Name: Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprende a generar células T reguladoras específicas de antígeno a partir de células madre pluripotentes inducidas para inmunoterapia contra artritis autoinmune. Este método produce poblaciones uniformes y funcionales.

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Este proyecto fue financiado, en parte, en virtud de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01AI121180, R21AI109239 y K18CA151798), la Asociación Americana de la Diabetes (1-16-IBS-281), y el Departamento de Salud de Pensilvania (Fondos del Acuerdo de Tabaco) a JS

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<li>Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3+and+Bcl-xL+cooperatively+promote+regulatory+T+cell+persistence+and+prevention+of+arthritis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development.</a> Arthritis Res Ther. 12, R66(2010).</li>
<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antigen-specific+human+regulatory+T+cells%3A+immunosuppression+of+FVIII-specific+T-+and+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses.</a> Blood. 125, 1107-1115 (2015).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat Med. 16, 475-482 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, un paso crítico es la diferenciación in vitro de TCR / FoxP3 iPSCs de genes transducidos. In vitro de señalización Notch induce el desarrollo hacia el linaje de células T. Para diferenciar células iPS en CD4 + FoxP3 + células T reguladoras, hemos utilizado las células B OP9-DL1 / DL4 / IA, que MHC II (IA b) moléculas altamente exprés. La mayoría de las iPSCs se diferencian en células CD4 +. Sin embargo, después de la expresión de...

La artritis autoinmune es una enfermedad sistémica caracterizada por hiperplasia del tejido sinovial y destrucción progresiva del cartílago articular, hueso y ligamentos1. La generación o función defectuosa de Tregs en la artritis autoinmune contribuye a la inflamación crónica y la lesión tisular porque las Tregs juegan un papel crucial en la prevención del desarrollo de células inmunitarias autorreactivas. 
La manipulación de Tregs es una estrategia ideal para el desarrollo de terapias para suprimir la inflamación de una manera dependiente de Ag. Para la inmunoterapia basada en Treg, la especificidad de las Tregs transferidas es importante para el tratamiento de la autoinmunidad en curso2. Para exhibir la actividad supresora, las Tregs necesitan migrar y ser retenidas en la región afectada, lo que puede ser dirigido por la especificidad del TCR para el Ag en esa ubicación3. Aunque las Tregs policlonales pueden contener una pequeña población que contiene esta especificidad de Ag de sus TCR, el número de estas Tregs específicas de Ag suele ser bajo. En consecuencia, las terapias celulares que utilizan Tregs policlonales contra trastornos autoinmunes requieren transferencias adoptivas de un gran número de Tregs4,5. Debido a que las células madre pluripotentes (PSC) tienen la capacidad de convertirse en cualquier tipo de célula, las PSC-Tregs específicas de Ag pueden resultar buenas candidatas para la inmunoterapia basada en Treg. Estudios anteriores han demostrado el desarrollo exitoso de células T derivadas de PSC, incluidas las Tregs6-8. 
Aquí, describimos un protocolo para desarrollar iPSC-Tregs específicas de Ag. Describimos además una terapia basada en células para la artritis autoinmune en un modelo murino utilizando dichas Tregs. Este método se basa en la modificación genética de iPSCs murinas con TCRs específicos de Ag y el factor transcripcional FoxP3. A continuación, las iPSC modificadas se diferencian en Tregs específicas de Ag en las células estromales OP9 que expresan las moléculas de ligandos Notch DL1, DL4 y MHC-II (I-A b) en presencia de las citocinas mFlt3L y mIL-7. Estas iPSC-Tregs específicas de Ag pueden producir citocinas supresoras, como TGF-β e IL-10, cuando se estimulan con Ag, y la transferencia adoptiva de dichas Tregs tiene la capacidad de suprimir el desarrollo de AIA en un modelo murino. El protocolo descrito se puede utilizar para desarrollar Tregs específicas de Ag derivadas de células madre para posibles intervenciones terapéuticas.

<table><tbody><tr><td>Ratones C57BL/6j</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7 Rag1tm1Mom/J</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>2216</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD3 (2C11)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD28 (37.51)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD4 (GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8 ( 53 y ndash; 6.7) anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD25 (3C7)</td><td>Anti-101912</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biolegend Anti-TCR-&beta; (H57597) anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL10</td><td>Biolegend</td><td>505010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>141402</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Genejammer</td><td>Ciencia integrada</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis ACK</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Precaución: Alergénico, cancerígeno, tóxico</td></tr><tr><td>Tampón de permeabilización</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>421002</tr><tr><td>mBSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de óvulos</td><td>Avantor</td><td>0440-01</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>Difco</td><td>2017014</td><td></td></tr><tr><td>Restrainer Braintree</td><td>scientific</td><td>RTV 150-STD</td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo de derivados de células madre las células t reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Las enfermedades autoinmunes se presentan debido a la pérdida de inmunológica auto-tolerancia. Las células T reguladoras (Tregs) son importantes mediadores de la auto-inmunológica tolerancia. Tregs representan aproximadamente el 5 - 10% de la subpoblación de células T CD4 maduro + en ratones y humanos, con aproximadamente 1 - 2% de esas células T reguladoras que circulan en la sangre periférica. células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) pueden diferenciarse en células T reguladoras funcional, que tienen un potencial para ser utilizado para terapias basadas en células de enfermedades autoinmunes. A continuación, presentamos un método para desarrollar antígeno (Ag) Tregs específicos de células iPS a partir de (es decir, IPSC-Tregs). El método se basa en la incorporación del factor de transcripción FoxP3 y un receptor de células T Ag-específico (TCR) en iPSCs y luego diferenciar en células que expresan Notch OP9 estromales ligandos delta-como (DL) 1 y DL4. Después de la diferenciación in vitro, las células T reguladoras IPSC-expresan CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, y Ag-TCR específico y son capaces de responder a la estimulación Ag.Este método se ha aplicado con éxito a la terapia basada en células de la artritis autoinmune en un modelo murino. La transferencia adoptiva de estas Ag-específica IPSC-Tregs en la artritis inducida por Ag (AIA) ratones llevando los tiene la capacidad de reducir la inflamación articular y la inflamación y para prevenir la pérdida de hueso.

Como se muestra aquí, en el día 28, Ag-específica Tregs expresa sustancialmente CD3 y Ag-específica TCR, dos marcadores de células T. La población CD3 + + TCRVβ5 expresa CD4. La mayoría de las células CD3 + CD4 + TCRVβ5 + también expresan CD25, CD127, y CTLA-4, que se expresan típicamente en niveles elevados en origen natural, reglas T (nTregs) y en células T que expresan FoxP3 ectópica. FoxP3 expresión en las células deri...

Presentamos aquí un método para desarrollar células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) para la inmunoterapia de la artritis autoinmune en un modelo murino.

Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

El objetivo general de este experimento es desarrollar un nuevo método para generar células T reguladoras asociadas a articulaciones inflamadas derivadas de células madre, para la inmunoterapia contra la artritis autoinmune. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la autoinmunidad sobre posibles inmunoterapéuticos para la artritis autoinmune. La principal ventaja de esta técnica es que las células T reguladoras derivadas de células madre son tipificadas y de un solo tipo.Comience diluyendo las células alimentadoras de interés hasta una densidad mínima de uno por diez a la cuarta células por centímetro cuadrado en medio OP9, y siembre un millón de células alimentadoras por placa de 10 centímetros. Cuando las células alcancen una confluencia del 80 al 90 %, retire el medio de los cultivos y siembre de 0,5 a un millón de células madre pluripotentes inducidas transducidas por retrovirus, o IPSC, en medio OP9 en cada placa. Cinco días después, aspire el medio y lave las células con 10 mililitros de PBS.Luego, desprenda las células con cuatro mililitros de tripsina por placa, a 37 grados Celsius. Después de 10 minutos, detenga las reacciones con ocho mililitros de medio IPSC y recupere las células para centrifugación. Re_suspenda el botón celular en 10 mililitros de medio IPSC fresco y siembre nuevamente las células en nuevas placas de 10 centímetros.Deje que las células alimentadoras se adhieran a la placa durante 30 minutos en la incubadora de cultivo celular. Luego, recoja los IPSCs en suspensión y filtre las células transducidas a través de un tamiz de 70 micrones para su conteo. Siembre cinco veces 10 a la quinta IPSCs sobre una placa fresca de células alimentadoras al 80-90 % de confluencia en medio OP9 suplementado con Murine-Flt3-Ligand y devuelva los cultivos a la incubadora.Después de tres días, utilice una pipeta de 10 mililitros para lavar el recipiente con el medio de cultivo. A continuación, agregue cinco mililitros de medio OP9 fresco al recipiente y lave suavemente cualquier IPSC semiadherente mediante pipeteo cuidadoso y enérgico que no perturbe la capa de células alimentadoras. Repita el lavado con 10 mililitros de PBS para recolectar las últimas células semiadherentes, recogiendo los lavados de cada recipiente en un tubo cónico por cultivo.Después de centrifugar las células, re-suspender los sedimentos en 10 mililitros de medio OP9 suplementado con Murine-Flt3-Ligand e IL-7 y filtrar las células a través de un tamiz de 70 micrones. Sembrar una cultura de IPSC por pocillo en una placa de cultivo de seis pocillos que contenga monocapas de células alimentadoras con una confluencia del 80 al 90% y devolver los co-cultivos al incubador. Cada dos días, reemplazar la mitad del medio con medio OP9 fresco suplementado con Murine-Flt3-Ligand e IL-7, y cada cuatro a seis días, resembrar las IPSC en diferenciación en nuevas placas con una capa fresca de células alimentadoras según sea necesario.Comience por separar los cultivos celulares de interés con tripsina y resuspenda cada tipo celular en 10 mililitros de medio fresco. Siembre cada cultivo celular en una placa nueva de 10 centímetros y permita que las células alimentadoras se adhieran en el incubador de cultivo celular. Después de 30 minutos, recoja las iPSCs en suspensión y pase los cultivos individualmente a través de filtros celulares de 70 micrones para eliminar los agregados celulares antes del recuento.Re-suspender cada cultivo a una concentración de 1,5 veces 10 a la séptima células por mililitro en PBS frío, filtrando nuevamente según sea necesario. Luego, colocar ratones hembras C57BL/6 de cuatro a seis semanas de edad, uno a la vez, en un sujetador para animales pequeños y transferir adoptivamente 200 microlitros de un tipo de célula por ratón en la vena de la cola de cada animal. Utilizar un calibrador con indicador analógico para medir la hinchazón de ambas rodillas y establecer la medición basal.Diez días después de la transferencia celular, utilice una jeringa de un mililitro para inyectar a los ratones con 100 microgramos de BSA metilada emulsionada en adyuvante completo de Freund en la base de la cola de cada animal experimental. Diecisiete días después de la transferencia celular, induzca artritis mediante inyección intraarticular de 20 microgramos de BSA metilada en 10 microlitros de PBS en la articulación de la rodilla izquierda y 20 microgramos de BSA metilada y 100 microgramos de albúmina de huevo completa en 10 microlitros de PBS en la articulación de la rodilla derecha de cada animal anestesiado que haya recibido la transferencia adoptiva. Siete días después de inducir la artritis, mida nuevamente las rodillas para calcular el porcentaje de aumento en el diámetro de la rodilla y extirpe quirúrgicamente las rótulas.Fije las articulaciones en formalina. Luego, tras la descalcificación en EDTA, incluya las rodillas en parafina y obtenga secciones de cuatro micrones para tinción histoquímica y análisis. En el día 28, las células T reguladoras específicas del antígeno expresan niveles sustanciales de CD3 y receptores de células T específicos del antígeno.La mayoría de estas células también expresan CD25, CD127 y CTLA-4, todos los cuales generalmente se expresan a niveles elevados en las células T reguladoras naturales. De hecho, FoxP3 persiste en las células T reguladoras derivadas de IPSC, incluso después de una estimulación prolongada in vitro con el ligando Notch, como se detectó mediante tinción intracelular. Además, estas células T reguladoras derivadas de IPSC específicas para antígenos producen citocinas supresoras cuando se estimulan con esplenocitos pulsados con antígeno in vitro, lo que indica un fenotipo supresor potencial para estas células.Se observan células positivas para FoxP3 en rodillas tratadas con OVA, sin que sean evidentes células positivas para FoxP3 en rodillas que reciben IPSCs transducidas con vector control. Además, se visualizan muchas más células positivas para CD4, positivas para FoxP3 y positivas para TCR3 Beta 5 en las rodillas de ratones que reciben IPSCs transducidas con el vector TCR-FoxP3, en comparación con el vector FoxP3 solo, lo que sugiere que las células IPSC-Treg específicas para antígeno migran hacia la rodilla con artritis inducida por antígeno tras su transferencia adoptiva en animales receptores. La transferencia adoptiva de células derivadas de IPSC también provoca una disminución sustancial del edema inflamatorio en la rodilla cuando está presente OVA, pero no tiene efecto en rodillas inyectadas con BSA metilada control.Los efectos positivos de la reducción de la hinchazón se confirman además mediante imágenes de micro-TC de alta resolución de la pérdida ósea reducida observada en rodillas tratadas con transferencia celular en comparación con animales inyectados únicamente con MBSA de control. Una vez organizado, este procedimiento detallado puede completarse en seis semanas si se realiza adecuadamente. Al intentar esta técnica, es importante recordar inducir la diferenciación impregnada de las IPSC transducidas con el antígeno TCR-FoxP3.Tras seguir este procedimiento, también se pueden considerar diferentes compuestos de citocinas supresoras para responder preguntas adicionales sobre la supervivencia y calidad de las células T reguladoras iPSC específicas para antígenos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia basada en células exploraran el papel de las células T reguladoras específicas para antígenos en enfermedades autoinmunes. No olvide que trabajar con factores autólogos directos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en una instalación básica de dos niveles, al realizar un procedimiento.Gracias por ver el video y buena suerte con su experimento.

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Se describe un método para la generación de regulación, la memoria y el ingenuo células T de un donante de sangre humana única. Polarizada Tregs puede ser entonces en comparación con otros subconjuntos en una variedad de aplicaciones genéticas y funcionales con homogeneidad genética, incluyendo un ensayo de supresión también detallan aquí.

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Este artículo describe un método novedoso para generar antígenos tumorales inducidos por células madre pluripotentes inducidas por antígenos timáticos (iTE) por un sistema de cultivo timico tridimensional (3D). iTE son un subconjunto homogéneo de células T estrechamente relacionadas con células T ingenuas con la capacidad de proliferación, formación de la memoria y supresión tumoral.

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Aquí se presenta un protocolo para la supresión efectiva de la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) en ratones mediante la utilización de la transferencia de células adoptivas (ACT) de linfocitos T específicos de antígeno viral derivado de células madre (Ag). Este procedimiento puede adaptarse para una posible inmunoterapia basada en ACT de infección por VHB.

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