Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

El objetivo general de este experimento es desarrollar un nuevo método para generar células T reguladoras asociadas a articulaciones inflamadas derivadas de células madre, para la inmunoterapia contra la artritis autoinmune. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la autoinmunidad sobre posibles inmunoterapéuticos para la artritis autoinmune. La principal ventaja de esta técnica es que las células T reguladoras derivadas de células madre son tipificadas y de un solo tipo.

Comience diluyendo las células alimentadoras de interés hasta una densidad mínima de uno por diez a la cuarta células por centímetro cuadrado en medio OP9, y siembre un millón de células alimentadoras por placa de 10 centímetros. Cuando las células alcancen una confluencia del 80 al 90 %, retire el medio de los cultivos y siembre de 0,5 a un millón de células madre pluripotentes inducidas transducidas por retrovirus, o IPSC, en medio OP9 en cada placa. Cinco días después, aspire el medio y lave las células con 10 mililitros de PBS.

Luego, desprenda las células con cuatro mililitros de tripsina por placa, a 37 grados Celsius. Después de 10 minutos, detenga las reacciones con ocho mililitros de medio IPSC y recupere las células para centrifugación. Re_suspenda el botón celular en 10 mililitros de medio IPSC fresco y siembre nuevamente las células en nuevas placas de 10 centímetros.

Deje que las células alimentadoras se adhieran a la placa durante 30 minutos en la incubadora de cultivo celular. Luego, recoja los IPSCs en suspensión y filtre las células transducidas a través de un tamiz de 70 micrones para su conteo. Siembre cinco veces 10 a la quinta IPSCs sobre una placa fresca de células alimentadoras al 80-90 % de confluencia en medio OP9 suplementado con Murine-Flt3-Ligand y devuelva los cultivos a la incubadora.

Después de tres días, utilice una pipeta de 10 mililitros para lavar el recipiente con el medio de cultivo. A continuación, agregue cinco mililitros de medio OP9 fresco al recipiente y lave suavemente cualquier IPSC semiadherente mediante pipeteo cuidadoso y enérgico que no perturbe la capa de células alimentadoras. Repita el lavado con 10 mililitros de PBS para recolectar las últimas células semiadherentes, recogiendo los lavados de cada recipiente en un tubo cónico por cultivo.

Después de centrifugar las células, re-suspender los sedimentos en 10 mililitros de medio OP9 suplementado con Murine-Flt3-Ligand e IL-7 y filtrar las células a través de un tamiz de 70 micrones. Sembrar una cultura de IPSC por pocillo en una placa de cultivo de seis pocillos que contenga monocapas de células alimentadoras con una confluencia del 80 al 90% y devolver los co-cultivos al incubador. Cada dos días, reemplazar la mitad del medio con medio OP9 fresco suplementado con Murine-Flt3-Ligand e IL-7, y cada cuatro a seis días, resembrar las IPSC en diferenciación en nuevas placas con una capa fresca de células alimentadoras según sea necesario.

Comience por separar los cultivos celulares de interés con tripsina y resuspenda cada tipo celular en 10 mililitros de medio fresco. Siembre cada cultivo celular en una placa nueva de 10 centímetros y permita que las células alimentadoras se adhieran en el incubador de cultivo celular. Después de 30 minutos, recoja las iPSCs en suspensión y pase los cultivos individualmente a través de filtros celulares de 70 micrones para eliminar los agregados celulares antes del recuento.

Re-suspender cada cultivo a una concentración de 1,5 veces 10 a la séptima células por mililitro en PBS frío, filtrando nuevamente según sea necesario. Luego, colocar ratones hembras C57BL/6 de cuatro a seis semanas de edad, uno a la vez, en un sujetador para animales pequeños y transferir adoptivamente 200 microlitros de un tipo de célula por ratón en la vena de la cola de cada animal. Utilizar un calibrador con indicador analógico para medir la hinchazón de ambas rodillas y establecer la medición basal.

Diez días después de la transferencia celular, utilice una jeringa de un mililitro para inyectar a los ratones con 100 microgramos de BSA metilada emulsionada en adyuvante completo de Freund en la base de la cola de cada animal experimental. Diecisiete días después de la transferencia celular, induzca artritis mediante inyección intraarticular de 20 microgramos de BSA metilada en 10 microlitros de PBS en la articulación de la rodilla izquierda y 20 microgramos de BSA metilada y 100 microgramos de albúmina de huevo completa en 10 microlitros de PBS en la articulación de la rodilla derecha de cada animal anestesiado que haya recibido la transferencia adoptiva. Siete días después de inducir la artritis, mida nuevamente las rodillas para calcular el porcentaje de aumento en el diámetro de la rodilla y extirpe quirúrgicamente las rótulas.

Fije las articulaciones en formalina. Luego, tras la descalcificación en EDTA, incluya las rodillas en parafina y obtenga secciones de cuatro micrones para tinción histoquímica y análisis. En el día 28, las células T reguladoras específicas del antígeno expresan niveles sustanciales de CD3 y receptores de células T específicos del antígeno.

La mayoría de estas células también expresan CD25, CD127 y CTLA-4, todos los cuales generalmente se expresan a niveles elevados en las células T reguladoras naturales. De hecho, FoxP3 persiste en las células T reguladoras derivadas de IPSC, incluso después de una estimulación prolongada in vitro con el ligando Notch, como se detectó mediante tinción intracelular. Además, estas células T reguladoras derivadas de IPSC específicas para antígenos producen citocinas supresoras cuando se estimulan con esplenocitos pulsados con antígeno in vitro, lo que indica un fenotipo supresor potencial para estas células.

Se observan células positivas para FoxP3 en rodillas tratadas con OVA, sin que sean evidentes células positivas para FoxP3 en rodillas que reciben IPSCs transducidas con vector control. Además, se visualizan muchas más células positivas para CD4, positivas para FoxP3 y positivas para TCR3 Beta 5 en las rodillas de ratones que reciben IPSCs transducidas con el vector TCR-FoxP3, en comparación con el vector FoxP3 solo, lo que sugiere que las células IPSC-Treg específicas para antígeno migran hacia la rodilla con artritis inducida por antígeno tras su transferencia adoptiva en animales receptores. La transferencia adoptiva de células derivadas de IPSC también provoca una disminución sustancial del edema inflamatorio en la rodilla cuando está presente OVA, pero no tiene efecto en rodillas inyectadas con BSA metilada control.

Los efectos positivos de la reducción de la hinchazón se confirman además mediante imágenes de micro-TC de alta resolución de la pérdida ósea reducida observada en rodillas tratadas con transferencia celular en comparación con animales inyectados únicamente con MBSA de control. Una vez organizado, este procedimiento detallado puede completarse en seis semanas si se realiza adecuadamente. Al intentar esta técnica, es importante recordar inducir la diferenciación impregnada de las IPSC transducidas con el antígeno TCR-FoxP3.

Tras seguir este procedimiento, también se pueden considerar diferentes compuestos de citocinas supresoras para responder preguntas adicionales sobre la supervivencia y calidad de las células T reguladoras iPSC específicas para antígenos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia basada en células exploraran el papel de las células T reguladoras específicas para antígenos en enfermedades autoinmunes. No olvide que trabajar con factores autólogos directos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en una instalación básica de dos niveles, al realizar un procedimiento.

Gracias por ver el video y buena suerte con su experimento.