Name: Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Aprende a generar linfocitos T a partir de células madre pluripotentes inducidas mediante diferenciación in vitro e in vivo. Este método permite obtener células T convencionales y antigénico-específicas para inmunoterapia contra cáncer.

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Agradecemos al Dr. Shinya Yamanaka (Universidad de Kyoto) para proporcionar iPS-MEF-Ng-20D-17 línea celular, el Dr. Darío Vignali (Hospital St. Jude Childrens Research) para apoyar la OT1-2A • pMig II construcción, el Dr. Juan Carlos Zúñiga Pflucker (Departamento de Inmunología de la Universidad de Toronto) para el apoyo a la línea celular OP9-DL1, y el Dr. Kent Vrana E (Departamento de Farmacología de la Universidad de Penn State College of Medicine) para ayudar al diseño de este estudio. Este proyecto está financiado, en virtud de concesiones con el número de concesión K18CA151798 del Instituto Nacional del Cáncer, la Fundación Barsumian y el Melanoma Research Foundation (canción J.).

<ol><li>Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T+cell+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive T cell therapy of cancer.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Seki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7%2FSTAT5+cytokine+signaling+pathway+is+essential+but+insufficient+for+maintenance+of+naive+CD4+T+cell+survival+in+peripheral+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs.</a> J. Immunol. 178, 262-270 (2007).</li>
<li>Stemberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+can+develop+into+diverse+effector+and+memory+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets.</a> Immunity. 27, 985-997 (2007).</li>
<li>Siewert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-driven+development%3A+effector%2Fmemory-like+alphaE%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cells+originate+from+both+naive+T+cells+and+naturally+occurring+naive-like+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells.</a> J. Immunol. 180, 146-155 (2008).</li>
<li>Wang, L. X., Plautz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-primed%2C+in+vitro-activated+CD4%2B+effector+T+cells+establish+long-term+memory+without+exogenous+cytokine+support+or+ongoing+antigen+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure.</a> J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).</li>
<li>Hinrichs, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117, 808-814 (2011).</li>
<li>Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+a+tumor-specific%2C+MHC-unrestricted+T-cell+receptor+expressed+on+effector+cells+of+the+innate+and+the+adaptive+immune+system+through+bone+marrow+transduction+and+immune+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution.</a> Blood. 105, 4583-4589 (2005).</li>
<li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).</li>
<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+generation+of+tumor-specific+T+cells+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells+via+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling.</a> Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).</li>
<li>Boztug, K. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoztug%2C+K+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. Med, N. .E. ngl.J. . 363, 1918-1927 (2010).</li>
<li>Peerani, R., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+stem+cell+therapies+through+synthetic+stem+cell-niche+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering.</a> J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466, 829-834 (2010).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+generation+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells+for+combined+gene+and+cell+therapy+of+hematologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am.+Soc.+Hematol.+Educ.+Program%22%5BJournal%5D)">Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).</li>
<li>Boitano, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329, 1345-1348 (2010).</li>
<li>Himburg, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat. Med. 16, 475-482 (2010).</li>
<li>Tanigaki, K., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lymphocyte+development+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of lymphocyte development by Notch signaling.</a> Nature immunology. 8, 451-456 (2007).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474, 212-215 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

<html> Para ACT terapias basadas en la generación in vitro de un gran número de Ag altamente reactivos específicos de las células T in vivo para la re-perfusión es una solución óptima. Aunque nuestro método in vitro da lugar funcional de las células T a partir de células iPS, un gran número de células iPS derivadas de las células mueren en cuatro semanas, sobre todo en la cuarta semana. Se concluye que las señales de supervivencia de señalización Notch mediada por el DL1 así como la IL-7 y Flt3...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> C57BL/6J ratones </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 000664 </td></tr><tr><td> B6.129S7-Rag1 tm1Mom / J </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 002216 </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (2C11) anticuerpo </td><td> BD PharMingen </td><td> 553058 </td></tr><tr><td> Anti-CD28 (37,51) de anticuerpos </td><td> BD PharMingen </td><td> 553295 </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (17A2) de anticuerpos </td><td> BioLegend </td><td> 100202 </td></tr><tr><td> Los anti-CD4 (GK1.5) de anticuerpos </td><td> BioLegend </td><td> 100417 </td></tr><tr><td> Anti-CD8 (53-6,7) de anticuerpos </td><td> BioLegend </td><td> 100714 </td></tr><tr><td> Anti-CD25 (3C7) de anticuerpos </td><td> BioLegend </td><td> 101912 </td></tr><tr><td> Unti-CD44 (1M7) de anticuerpos </td><td> BioLegend </td><td> 103012 </td></tr><tr><td> Anti-CD117 (2B8) de anticuerpos </td><td> BioLegend </td><td> 105812 </td></tr><tr><td> Anti-TCR-β (H57597) de anticuerpos </td><td> BioLegend </td><td> 109220 </td></tr><tr><td> Anti-IL-2 (JES6-5H4) anticuerpo </td><td> BioLegend </td><td> 503810 </td></tr><tr><td> Anti-IFN-γ (XMG1.2) de anticuerpos </td><td> BioLegend </td><td> 505822 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> α-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> A10490-01 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3007.01 </td></tr><tr><td> Un Brefeldin </td><td> Sigma </td><td> B7651 </td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> 107689 </td></tr><tr><td> GeneJammer </td><td> Integrado de Ciencias </td><td> 204130 </td></tr><tr><td> ARN kit &lt;/ Td&gt; <td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> ADN kit </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> CD8 kit de aislamiento </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-095-236 </td></tr><tr><td> Tampón de lisis ACK </td><td> Lonza </td><td> 10-548E </td></tr><tr><td> mFlt-3L </td><td> PeproTech </td><td> 250-31L </td></tr><tr><td> mIL-7 </td><td> PeproTech </td><td> 217-17 </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma </td><td> G9391 </td></tr><tr><td> FITC anti-OVA anticuerpo </td><td> Rockland Immunochemicals </td><td> 200-4233 </td></tr><tr><td> Permeabilización de amortiguación </td><td> BioLegend </td><td> 421002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A7906 </td></tr><tr><td> Formaldehído </td><td> Sigma </td><td> F8775 </td></tr><tr><td> 0,4 m de filtro </td><td> Millipore </td><td></td></tr><tr><td&gt; MoFlo clasificador de células </td><td> Dake Cytomation </td><td></td></tr><tr><td> Calibur citómetro de flujo </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> LSR II citómetro de flujo </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> Ratón inmovilización </td><td> Braintree Científico </td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos t

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

La transferencia de células adoptivo (ACT) de antígenos específicos de células CD8 + linfocitos T citotóxicos (CTL) es un tratamiento prometedor para una variedad de tumores malignos 1. CTL puede reconocer las células malignas mediante la interacción con los antígenos tumorales receptores de células T (TCR), y citotoxinas liberación de citoquinas, así como para matar las células malignas. Se sabe que menos disociados y central-memoria como-(denominado altamente reactivo) CTL son la población óptima para ACT basado en inmunoterapia, porque estos CTL tienen un potencial proliferativo alta, son menos propensos a la apoptosis que las células más diferenciadas y tienen un mayor capacidad para responder a las citoquinas homeostáticos 2-7. Sin embargo, debido a las dificultades en la obtención de un elevado número de linfocitos T citotóxicos tales de los pacientes, hay una necesidad urgente de encontrar un nuevo enfoque para generar altamente reactivos Ag-CTLs específicos para el éxito a base de ACT-terapias. TCR transducción del vástago auto-renovablecélulas para la reconstitución inmune tiene un potencial terapéutico para el tratamiento de enfermedades 8-10. Sin embargo, el enfoque para obtener células madre embrionarias (CME) de los pacientes no es factible. Aunque el uso de células madre hematopoyéticas (HSC) con fines terapéuticos ha sido ampliamente aplicado en la clínica de 11-13, las CMH se han reducido la capacidad de diferenciación y proliferación, y las CMH son difíciles de crecer en cultivo celular in vitro 14-16. La tecnología reciente de células iPS y el desarrollo de un sistema in vitro para la entrega de genes son capaces de generar células iPS de pacientes sin ningún tipo de abordaje quirúrgico. Además, como CME, las células iPS poseen la capacidad proliferativa indefinida in vitro, y se ha demostrado que se diferencian en células hematopoyéticas. De este modo, las células iPS tienen un mayor potencial para ser utilizado en el ACT basado en inmunoterapia en comparación con los CES o HSCs. Aquí, se presentan métodos para la generación de linfocitos Tcitos de las células iPS in vitro y en vivo de la programación de antígenos específicos de linfocitos T citotóxicos de las células iPS para la promoción de la vigilancia del cáncer inmunológico. La estimulación in vitro con un ligando muesca impulsa la diferenciación de células T a partir de células iPS, y TCR resultados de transducción de genes en células iPS diferenciadores en antígenos específicos de células T in vivo, lo cual impide el crecimiento del tumor. De este modo, demostramos antígeno específico de la diferenciación de células T a partir de células iPS. Nuestros estudios proporcionan un enfoque potencialmente más eficientes para la generación de antígenos específicos de linfocitos T citotóxicos para las terapias basadas en ACT y facilitar el desarrollo de estrategias terapéuticas para las enfermedades.

Generación de linfocitos T de madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células da un enfoque alternativo de la utilización de células madre embrionarias para células T basada en la inmunoterapia. El método muestra que mediante la utilización de cualquiera<em&gt; In vitro</em&gt; O<em&gt; En vivo</em&gt; Sistema de inducción, las células iPS son capaces de diferenciarse en los linfocitos T, tanto convencionales como antígeno específico.

Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T

La transferencia adoptiva de células (ACT) de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ específicos de antígeno es un tratamiento prometedor para una variedad de neoplasias malignas 1. Los CTL pueden...

El objetivo general de este procedimiento es generar y caracterizar linfocitos T a partir de células madre pluripotentes inducidas o células IPS. Las células IPS pueden diferenciarse luego in vitro en un sistema de cultivo OP9-DL1 y posteriormente madurarse in vivo en un ratón deficiente en rag. O bien, las células pueden modificarse genéticamente para sobreexpresar el TCR OT1 y luego transferirse adoptivamente para su desarrollo in vivo.Después de seis semanas de diferenciación in vivo, los ratones pueden ser expuestos mediante inyección intraperitoneal con siete células tumorales EEG, y luego se puede evaluar la especificidad antigénica de las células T derivadas de IPS. En última instancia, las células IPS pueden diferenciarse en células T convencionales y específicas para antígenos, siendo estas últimas capaces de proteger a los animales frente al desafío tumoral. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la inmunoterapia contra el cáncer individualizada.El método permite la generación de un gran número de linfocitos T reactivos frente al tumor a partir de una cantidad mínima de sangre o tejido cutáneo del paciente. En el día cero, transfiera cinco veces 10 a la cuar

directed-differentiation-induced-pluripotent-stem-cells-towards-t

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El video muestra un ensayo que utiliza células T CD8+ derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) para inhibir la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) en ratones. Estas células T, modificadas con receptores específicos del VHB, se transfieren a ratones transgénicos. A continuación, los plásmidos del genoma del VHB competentes para la replicación se inyectan directamente en el hígado, lo que permite la absorción del ADN viral. Una vez que los antígenos virales son...

Supresión de la replicación del virus de la hepatitis B mediante linfocitos T específicos de antígenos virales

Este video muestra un ensayo para generar células T CD8αβ+ derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) específicas de antígeno tumoral. Las iPSC específicas del antígeno tumoral se cultivan en una monocapa de células estromales y se diferencian en células progenitoras hematopoyéticas (HPC). Las HPC se diferencian en linfocitos T CD4+ CD8+ doble positivo mediante un medio de diferenciación. A continuación, estas células se estimulan para generar células T monopositivas que expresan...

Generación de células T CD8 positivas individuales a partir de células madre pluripotentes inducidas

Las células madre embrionarias de ratón pueden diferenciarse a células T in vitro utilizando el sistema de cocultivo OP9-DL1. El éxito en este procedimiento requiere una atención cuidadosa al mantenimiento del reactivo/célula y a los pasos sensibles de la técnica clave. Aquí discutimos estos parámetros críticos y proporcionamos un protocolo detallado para fomentar la adopción de esta tecnología.

Derivación de células T In Vitro De células madre embrionarias de ratón

Este protocolo describe la inducción eficiente de endotelio hemogénico y progenitores hematopoyéticos multipotenciales a partir de células madre pluripotentes humanas a través de la expresión forzada de factores de transcripción.

La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos

Este protocolo describe cómo generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas en condiciones libres de alimentadores utilizando una combinación de vectores de virus Matrigel y Sendai que contienen factores de reprogramación.

Generación de pluripotentes inducidas células madre a partir de células T periféricas Humanos Uso de Sendai virus en Condiciones-Feeder gratuita

El objetivo de este protocolo es mostrar el protocolo para reprogramar linfocitos infiltrantes de tumores de melanoma en células madre pluripotentes inducidas.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de melanoma humano linfocitos infiltrantes de tumores,

Presentamos aquí un método para desarrollar células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) para la inmunoterapia de la artritis autoinmune en un modelo murino.

Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Aquí, presentamos pluripotentes humanas protocolos de cultura de la célula de vástago (hPSC), solía diferenciarse hPSCs a CD34+ de progenitores hematopoyéticos. Este método utiliza la manipulación de la fase específica de canónica WNT de señalización especificar las células exclusivamente ya sea definitivo o primitiva hematopoyética programa.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

Este artículo describe un método novedoso para generar antígenos tumorales inducidos por células madre pluripotentes inducidas por antígenos timáticos (iTE) por un sistema de cultivo timico tridimensional (3D). iTE son un subconjunto homogéneo de células T estrechamente relacionadas con células T ingenuas con la capacidad de proliferación, formación de la memoria y supresión tumoral.

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

En este artículo se describe un método para generar un método para generar un antígeno tumoral funcional específico de antígeno pluripotente derivado de células madreCD8- + células T positivas únicas utilizando el sistema de cocultivo OP9/DLL1.

Uso de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la generación de células T específicas de antígenos tumorales

Aquí se presenta un protocolo para la supresión efectiva de la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) en ratones mediante la utilización de la transferencia de células adoptivas (ACT) de linfocitos T específicos de antígeno viral derivado de células madre (Ag). Este procedimiento puede adaptarse para una posible inmunoterapia basada en ACT de infección por VHB.

Linfocitos T virales derivados de células madre suprimen la replicación del VHB en ratones

Aprende a generar linfocitos T a partir de células madre pluripotentes inducidas mediante diferenciación in vitro e in vivo. Este método permite obtener células T convencionales y antigénico-específicas para inmunoterapia contra cáncer.

Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T

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