Compact Puntos Cuánticos for Imaging sola molécula

El objetivo general de este procedimiento es preparar puntos cuánticos fluorescentes con brillo y estabilidad optimizados, así como con tamaño y unión no específica minimizados, para su uso en imágenes de molécula individual. Esto se logra primero preparando núcleos pequeños de puntos cuánticos de seleniuro de cadmio. El segundo paso consiste en aleacionar estos núcleos con mercurio para desplazar su fluorescencia hacia el espectro rojo y aumentar su brillo.

A continuación, se crece una capa delgada de aleación sobre los nanocristales para estabilizar su emisión de fluorescencia. El paso final consiste en transferir estas partículas desde disolventes orgánicos a tampones acuosos utilizando un polímero multidentado, que puede modificarse con polietilenglicol biológicamente inerte. En última instancia, la espectrometría de fluorescencia, la cromatografía en gel y la electroforesis en gel se utilizan para demostrar que estas partículas presentan una fluorescencia intensa, un tamaño hidrodinámico compacto y una carga electrostática neutra, características adecuadas para la obtención de imágenes de fluorescencia a nivel de molécula individual en biología.

La principal ventaja de estos puntos cuánticos frente a los materiales comerciales existentes es que estas nanopartículas tienen un tamaño hidrodinámico significativamente reducido. Aunque los puntos cuánticos más pequeños se ven afectados negativamente por una intensidad de fluorescencia disminuida, una estabilidad de fluorescencia reducida y fluorescencia únicamente en el espectro azul, hemos compensado estos efectos mediante un proceso de intercambio catiónico de mercurio. Estos nanocristales pueden ayudar a responder preguntas clave en biofísica y señalización celular al permitir imágenes dinámicas de biomoléculas individuales en entornos biológicos congestionados.

Para comenzar, prepare una solución 0,4 molar de selenio en THF agregando selenio a un matraz de 50 mililitros con tres bocas, evacuando el matraz bajo vacío alto y llenándolo con argón utilizando una línea Schlenk en condiciones libres de aire. Agregue 10 mililitros de THF y caliente a 100 grados Celsius mientras agita durante una hora para obtener una solución incolora y clara.

Enfríe la solución hasta temperatura ambiente y deje el matraz apartado. Además, prepare una solución de óxido de cadmio TDPA y ODE en un matraz de tres bocas de 250 mililitros utilizando las cantidades indicadas en el protocolo escrito. Acompañando este video, evapore la solución utilizando una línea de vacío mientras agita.

Aumente la temperatura hasta 100 grados Celsius y realice una evacuación adicional durante 15 minutos. Para eliminar las impurezas de bajo punto de ebullición bajo gas Argonne, caliente la mezcla hasta 300 grados Celsius durante una hora para disolver completamente el óxido de cadmio. La solución cambiará de un color rojizo a incolora y transparente; enfríe la solución hasta temperatura ambiente.

A continuación, agregue HDA a la solución de cadmio, caliente a 70 grados Celsius y evapore. Una vez alcanzada una presión constante, aumente la temperatura y someta la solución a reflujo durante 30 minutos. Cambie la válvula de la línea Schlenk al gas inerte e inserte el termopar directamente en la solución.

Bajo condiciones libres de aire, añada DPP a la solución de cadmio y aumente la temperatura hasta 310 grados Celsius. Ahora, utilice una jeringa plástica desechable conectada a una aguja de calibre 16 para retirar 7,5 mililitros de la solución superior de selenio 0,4 molar. Una vez que la temperatura se equilibre a 310 grados Celsius, ajuste el controlador de temperatura a cero grados Celsius e inyecte rápidamente la solución superior de selenio directamente en la solución de cadmio.

La solución cambiará de incolora a amarilla, naranja, y la temperatura descenderá rápidamente y aumentará nuevamente hasta aproximadamente 280 grados Celsius. El paso más difícil de este procedimiento consiste en inyectar todo el volumen de la jeringa lo más rápidamente posible en la solución de cadmio. Esto asegura que las partículas nucleen de manera homogénea.

Después de un minuto de reacción, retire el matraz del manto calefactor y enfríe rápidamente con un chorro de aire hasta que la temperatura sea inferior a 200 grados Celsius. Cuando la temperatura alcance aproximadamente 40 grados Celsius, diluya con 30 mililitros de hexano; la mayor parte del precursor de cadmio restante se separará de la solución. Elimine este precipitado mediante centrifugación.

En cada uno de seis tubos cónicos de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros, diluya 12 mililitros de la solución cruda resultante de nano Krystal. Con 40 mililitros de acetona, tras la centrifugación con los mismos parámetros, deseche cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, disuelva los pellet de nano krysttal en hexano.

Extraiga la solución con un volumen igual de metanol, conservando la fase superior. Repita esta extracción otras dos veces para la tercera extracción. El volumen de metanol puede ajustarse a aproximadamente 15 mililitros para obtener una solución concentrada en hexano de puntos cuánticos de seleniuro de cadmio puros a unos 200 micromolares.

El rendimiento típico de esta reacción es de tres micromoles de cristales de seleniuro de cadmio con un diámetro de dos a tres nanómetros. Determine el diámetro y la concentración del nanocristal midiendo el espectro de absorción ultravioleta-visible según se describe en el procedimiento escrito. Los nanocristales pueden intercambiarse parcialmente con mercurio para desplazar hacia el rojo la absorción y la emisión de fluorescencia. Para ello, en un vial de vidrio de 20 mililitros con barra de agitación, mezcle hexano y cloroformo, luego agregue la solución de puntos cuánticos de seleniuro de cadmio, OLA y octanoato de mercurio. Después de purificar los nanocristales y determinar su concentración según se describe en el procedimiento escrito, deje envejecer los nanocristales durante al menos 24 horas a temperatura ambiente para el crecimiento de la capa.

Prepare soluciones precursoras de capa 0.1 molar en matraces de tres bocas de 50 mililitros bajo vacío; caliente las soluciones de precursor de cadmio, precursor de zinc y precursor de azufre a reflujo durante una hora para obtener soluciones claras, luego cargue con argón en un matraz de tres bocas. Añada el ODE topo y los puntos cuánticos de seleniuro de mercurio y cadmio preparados. Evacúe el hexino a temperatura ambiente utilizando la línea lateral.

Aumente la temperatura hasta 100 grados Celsius y realice reflujo durante 15 minutos. Cambie la válvula de línea al gas argón e inserte el termopar en la solución de nano Krystal. Después de aumentar la temperatura hasta 120 grados Celsius, agregue 0,5 monocapas o 140 microlitros de solución precursora de azufre y permita que la reacción continúe durante 15 minutos.

Aumente la temperatura hasta 140 grados Celsius. Añada 0,5 monocapas o 140 microlitros de solución precursora de cadmio y permita que la reacción continúe durante 15 minutos. Luego añada 500 microlitros de OLA anhidro a la solución de reacción.

Añada 160 grados Celsius, añada 0,5 monocapas o 220 microlitros de solución precursora de azufre, seguido de una cantidad igual de solución precursora de zinc a 170 grados Celsius con 15 minutos entre cada adición. Luego, a 180 grados Celsius, añada 0,25 monocapas o 150 microlitros de solución precursora de azufre y solución precursora de zinc en intervalos de 15 minutos. Enfríe. La solución hasta temperatura ambiente y un nuevo coeficiente de extinción para estas partículas.

Utilizando un espectro UV vis, suponiendo que el número de nanocristales no ha cambiado, almacene la solución de reacción como una mezcla cruda en un congelador. En esta etapa, los nanocristales pueden caracterizarse mediante microscopía electrónica, espectroscopía de absorción UV vis y espectroscopía de fluorescencia. Añada puntos cuánticos purificados de núcleo envuelto a un matraz de tres bocas de 50 mililitros y elimine el hexino bajo vacío elevado.

Para obtener una película seca, llene el matraz con argón. Añada purina anhidra a la película de nanopartículas y caliente la suspensión a 80 grados Celsius durante el transcurso de una a dos horas. Las nanopartículas se disolverán completamente.

Añada un mililitro de glicerol FIO al 1 % a la solución y agite a 80 grados Celsius durante dos horas. Después de enfriar la solución a temperatura ambiente, añada 0,5 mililitros de trietilamina para desprotonar el tioglicerol y agite durante 30 minutos. La solución puede volverse turbia tras la adición de trietilamina debido a la baja solubilidad de los nanocristales polares en esta mezcla de solventes.

Transfiera la solución de puntos cuánticos a un tubo cónico de centrífuga de 50 mililitros que contenga una mezcla de 20 mililitros de hexano y 20 mililitros de acetona, y mezcle bien. Aísle los nanocristales precipitados mediante centrifugación, seguido de un lavado del sedimento con acetona, disuelva el sedimento de puntos cuánticos en cinco mililitros de DMSO con sonicación en baño y realice otra centrifugación. Para eliminar posibles agregados, determine luego la concentración de nanopartículas a partir de un espectro de absorción UV-V.

La solución de puntos cuánticos puros debe usarse dentro de tres horas, ya que las superficies pueden oxidarse lentamente bajo condiciones ambientales en aire. Diluya la solución de puntos cuánticos hasta 10 micromolares o menos con DMSO y transfiera a un matraz de 50 mililitros. Añada gota a gota, bajo agitación, una solución preparada de ácido poliacrílico dilatado a cinco miligramos por mililitro en DMSO a la solución de puntos cuánticos y desgasifique la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Purgue la solución polimérica de puntos cuánticos con argón y caliente a 80 grados Celsius durante 90 minutos. Después de enfriar la solución a temperatura ambiente, agregue un volumen igual de ácido sódico 50 milimolar pH ocho gota a gota y agite durante 10 minutos. Purifique los puntos cuánticos según se describe en el procedimiento escrito y determine la concentración a partir de un espectro de absorción UV-vis en un vial de vidrio de cuatro mililitros con barra de agitación; mezcle un mol de puntos cuánticos en tampón borato con un exceso molar 40.000 veces de polietilenglicol monoamino de 750 Dalton.

Las instrucciones pueden encontrarse en el procedimiento escrito sobre cómo agregar funcionalidad química específica a los nanocristales. Añada rápidamente un exceso molar de 25.000 veces de una solución recién preparada del agente activador a la solución de puntos cuánticos y agite a temperatura ambiente durante 30 minutos. Repita este paso cuatro veces más para saturar la superficie del nanocristal con PEG.

Finalmente, añada 200 microlitros de tampón tris uno molar para detener la reacción antes de purificar los nanocristales mediante filtros centrífugos de diálisis o ultracentrifugación. Los nanocristales resultantes pueden analizarse en cuanto a monodispersidad, tamaño hidrodinámico y carga superficial utilizando cromatografía líquida, electroforesis en gel y microscopía de fluorescencia. Aquí se muestran espectros representativos de absorción y fluorescencia para nanocristales de seleniuro de cadmio, nanocristales de seleniuro de mercurio y cadmio tras el intercambio catiónico, y nanocristales de núcleo de seleniuro de mercurio y cadmio y capa de sulfuro de cadmio y cinc tras el crecimiento de la capa. Los nanocristales de núcleo de seleniuro de cadmio presentan un rendimiento cuántico de fluorescencia cercano al 15 %. Sin embargo, esta eficiencia disminuye a menos del 1 % tras el intercambio de mercurio, probablemente debido a trampas de portadores de carga introducidas por la alteración de los átomos superficiales.

El crecimiento de una capa delgada de sulfuro de cadmio cinc aumenta esta eficiencia a más del 70 %, la cual se mantiene en gran medida tras la transferencia al agua. En contraste, los nanocristales con núcleo de seleniuro de cadmio y capa de sulfuro de cadmio cinc sin incorporación de mercurio pierden una fracción considerable de su rendimiento cuántico en agua, a menos que se forme una capa gruesa. Es importante tener en cuenta que el recubrimiento con sulfuro de cadmio cinc desplaza los espectros hacia el rojo debido a la fuga de los portadores de carga electrónica hacia el material de la capa.

Este desplazamiento es de aproximadamente 20 a 30 nanómetros para núcleos de cadmio y aumenta con el incremento del contenido de mercurio en el núcleo. Por lo tanto, al incorporar mercurio en el nanocristal del núcleo, se puede mantener el pequeño tamaño del nano cristal sin sacrificar el brillo. El pequeño tamaño se demuestra en esta micrografía electrónica de transmisión y en la distribución del tamaño de partículas de nanocristales de seleniuro de mercurio, cadmio en el núcleo y sulfuro de cadmio, cinc en la capa, que muestran un diámetro promedio de 3,2 ± 0,6 nanómetros.

El uso de una transferencia de fase en dos pasos al agua es fundamental para obtener una población homogénea de nanocristales que no requiere clasificación adicional por tamaño para eliminar agrupaciones y agregados mediante exclusión por tamaño. El cromatograma mostrado aquí confirma que el tamaño es similar al de la conalbúmina. A 75 kilodalton y tras la modificación con PEG amino de 750 dalton, el tamaño aumenta hasta alcanzar apenas 12 nanómetros, similar al de un anticuerpo IgG.

La modificación con PEG neutraliza la carga superficial, tal como se confirma en el experimento de electroforesis en gel de agarosa mostrado aquí; el pocillo está marcado con una flecha y las polaridades de los electrodos se indican a la derecha, mostrando que antes de la conjugación los nanocristales migran como partículas iónicas, mientras que los nanocristales pegilados son electrostáticamente neutros. Se muestra aquí una micrografía de fluorescencia epi de estos nanocristales depositados sobre un cubreobjetos de vidrio y excitados con luz visible de 545 nanómetros. Estos nanocristales se observan fácilmente a nivel de molécula individual a 30 cuadros por segundo mediante una cámara CCD con multiplicación electrónica.

Este gráfico muestra que el número de partículas fluorescentes observadas en cada cuadro fluctúa con el tiempo bajo excitación continua. Esto se debe a una combinación de parpadeo y degradación fotooxidativa. El parpadeo domina durante los primeros siete minutos antes de que la degradación fotooxidativa se vuelva lentamente evidente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo sintetizar químicamente puntos cuánticos, cómo transferirlos a tampones acuosos y cómo modificarlos para aplicaciones de bioimagen. No olvide que trabajar con reactivos que contienen cadmio y mercurio puede ser extremadamente peligroso, y se deben tomar precauciones adicionales para prevenir la exposición personal.