Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

El objetivo general de este experimento es desarrollar un nuevo método para generar células T reguladoras asociadas a articulaciones inflamadas derivadas de células madre para la inmunoterapia contra la artritis autoinmune. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la autoinmunidad sobre los posibles inmunoterméuicos para la artritis autoinmune. La principal ventaja de esta técnica es que las células T reguladoras derivadas de células madre son nyped y de un solo tipo.

Comience diluyendo las celdas alimentadoras de interés a una densidad mínima de una vez 10 las cuatro celdas por centímetro cuadrado en el medio OP9, y coloque una vez 10 en las seis celdas alimentadoras por plato de 10 centímetros. Cuando las células tengan un 80 a 90% de confluentes, retire el medio de los cultivos y siembre de 0,5 a un por 10 al quinto, células madre pluripotentes inducibles transducibles retroviralmente o IPSC en medio OP9 en cada placa. Cinco días después, aspirar el medio y lavar las células con 10 mililitros de PBS.

Luego, separe las celdas con cuatro mililitros de tripsina por plato, a 37 grados centígrados. Después de 10 minutos, detenga las reacciones con ocho mililitros de medio IPSC y extraiga las células para la centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio IPSC fresco y vuelva a colocar las células en nuevas placas de 10 centímetros.

Deje que las células alimentadoras se adhieran a la placa durante 30 minutos en la incubadora de cultivos celulares. A continuación, recoja las IPSC flotantes y filtre las células transducidas a través de un colador de 70 micras para contarlas. Siembre cinco veces 10 a la quinta IPSC en una placa fresca de 80 a 90% de células alimentadoras confluentes en medio OP9 suplementado con Murine-Flt3-Ligand y devuelva los cultivos a la incubadora.

Después de tres días, use una pipeta de 10 mililitros para lavar el plato con el medio de cultivo. A continuación, añada cinco mililitros de medio OP9 fresco al plato y lave suavemente las IPSC semiadherentes con un pipeteo cuidadoso y contundente que no altere la capa de células alimentadoras. Repita el lavado con 10 mililitros de PBS para recolectar la última de las células semiadherentes, tirando de los lavados de cada plato en un tubo cónico por cultivo.

Después de centrifugar las células, vuelva a suspender los gránulos en 10 mililitros de medio OP9 suplementado con Murine-Flt3-Ligand e IL-7 y filtre las células a través de un colador de 70 micras. Siembre un cultivo de IPSC por pocillo en una placa de cultivo de seis pocillos que contenga entre un 80 y un 90% de monocapas de células alimentadoras confluentes y devuelva los cocultivos a la incubadora. Cada dos días, reemplace la mitad del medio con medio OP9 fresco suplementado con Murine-Flt3-Ligand e IL-7, y cada cuatro a seis días, vuelva a sembrar las IPSC diferenciadoras en nuevas placas con una capa nueva de células alimentadoras según sea necesario.

Comience por separar los cultivos celulares de interés con tripsina y resuspender cada tipo de célula en 10 mililitros de medio fresco. Coloque cada cultivo celular en un plato nuevo de 10 centímetros y permita que las células alimentadoras se adhieran a la incubadora de cultivo celular. Después de 30 minutos, recoja las IPSC flotantes y pase los cultivos a través de filtros de células individuales de 70 micras para eliminar los grupos de células para el recuento.

Vuelva a suspender cada cultivo a una concentración de 1,5 veces 10 a la séptima célula por mililitro en PBS frío, filtrando nuevamente según sea necesario. A continuación, coloque ratones hembra C57BL/6 de cuatro a seis semanas de edad, uno a la vez, en un sujetador de animales pequeños y transfiera adoptivamente 200 microlitros de un tipo de célula por ratón a la vena de la cola de cada animal. Use un calibrador de cuadrante para medir la hinchazón de ambas rodillas y establecer la medición de referencia.

10 días después de la transferencia de células, use una jeringa de un mililitro para inyectar a los ratones 100 microgramos de BSA metilado emulsionado en el adyuvante completo de Freund en la base de la cola de cada animal de experimentación. 17 días después de la transferencia celular, inducir artritis mediante la inyección intraarticular de 20 microgramos de BSA metilado en 10 microlitros de PBS en la articulación de la rodilla izquierda y 20 microgramos de BSA metilado y 100 microgramos de ovoalbúmina entera en 10 microlitros de PBS en la articulación de la rodilla derecha de cada animal anestesiado transferido adoptivamente. Siete días después de inducir la artritis, vuelva a medir las rodillas para calcular el aumento porcentual en el diámetro de la rodilla y extirpe quirúrgicamente la rótula.

Fije las juntas en formol. Luego, después de la descalcificación en EDTA, incruste las rodillas en parafina y obtenga secciones de cuatro micras para la tinción y el análisis histoquímicos. En el día 28, las células T reguladoras específicas del antígeno expresan niveles sustanciales de CD3 y receptores de células T específicas del antígeno.

La mayoría de estas células también expresan CD25, CD127 y CTLA-4, todos los cuales se expresan típicamente en niveles elevados en las células T reguladoras naturales. De hecho, FoxP3 persiste en las células T reguladoras derivadas de IPSC, incluso después de una estimulación in vitro a largo plazo con el ligando Notch, como se detecta mediante tinción intracelular. Además, estas células reguladoras de IPSC T específicas de antígeno producen citocinas supresoras cuando se estimulan con esplenocitos pulsados por antígeno in vitro, lo que indica un fenotipo supresor potencial para estas células.

Se observan células FoxP3 positivas en las rodillas tratadas con OVA, sin que se observen células FoxP3 positivas en las rodillas que reciben IPSC transducidas por vectores de control. Además, se visualizan muchas más células CD4 positivas, FoxP3 positivas y TCR3 Beta 5 positivas en las rodillas de los ratones que reciben IPSC transducidas con el vector TCR-FoxP3, que con el vector FoxP3 solo, lo que sugiere que las células IPSC-Treg específicas del antígeno migran a la rodilla de la artritis inducida por el antígeno después de su transferencia adoptiva a los animales receptores. La transferencia adoptiva de células derivadas de IPSC también afecta a una disminución sustancial de la hinchazón inflamatoria de la rodilla cuando hay OVA, pero no tiene ningún efecto sobre las rodillas inyectadas con BSA metilado de control.

Los efectos positivos de la reducción de la hinchazón se confirman aún más por las imágenes de micro-TC de alta resolución de la reducción de la pérdida ósea observada en las rodillas tratadas con transferencia celular en comparación con los animales de control inyectados solo con MBSA. Una vez reunidos, estos procedimientos en profundidad pueden completarse en seis semanas si se realizan correctamente. Al intentar esta técnica, es importante recordar inducir la diferenciación imbuida de las IPSC transducidas por el antígeno TCR-FoxP3.

Siguiendo este procedimiento, también se pueden deliberar diferentes compuestos de citocinas supresoras para responder preguntas adicionales sobre la supervivencia y la calidad de las células T reg de las IPSC específicas del antígeno. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia basada en células exploraran el papel de las células T reguladoras específicas del antígeno en las enfermedades autoinmunes. No olvide que trabajar con bactores directos de carrocería puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en una instalación básica de dos, al realizar un procedimiento.

Gracias por mirar y buena suerte con tu experimento.