Name: Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprende a generar células T reguladoras específicas de antígeno a partir de células madre pluripotentes inducidas para inmunoterapia contra artritis autoinmune. Este método produce poblaciones uniformes y funcionales.

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Este proyecto fue financiado, en parte, en virtud de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01AI121180, R21AI109239 y K18CA151798), la Asociación Americana de la Diabetes (1-16-IBS-281), y el Departamento de Salud de Pensilvania (Fondos del Acuerdo de Tabaco) a JS

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<li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+all-trans+retinoic+acid+in+stabilizing+human+natural+regulatory+T+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-9-CD44+interaction+enhances+stability+and+function+of+adaptive+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells.</a> Immunity. 41, 270-282 (2014).</li>
<li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).</li>
<li>Ramos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+caspase+9+suicide+gene+to+improve+the+safety+of+mesenchymal+stromal+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies.</a> Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).</li>
<li>Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3+and+Bcl-xL+cooperatively+promote+regulatory+T+cell+persistence+and+prevention+of+arthritis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development.</a> Arthritis Res Ther. 12, R66(2010).</li>
<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antigen-specific+human+regulatory+T+cells%3A+immunosuppression+of+FVIII-specific+T-+and+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses.</a> Blood. 125, 1107-1115 (2015).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat Med. 16, 475-482 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, un paso crítico es la diferenciación in vitro de TCR / FoxP3 iPSCs de genes transducidos. In vitro de señalización Notch induce el desarrollo hacia el linaje de células T. Para diferenciar células iPS en CD4 + FoxP3 + células T reguladoras, hemos utilizado las células B OP9-DL1 / DL4 / IA, que MHC II (IA b) moléculas altamente exprés. La mayoría de las iPSCs se diferencian en células CD4 +. Sin embargo, después de la expresión de...

La artritis autoinmune es una enfermedad sistémica caracterizada por hiperplasia del tejido sinovial y destrucción progresiva del cartílago articular, hueso y ligamentos1. La generación o función defectuosa de Tregs en la artritis autoinmune contribuye a la inflamación crónica y la lesión tisular porque las Tregs juegan un papel crucial en la prevención del desarrollo de células inmunitarias autorreactivas. 
La manipulación de Tregs es una estrategia ideal para el desarrollo de terapias para suprimir la inflamación de una manera dependiente de Ag. Para la inmunoterapia basada en Treg, la especificidad de las Tregs transferidas es importante para el tratamiento de la autoinmunidad en curso2. Para exhibir la actividad supresora, las Tregs necesitan migrar y ser retenidas en la región afectada, lo que puede ser dirigido por la especificidad del TCR para el Ag en esa ubicación3. Aunque las Tregs policlonales pueden contener una pequeña población que contiene esta especificidad de Ag de sus TCR, el número de estas Tregs específicas de Ag suele ser bajo. En consecuencia, las terapias celulares que utilizan Tregs policlonales contra trastornos autoinmunes requieren transferencias adoptivas de un gran número de Tregs4,5. Debido a que las células madre pluripotentes (PSC) tienen la capacidad de convertirse en cualquier tipo de célula, las PSC-Tregs específicas de Ag pueden resultar buenas candidatas para la inmunoterapia basada en Treg. Estudios anteriores han demostrado el desarrollo exitoso de células T derivadas de PSC, incluidas las Tregs6-8. 
Aquí, describimos un protocolo para desarrollar iPSC-Tregs específicas de Ag. Describimos además una terapia basada en células para la artritis autoinmune en un modelo murino utilizando dichas Tregs. Este método se basa en la modificación genética de iPSCs murinas con TCRs específicos de Ag y el factor transcripcional FoxP3. A continuación, las iPSC modificadas se diferencian en Tregs específicas de Ag en las células estromales OP9 que expresan las moléculas de ligandos Notch DL1, DL4 y MHC-II (I-A b) en presencia de las citocinas mFlt3L y mIL-7. Estas iPSC-Tregs específicas de Ag pueden producir citocinas supresoras, como TGF-β e IL-10, cuando se estimulan con Ag, y la transferencia adoptiva de dichas Tregs tiene la capacidad de suprimir el desarrollo de AIA en un modelo murino. El protocolo descrito se puede utilizar para desarrollar Tregs específicas de Ag derivadas de células madre para posibles intervenciones terapéuticas.

<table><tbody><tr><td>Ratones C57BL/6j</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7 Rag1tm1Mom/J</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>2216</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD3 (2C11)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD28 (37.51)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD4 (GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8 ( 53 y ndash; 6.7) anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD25 (3C7)</td><td>Anti-101912</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biolegend Anti-TCR-&beta; (H57597) anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL10</td><td>Biolegend</td><td>505010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>141402</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Genejammer</td><td>Ciencia integrada</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis ACK</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Precaución: Alergénico, cancerígeno, tóxico</td></tr><tr><td>Tampón de permeabilización</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>421002</tr><tr><td>mBSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de óvulos</td><td>Avantor</td><td>0440-01</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>Difco</td><td>2017014</td><td></td></tr><tr><td>Restrainer Braintree</td><td>scientific</td><td>RTV 150-STD</td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo de derivados de células madre las células t reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Las enfermedades autoinmunes se presentan debido a la pérdida de inmunológica auto-tolerancia. Las células T reguladoras (Tregs) son importantes mediadores de la auto-inmunológica tolerancia. Tregs representan aproximadamente el 5 - 10% de la subpoblación de células T CD4 maduro + en ratones y humanos, con aproximadamente 1 - 2% de esas células T reguladoras que circulan en la sangre periférica. células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) pueden diferenciarse en células T reguladoras funcional, que tienen un potencial para ser utilizado para terapias basadas en células de enfermedades autoinmunes. A continuación, presentamos un método para desarrollar antígeno (Ag) Tregs específicos de células iPS a partir de (es decir, IPSC-Tregs). El método se basa en la incorporación del factor de transcripción FoxP3 y un receptor de células T Ag-específico (TCR) en iPSCs y luego diferenciar en células que expresan Notch OP9 estromales ligandos delta-como (DL) 1 y DL4. Después de la diferenciación in vitro, las células T reguladoras IPSC-expresan CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, y Ag-TCR específico y son capaces de responder a la estimulación Ag.Este método se ha aplicado con éxito a la terapia basada en células de la artritis autoinmune en un modelo murino. La transferencia adoptiva de estas Ag-específica IPSC-Tregs en la artritis inducida por Ag (AIA) ratones llevando los tiene la capacidad de reducir la inflamación articular y la inflamación y para prevenir la pérdida de hueso.

Como se muestra aquí, en el día 28, Ag-específica Tregs expresa sustancialmente CD3 y Ag-específica TCR, dos marcadores de células T. La población CD3 + + TCRVβ5 expresa CD4. La mayoría de las células CD3 + CD4 + TCRVβ5 + también expresan CD25, CD127, y CTLA-4, que se expresan típicamente en niveles elevados en origen natural, reglas T (nTregs) y en células T que expresan FoxP3 ectópica. FoxP3 expresión en las células deri...

Presentamos aquí un método para desarrollar células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) para la inmunoterapia de la artritis autoinmune en un modelo murino.

Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

El objetivo general de este experimento es desarrollar un nuevo método para generar células T reguladoras asociadas a articulaciones inflamadas derivadas de células madre, para la inmunoterapia contra la artritis autoinmune. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la autoinmunidad sobre posibles inmunoterapéuticos para la artritis autoinmune. La principal ventaja de esta técnica es que las células T reguladoras derivadas de células madre son tipificadas y de un solo tipo.Comience diluyendo las células alimentadoras de interés hasta una densidad mínima de uno por diez a la cuarta células por centímetro cuadrado en medio OP9, y siembre un millón de células alimentadoras por placa de 10 centímetros. Cuando las células alcancen una confluencia del 80 al 90 %, retire el medio de los cultivos y siembre de 0,5 a un millón de células madre pluripotentes inducidas transducidas por retrovirus, o IPSC, en medio OP9 en cada placa. Cinco días después, aspire el medio y lave las células con 10 mililitros de PBS.Luego, desprenda las células con cuatro mililitros de tripsina por placa, a 37 grados Celsius. Después de 10 minutos, detenga las reacciones con ocho mililitro

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Las células T reguladoras: potencial terapéutico para el tratamiento de rechazo de trasplantes y diabetes tipo I

Se describe un método para la generación de regulación, la memoria y el ingenuo células T de un donante de sangre humana única. Polarizada Tregs puede ser entonces en comparación con otros subconjuntos en una variedad de aplicaciones genéticas y funcionales con homogeneidad genética, incluyendo un ensayo de supresión también detallan aquí.

La generación de células T reguladoras inducidas de células humanas primarias T vírgenes y de memoria

Generación de linfocitos T de madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células da un enfoque alternativo de la utilización de células madre embrionarias para células T basada en la inmunoterapia. El método muestra que mediante la utilización de...

Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T

Este video muestra una terapia basada en células para la artritis autoinmune en ratones. Las células T reguladoras derivadas de iPSC que expresan receptores específicos de ovoalbúmina se inyectan con albúmina sérica bovina metilada (mBSA) emulsionada en un adyuvante. Las células presentadoras de antígenos murinos (APC) procesan y presentan la mBSA a las células T, lo que provoca la activación de las células T y la migración a la membrana sinovial de la articulación de la rodilla. Las...

Una terapia basada en células para la artritis autoinmune en un modelo murino

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La transducción adenoviral de células T CD4 + naïve a estudiar la diferenciación Treg

Este artículo describe un método novedoso para generar antígenos tumorales inducidos por células madre pluripotentes inducidas por antígenos timáticos (iTE) por un sistema de cultivo timico tridimensional (3D). iTE son un subconjunto homogéneo de células T estrechamente relacionadas con células T ingenuas con la capacidad de proliferación, formación de la memoria y supresión tumoral.

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

Este artículo describe un protocolo para la generación de células T CD8 específicas de antígenos, y su expansión in vitro, con el objetivo de producir un alto número de células T funcionales para su uso in vitro e in vivo.

Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas de ratón primario específicas de antígenos para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune

En este artículo se describe un método para generar un método para generar un antígeno tumoral funcional específico de antígeno pluripotente derivado de células madreCD8- + células T positivas únicas utilizando el sistema de cocultivo OP9/DLL1.

Uso de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la generación de células T específicas de antígenos tumorales

Aquí se presenta un protocolo para la supresión efectiva de la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) en ratones mediante la utilización de la transferencia de células adoptivas (ACT) de linfocitos T específicos de antígeno viral derivado de células madre (Ag). Este procedimiento puede adaptarse para una posible inmunoterapia basada en ACT de infección por VHB.

Linfocitos T virales derivados de células madre suprimen la replicación del VHB en ratones

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano

Aprende a generar células T reguladoras específicas de antígeno a partir de células madre pluripotentes inducidas para inmunoterapia contra artritis autoinmune. Este método produce poblaciones uniformes y funcionales.

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