Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T

Generación de linfocitos T de madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células da un enfoque alternativo de la utilización de células madre embrionarias para células T basada en la inmunoterapia. El método muestra que mediante la utilización de cualquiera

El objetivo general de este procedimiento es generar y caracterizar linfocitos T a partir de células madre pluripotentes inducidas o IPS. A continuación, las células IPS pueden diferenciarse in vitro en un sistema de cultivo OP nine DL one y luego madurar in vivo en un ratón con deficiencia de trapo. O bien, las células pueden ser modificadas genéticamente para sobreexpresar OT un TCR y luego transferirse adoptivamente para el desarrollo in vivo.

Después de seis semanas de diferenciación in vivo, los ratones pueden ser desafiados mediante inyección intraperitoneal con siete células tumorales EEG y luego se puede evaluar la especificidad del antígeno de las células T derivadas de IPS. En última instancia, las células IPS pueden diferenciarse en células T convencionales y específicas de antígeno, las últimas de las cuales pueden proteger a los animales del desafío tumoral. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la inmunoterapia individualizada contra el cáncer.

El método permite la generación de un gran número de células T reactivas al tumor derivadas de una cantidad mínima de sangre o tejido cutáneo del paciente. En el día cero, transfiera cinco veces 10 a la cuarta células IPS en una placa de cultivo de 100 milímetros que contiene una monocapa confluente OP nueve, DL de una célula en un medio alfa MEM al 20% FBS en el día cinco, Ojos de tripsina. A continuación, centrifugar las células después de incubarlas en una placa de cultivo fresca de 100 milímetros durante 30 minutos y una placa de incubación de 37 grados, cinco veces 10 a la quinta de las células flotantes en 20% FBS alfa, medios MEM y tres ligandos planos de ratón en una nueva placa de 100 milímetros que contiene una monocapa de OP nueve. DL una célula en el octavo día pipetea suavemente las células sueltas, centrifuga las células y luego transfiere las células a un solo pocillo de una placa de cultivo de seis pocillos recubierta con OP confluente nueve células DL one incuban las células a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante dos semanas más el día 22.

Incubar las células IPS desprendidas en medios frescos en una nueva placa de cultivo a 37 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, retire aproximadamente la mitad de las células flotantes y páselas a través de un colador de nailon de 70 micras para excluir los grumos de células y lave la suspensión de una sola célula resultante tres veces con PBS frío. Después del tercer lavado, vuelva a suspender las células en PBS a 1,5 veces la décima parte de la séptima célula por mililitro y mantenga las células en hielo antes de la inyección intravenosa.

Coloque a un ratón de cuatro semanas de edad con deficiencia de trapo bajo una luz infrarroja para dilatar la vena de la cola. A continuación, llene una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26 y medio con 200 microlitros de la suspensión celular y transfiera adoptivamente las células a través de la vena de la cola dilatada. Tres semanas más tarde, después de confirmar la eutanasia del ratón transferido adoptivamente, se extirpan los ganglios linfáticos y el bazo después de descomponer mecánicamente los tejidos.

Limente la suspensión unicelular con un tampón de lisis CK y luego lave los mononucleitos resultantes dos veces en PBS frío. Luego, después de la tinción de marcadores de superficie celular, evalúe las células mediante análisis de citometría de flujo en el día cero, use el reactivo de transfección de genes JAMA para transfectar celdas de empaquetado de placa E plateadas durante la noche con un OT un MIDR en la semilla del primer día una vez 10 a las seis celdas IPS en un pocillo de una placa de 24 pocillos precodificada de gelatina al 0,1% en el segundo día, recoja el pseudovirus que contiene S natin de las células de la plataforma E y luego páselo a través de un filtro de 0,4 micras para excluir posibles contaminantes después de la centrifugación. Transducción de las células en presencia de policerebro durante una hora a 330 veces G a 32 grados Celsius.

Incubarlos durante la noche a la misma temperatura después de repetir el procedimiento de transducción. La tripsina examina las células IPS transducidas en el cuarto día y luego, después de la granulación, las células vuelven a suspender las células en medios frescos y las siembran en células alimentadoras snl 7 6 7 irradiadas precodificadas. Una vez que las células transducidas hayan alcanzado la convergencia, clasifique las células dobles positivas rojas GFP y DS mediante citometría de flujo.

Seis semanas después de la transferencia adoptiva de las células IPS, inyecte 50 microlitros de EEG, siete células thoma en la cavidad peritoneal del mismo ratón en el día 50 de la provocación tumoral. Utilice un kit de aislamiento de células T positivas CD ocho de biotecnología mil E para clasificar las células T CD ocho positivas del bazo y los ganglios linfáticos del animal transferido adoptivamente. Mezcle las células T CD ocho positivas aisladas con un tamaño de SPOC irradiado de un ratón C 57 negro seis J ingenuo en una proporción de uno a 10 y pulse el cocultivo con 0,5 micromoles por milésima de óvulos durante 40 horas.

A partir de entonces, agregue felden A a las células durante otras cuatro horas. Finalmente, evaluar las poblaciones celulares mediante análisis citométrico de flujo después de aislar los citos SP de un ratón C 57 negro seis J naïve. Divida la suspensión de la celda en dos grupos.

Etiquete el grupo alto de CFSE con cinco micromoles por mil de CFSE y pulse las células con 10 microgramos por mil de péptido de óvulos durante una hora, etiquete el grupo bajo A-C-F-S-E con 0,5 micróbolos por mil de CFSE y no pulse. Mezcle 2,5 veces 10 a la sexta, las celdas altas de CFSE con 2,5 veces 10 a la sexta, las celdas bajas de CFSE en PBS. A continuación, analice los citos mediante citometría de flujo para determinar la expresión de CFSE.

16 horas después de la transferencia adoptiva al ratón de interés Para contar las células tumorales intraperitoneales en el día 20 de la provocación tumoral. Utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 18 y medio y PBS frío para lavar la cavidad peritoneal. Cuente las células tumorales recuperadas para identificar las células tumorales infiltrantes.

Extirpar el tumor en una etapa tardía de la provocación tumoral y luego cortar el tumor en tres partes. Coloque la primera pieza tumoral en un frasco criogénico y coloque el frasco sobre hielo seco. Fije inmediatamente la segunda pieza de formaldehído.

Conserve la tercera pieza en medios RPMI 1640 acondicionados después de secar al aire las secciones de tejido criopreservado. Fíjelos en acetona fría durante 15 minutos después de secar al aire las secciones fijas durante otros 15 minutos. Lave los portaobjetos durante cinco minutos en PBS después del lavado.

Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda y cubra las secciones de tejido con 30 microlitros de 3%B, SA y PBS durante 30 minutos para bloquear la unión inespecífica. A continuación, seque el tampón de bloqueo e incube las secciones de tejido con una mezcla de 50 microlitros de anticuerpo pe anti TCR RV alfa dos y anticuerpo fitzy anti óvulos diluida en PSA al 3% en PBS en la cámara húmeda durante dos horas al final de la incubación. Lave los portaobjetos tres veces en PBS frío, finalmente monte las secciones con un medio de montaje a base de agua antes del examen microscópico fluorescente para el análisis de citometría de flujo de las células T que infiltran tumores.

Aplastar el tumor en una suspensión de una sola célula. A continuación, analice las celdas en busca de marcadores de superficie específicos. C, CD, tres y TCR beta se utilizan como marcadores de células T para determinar si la estimulación de las células IPS con el ligando notch DL one podría contribuir a la expresión de la superficie celular de las células CD, cuatro y CD-ocho, en las células CD tres positivas, TCR r, beta positivas, derivadas de células IPS positivas.

Observe el diagrama de puntos de la derecha, que muestra el día 22 CD, tres TCR R, beta positivo, CD, cuatro CD negativos, ocho linfocitos T positivos simples positivos generados a partir de células IPS in vitro. Además, las células positivas individuales derivadas de las células IPS de la figura anterior produjeron interleucina dos e interferón gamma cuando se estimularon in vitro mediante anticuerpos anti CD 3 y anti CD 28 solubles recubiertos de placas, lo que confirma que las células T derivadas de las células IPS son funcionales después de la transferencia adoptiva a ratones receptores. La mayoría de las células IPS transducidas por el gen TCR se diferenciaron en CTL CD ocho positivos, que respondieron in vitro a la estimulación peptídica mediante la secreción de interleucina dos e interferón gamma en estos diagramas de puntos a partir de células agrupadas de ganglios linfáticos y bazo.

Se generaron ocho células CD V beta beta cinco células T positivas en ratones transferidos adoptivamente con células IPS transducidas por TCR, pero no transducidas por control. Las poblaciones positivas para CD eight V beta cinco positivas fueron positivas para la tinción de citocinas intracelulares para la producción de interleucina dos e interferón gamma representada en estos histogramas por las líneas oscuras en comparación con los histogramas de control de isotipo sombreados, lo que indica que los CTL derivados de IPS eran funcionales. Estos datos muestran que las células altas de CFSE pulsaron con éptido representado por los picos de la derecha en cada gráfico y las células de control bajo de CFSE representadas por los picos de la izquierda que se inyectaron en ratones 10 semanas después de la transferencia de células IPS o un día después de la transferencia de O OT una transferencia de CTL.

Las CTL derivadas de IPS específicas del antígeno respondieron a la estimulación del antígeno y tuvieron actividad citotóxica, como lo indica la ausencia de células altas de CFSE aquí. Las células IPS transducidas por un gen TCR OT se transfirieron adoptivamente a C 57, seis ratones negros y luego los ratones se sometieron a un desafío con EEG, siete células tumorales en el día 20, se enumeraron las células tumorales en la cavidad peritoneal. Obsérvese la reducción significativa en el número de células tumorales en los ratones que recibieron TCR TRANSDUCED IPS en comparación con los grupos de control.

Lo que es más importante, la transferencia adoptiva de células TCR TRANSDUCED IPS desencadenó la infiltración de CTLs hiperreactivas en los tejidos tumorales y protegió a los animales del desafío tumoral, como se observa en esta tinción h y e de los tejidos tumorales recuperados días 30 a 35 después de los tumores de desafío tumoral de ratones transferidos adoptivamente con células transducidas TCR o CTL OT one, pero no inyectados simulados o control. Las células transducidas fueron infiltradas por células inflamatorias, como lo indican las flechas rojas aquí. Se encontró que los óvulos específicos V alfa dos CTL positivos en rojo infiltraban óvulos que expresaban tejidos tumorales en verde.

Mientras que los tumores en ratones de los grupos de control tenían menos o ninguna célula infiltrante tumoral en esta figura, las suspensiones de células individuales de los tejidos tumorales se analizaron para la expresión de la positividad V alfa dos y la positividad V beta cinco mediante citometría de flujo después de la activación en la población CD ocho positiva. Tenga en cuenta que los tejidos tumorales de ratones transferidos adoptivamente con células IPS transducidas TCR exhibieron el nivel más alto de células infiltrantes tumorales, mientras que los tumores de ratones que recibieron el control. Las IPS transducidas no mostraron infiltración de células T positivas CD ocho específicas para óvulos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar células T específicas de antígeno a partir de células IPS y cómo evaluar las funciones de las células T derivadas de IPS.