campo. Más luz dará como resultado menos ruido, pero potencialmente puede blanquear la preparación.

La cámara CCD cool snap puede capturar un campo de 500 por 300 píxeles a una velocidad de fotogramas de alrededor de 30 fotogramas por segundo y una buena relación señal/ruido. Minimice la iluminación de las neuronas filosóficas manteniendo el obturador de las fuentes de luz cerrado siempre que sea posible. En el software de creación de imágenes, seleccione las regiones de interés o R ois.

Estas regiones definen dónde el software tomará las mediciones de intensidad. Por lo general, obtenemos imágenes de las ramas primaria, secundaria y terciaria de la neurona presináptica. Coloque un ROI adicional junto a la neurona difi para obtener un valor de fondo que luego se resta de todos los demás puntos de datos.

Los electrodos de registro intracelular en las neuronas pre y postsinápticas se utilizan para inducir y monitorear la transmisión sináptica. Puede garantizar la sincronización entre la adquisición de datos electrofisiológicos y de imagen si utiliza la señal de disparo de fotograma de salida de la cámara para iniciar el software de adquisición de datos. Otra forma de garantizar la sincronización es montar un LED dentro del puerto de la cámara.

Este LED se enciende brevemente al comienzo de la sesión de grabación y, por lo tanto, proporciona una marca de sincronización. Durante un experimento típico, se activan potenciales de acción en la neurona presináptica mediante la inyección de breves pulsos de corriente. En este ejemplo, mostramos una ráfaga de picos y los aumentos correspondientes en la señal de calcio para probar hipótesis específicas.

La señal de calcio puede ser manipulada y determinar los efectos sobre la transmisión sináptica. Por ejemplo, fármacos como el quelante de calcio EGTA pueden inyectarse presinápticamente o aplicarse a través del sistema de perfusión. Los datos se analizan exportándolos desde el software de imágenes a un archivo de texto y luego al software que se utilizó para adquirir los datos electrofisiológicos, que en nuestro caso es el pico dos de Cambridge Electronic Design.

Utilizamos un script escrito a medida para trazar los valores de intensidad del ROI y los cambios correspondientes en el potencial de membrana, cuantificamos los cambios en la señal de calcio restando la señal de fondo obtenida del ROI de fondo y calculamos el cambio relativo con la ecuación mostrada. F cero es la fluorescencia justo antes de la estimulación, y F es la fluorescencia durante la estimulación. Aquí mostramos los resultados de un experimento en el que obtuvimos imágenes de cambios en la fluorescencia del calcio en la neurona B 21 identificada.

La región que fotografiamos está indicada en A, en B uno, inducimos una ráfaga de picos en B 21, lo que indujo potenciales postsinápticos en B ocho y un cambio en la señal de calcio. B dos muestra el efecto de la inyección del quelante de calcio. Los picos de EGTA en B 21 ya no inducen aumentos generalizados en la fluorescencia del calcio y la amplitud del potencial postsináptico disminuye.

En conclusión, hemos demostrado técnicas que se pueden utilizar para monitorizar simultáneamente la concentración de calcio intracelular y evaluar la eficacia de la transmisión sináptica. Estas técnicas requieren solo un equipo modesto en comparación con la mayoría de las imágenes funcionales y son fáciles y rápidas de aprender.