Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T

El objetivo general de este procedimiento es generar y caracterizar linfocitos T a partir de células madre pluripotentes inducidas o células IPS. Las células IPS pueden diferenciarse luego in vitro en un sistema de cultivo OP9-DL1 y madurarse posteriormente in vivo en un ratón deficiente en rag. O bien, las células pueden modificarse genéticamente para sobreexpresar el TCR OT-I y transferirse adoptivamente para su desarrollo in vivo.

Después de seis semanas de diferenciación in vivo, los ratones pueden ser desafiados mediante inyección intraperitoneal con siete células tumorales EEG, y luego se puede evaluar la especificidad antigénica de las células T derivadas de IPS. En última instancia, las células IPS pueden diferenciarse en células T convencionales y específicas para antígenos, siendo estas últimas capaces de proteger a los animales frente al desafío tumoral. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la inmunoterapia contra el cáncer individualizada.

El método permite la generación de grandes cantidades de linfocitos T reactivos contra tumores a partir de una mínima cantidad de sangre del paciente o tejido cutáneo. En el día cero, transfiera cinco veces 10 a la cuarta de células IPS a una placa de cultivo de 100 milímetros que contenga una monocapa confluyente de células OP9-DL1 en medio alpha MEM con 20% de FBS. En el día cinco, realice una tripsinización, centrifugue las células tras incubarlas en una placa de cultivo fresca de 100 milímetros durante 30 minutos en un incubador a 37 grados, y siembre cinco veces 10 a la quinta de las células en suspensión en medio alpha MEM con 20% de FBS y ligando de mouse FLT3 en una nueva placa de cultivo de 100 milímetros que contenga una monocapa de células OP9-DL1. En el día ocho, pipetee suavemente las células débilmente adheridas, centrifugue las células y luego transfiera las células a un solo pocillo de una placa de cultivo de seis pocillos recubierta con células OP9-DL1 confluentes. Incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante otras dos semanas. En el día 22.

Incube las células IPS separadas en medio fresco en una nueva placa de cultivo a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Luego, retire aproximadamente la mitad de las células en suspensión y páselas a través de un filtro de nylon de 70 micrones para excluir agregados celulares, y lave la suspensión resultante de células individuales tres veces con PBS frío. Después del tercer lavado, re suspenda las células en PBS a una concentración de 1,5 veces 10 a la séptima células por mililitro y mantenga las células en hielo antes de la inyección intravenosa.

Coloque un ratón deficiente en rag de cuatro semanas bajo una luz infrarroja para dilatar la vena de la cola. Luego, llene una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26 y medio con 200 microlitros de la suspensión celular y transfiera adoptivamente las células a través de la vena de la cola dilatada. Tres semanas después, tras confirmar la eutanasia del ratón que recibió la transferencia adoptiva, retire los ganglios linfáticos y el bazo tras descomponer mecánicamente los tejidos.

Licee la suspensión de células individuales con un tampón de lisis CK y luego lave los monocitos resultantes dos veces con PBS frío. Después de la tinción para marcadores de superficie celular, evalúe las células mediante análisis citométrico de flujo en el día cero; utilice el reactivo de transfección JAMA para transfectar durante la noche las células empaquetadoras plat E con un OT uno MIDR. En el día uno, siembre una vez 10 a la seis células IPS en un pozo de una placa de 24 pozos recubierta previamente con gelatina al 0,1 %. En el día dos, recolecte el pseudovirus que contiene S natin de las células plat E y páselo a través de un filtro de 0,4 micrones para excluir posibles contaminantes tras la centrifugación. Transduzca las células en presencia de polibreno durante una hora a 330 veces G a 32 grados Celsius.

Incubarlos durante la noche a la misma temperatura después de repetir el procedimiento de transducción. El día cuatro, usar tripsina para separar las células IPS transducidas y, tras el centrifugado, resuspender las células en medio fresco y sembrarlas sobre células alimentadoras pre-codificadas e irradiadas snl 7 6 7. Una vez que las células transducidas hayan alcanzado confluencia, clasificar las células doblemente positivas para GFP y DS red mediante citometría de flujo.

Seis semanas después de la transferencia adoptiva de las células IPS, inyecte 50 microlitros de células EEG seven thoma en la cavidad peritoneal del mismo ratón en el día 50 del desafío tumoral. Utilice un kit de aislamiento de células T CD8 positivas Mil E Biotech para separar las células T CD8 positivas del bazo y los ganglios linfáticos del animal transferido adoptivamente. Mezcle las células T CD8 positivas aisladas con esplenocitos irradiados de un ratón C57BL/6J naïve en una proporción de 1 a 10 y estimule la co-cultura con 0,5 micromoles por mililitro de ova durante 40 horas.

Posteriormente, agregue el felden A a las células durante otras cuatro horas. Finalmente, evalúe las poblaciones celulares mediante análisis citométrico de flujo tras aislamiento de células SP de un ratón C57BL/6J naïve. Divida la suspensión celular en dos grupos.

Etiquete el grupo con alta concentración de CFSE con cinco micromoles por mililitro de CFSE y estimule las células con 10 microgramos por mililitro de péptido de ova durante una hora; etiquete el grupo con baja concentración de CFSE con 0,5 MICROMOLES por mililitro de CFSE y no realice la estimulación. Mezcle 2,5 veces 10 a la sexta de las células con alta concentración de CFSE con 2,5 veces 10 a la sexta de las células con baja concentración de CFSE en PBS. A continuación, analice las células mediante citometría de flujo para evaluar la expresión de CFSE.

16 horas después de la transferencia adoptiva en el ratón de interés, para contar las células tumorales intraperitoneales el día 20 del desafío tumoral. Utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 18 y medio y PBS frío para lavar la cavidad peritoneal. Cuente las células tumorales recuperadas para identificar las células infiltrantes tumorales.

Extraiga el tumor en una etapa avanzada del desafío tumoral y luego corte el tumor en tres piezas. Coloque la primera pieza del tumor en un vial criogénico y coloque el vial sobre hielo seco. Fije inmediatamente la segunda pieza en formaldehído.

Conservar el tercer fragmento en medio RPMI 1640 enriquecido tras secar al aire las secciones de tejido criopreservadas. Fijarlas en acetona fría durante 15 minutos tras secar al aire las secciones fijadas durante otros 15 minutos. Lavar las laminillas durante cinco minutos en PBS tras el lavado.

Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda y cubra las secciones de tejido con 30 microlitros de 3 %B, SA y PBS durante 30 minutos para bloquear la unión no específica. A continuación, retire el tampón de bloqueo por absorción y incube las secciones de tejido con una mezcla de 50 microlitros de anticuerpo pe anti TCR RV alfa dos y anticuerpo fitzy anti ova, diluidos en 3 %PSA en PBS, en la cámara húmeda durante dos horas. Al final de la incubación, lave los portaobjetos tres veces con PBS frío y, finalmente, monte las secciones con un medio de montaje acuoso antes del examen microscópico de fluorescencia para el análisis citométrico de flujo de linfocitos T infiltrantes en el tumor.

Presione el tumor para obtener una suspensión de células individuales. Luego analice las células en busca de marcadores superficiales específicos. C CD tres y TCR beta se utilizan como marcadores de linfocitos T para determinar si la estimulación de células IPS con el ligando de Notch DL uno podría contribuir a la expresión en la superficie celular de CD cuatro y CD ocho en células derivadas de células IPS positivas para CD tres y TCR r beta positivas.

Observe el diagrama de dispersión a la derecha, que muestra linfocitos T CD3 positivos, TCRβ positivos, CD4 negativos, CD8 positivos, de maduración única, generados a partir de células IPS in vitro. Además, las células de maduración única derivadas de células IPS de la figura anterior produjeron interleucina 2 e interferón γ cuando se estimularon in vitro con anticuerpos anti-CD3 recubiertos en placa y anticuerpos anti-CD28 solubles, lo que confirma que los linfocitos T derivados de células IPS son funcionales tras la transferencia adoptiva en ratones receptores. La mayoría de las células IPS transducidas con el gen del TCR se diferenciaron en linfocitos T citotóxicos CD8 positivos, que respondieron in vitro a la estimulación con péptidos mediante la secreción de interleucina 2 e interferón γ en estos diagramas de dispersión provenientes de células agrupadas de ganglios linfáticos y bazo.

Se generaron células T CD8 positivas Vβ5 positivas en ratones que recibieron células IPS transducidas con TCR mediante transferencia adoptiva, pero no en ratones que recibieron células IPS transducidas control. Las poblaciones CD8 positivas Vβ5 positivas fueron positivas para la tinción intracelular de citocinas, mostrando producción de interleucina 2 e interferón gamma, representadas en estos histogramas por líneas oscuras en comparación con los histogramas de control de isotipo sombreados, lo que indica que los CTL derivados de IPS eran funcionales. Estos datos muestran que las células CFSE altas pulsadas con epítopo, representadas por los picos en la derecha en cada gráfica, y las células control CFSE bajas, representadas por los picos en la izquierda, se inyectaron en ratones 10 semanas después de la transferencia de células IPS o un día después de la transferencia de CTL OOT1.

Los CTL derivados de IPS específicos para el antígeno respondieron a la estimulación con antígeno y mostraron actividad citotóxica, como se indica por la ausencia de células CFSE altas aquí. Las células IPS transducidas con el gen del TCR OT uno se transfirieron adoptivamente a ratones C57BL/6, y posteriormente los ratones fueron sometidos a un desafío con células tumorales EG7 el día 20; las células tumorales en la cavidad peritoneal se contaron. Obsérvese la reducción significativa en el número de células tumorales en los ratones que recibieron IPS transducidas con TCR en comparación con los grupos control.

Lo más importante es que la transferencia adoptiva de células IPS TRANSDUCIDAS con TCR indujo la infiltración de CTLs hiperreactivos en los tejidos tumorales y protegió a los animales frente al reto tumoral, tal como se observa en esta tinción de H y E de tejidos tumorales recuperados entre los días 30 y 35 tras el reto tumoral. Tumores de ratones que recibieron transferencia adoptiva de células transducidas con TCR o de CTLs OT uno, pero no de ratones inyectados con control simulado. Las células transducidas fueron infiltradas por células inflamatorias, como indican las flechas rojas aquí. Se encontró que los CTLs específicos contra Ova, positivos para V alfa dos (en rojo), infiltraron los tejidos tumorales que expresaban Ova (en verde).

Aunque los tumores en ratones de los grupos de control mostraron pocas o ninguna célula infiltrante tumoral en esta figura, se analizaron suspensiones de células individuales procedentes de tejidos tumorales para evaluar la expresión de positividad para V alfa dos y positividad para V beta cinco mediante citometría de flujo, tras seleccionar la población positiva para CD ocho. Obsérvese que los tejidos tumorales de ratones que recibieron transferencia adoptiva de células IPS transducidas con TCR exhibieron el nivel más alto de células infiltrantes tumorales, mientras que los tumores de ratones que recibieron IPS transducidas de control no mostraron infiltración por linfocitos T positivos para CD ocho y específicos para ova.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar linfocitos T específicos para antígenos a partir de células IPS y cómo evaluar las funciones de los linfocitos T derivados de células IPS.