Compact Puntos Cuánticos for Imaging sola molécula

El objetivo general de este procedimiento es preparar puntos cuánticos fluorescentes con brillo y estabilidad optimizados, así como un tamaño minimizado y una unión no específica para su uso en imágenes de moléculas individuales. Esto se logra preparando primero pequeños núcleos de puntos cuánticos de seleniuro de cadmio. El segundo paso es alear estos núcleos con mercurio para cambiar su fluorescencia al espectro rojo y aumentar su brillo.

A continuación, se cultiva una fina capa de aleación sobre los nanocristales para estabilizar su emisión de fluorescencia. El paso final es transferir estas partículas de disolventes orgánicos a tampones acuosos utilizando un polímero multidentado, que puede modificarse con polietilenglicol biológicamente inerte. En última instancia, la espectrometría de fluorescencia, la cromatografía en gel y la electroforesis en gel se utilizan para demostrar que estas partículas tienen una fluorescencia brillante, un tamaño hidrodinámico compacto y unos atributos de carga electrostática neutros muy adecuados para la obtención de imágenes de fluorescencia de una sola molécula en biología.

La principal ventaja de estos puntos cuánticos sobre los materiales comerciales existentes es que estas nanopartículas tienen un tamaño hidrodinámico significativamente disminuido. Aunque los puntos cuánticos más pequeños se ven afectados negativamente por la disminución de la intensidad de la fluorescencia, la disminución de la estabilidad de la fluorescencia y la fluorescencia solo en el espectro azul, hemos compensado estos efectos mediante un proceso de intercambio catiónico de mercurio. Estos nanocristales pueden ayudar a responder preguntas clave en biofísica y señalización celular al permitir la obtención de imágenes dinámicas de biomoléculas individuales en entornos biológicos abarrotados.

Para comenzar, prepare una solución 0.4 molar de selenio en la parte superior agregando selenio a 50 mililitros. Matraz de tres cuellos, evacuando el matraz a alto vacío y llenado con argón utilizando una línea de vástago sch en condiciones libres de aire. Agregue 10 mililitros de tapa y caliente a 100 grados centígrados mientras revuelve durante una hora para obtener una solución clara e incolora.

Enfríe la solución a temperatura ambiente y deje el matraz a un lado. Además, prepare una solución de óxido de cadmio TDPA y ODE en un matraz de tres cuellos de 250 mililitros utilizando las cantidades enumeradas en el protocolo escrito. Acompañando este video, evacúe la solución usando una línea de vástago mientras revuelve.

Aumente la temperatura a 100 grados centígrados y evacúe durante 15 minutos más. Para eliminar las impurezas de bajo punto de ebullición bajo el gas Argonne, caliente la mezcla a 300 grados centígrados durante una hora para disolver completamente el óxido de cadmio. La solución cambiará de un color rojizo a claro e incoloro y enfriará la solución a temperatura ambiente.

A continuación, agregue HDA a la solución de cadmio, caliente a 70 grados centígrados y evacúe. Una vez que se alcanza una presión constante, aumente la temperatura y reflujo la solución durante 30 minutos. Cambie la válvula de línea Schlink a gas inerte e inserte el termopar directamente en la solución.

En condiciones sin aire, agregue DPP a la solución de cadmio y aumente la temperatura a 310 grados Celsius. Ahora use una jeringa de plástico desechable conectada a una aguja de calibre 16 para extraer 7.5 mililitros de la solución de selenio superior de 0.4 molares. Una vez que la temperatura se equilibre a 310 grados Celsius, ajuste el controlador de temperatura a cero grados Celsius e inyecte rápidamente la solución de selenio superior directamente en la solución de cadmio.

La solución cambiará de incoloro a amarillo, naranja, y la temperatura bajará rápidamente y volverá a aumentar hasta aproximadamente 280 grados centígrados. El paso más difícil en este procedimiento es inyectar todo el volumen de la jeringa lo más rápido posible en la solución de cadmio. Esto asegura que las partículas se nucleen homogéneamente.

Después de un minuto de reacción, retire el matraz de la manta calefactora y enfríe rápidamente con una corriente de aire hasta que la temperatura sea inferior a 200 grados centígrados. Cuando la temperatura alcanza aproximadamente los 40 grados centígrados, diluido con 30 mililitros de hexano, la mayor parte del precursor de cadmio restante se asentará fuera de la solución. Elimine este precipitado por centrifugación.

En cada uno de los seis tubos de centrífuga cónicos de polipropileno de 50 mililitros diluyen 12 mililitros de la solución cruda de nano Krystal resultante. Con 40 mililitros de acetona después de la centrifugación con los mismos parámetros, decantar cuidadosamente y desechar el sobrenadante. A continuación, disuelva los gránulos de nano krysttal en hexano.

Extraiga la solución con un volumen igual de metanol reteniendo la fase superior. Repita esta extracción dos veces más para la tercera extracción. El volumen de metanol se puede ajustar a aproximadamente 15 mililitros para obtener una solución concentrada de hexano de puntos cuánticos de seleniuro de cadmio puro a aproximadamente 200 micromolares.

El rendimiento típico de esta reacción es de tres cristales micromolares de seleniuro de cadmio con un diámetro de dos tres nanómetros determinan el diámetro y la concentración nano Krystal midiendo el espectro de absorción ultravioleta visible como se describe en el procedimiento escrito, los nano cristales pueden intercambiarse parcialmente con mercurio a corrimiento al rojo, la absorción y la emisión de fluorescencia. Para hacer esto, en un frasco de vidrio de 20 mililitros con mezcla de barra agitadora, hexano y cloroformo, luego agregue la solución de puntos cuánticos de seleniuro de cadmio OLA y mercurio octano violado. Después de purificar los nanocristales y determinar su concentración como se describe en el procedimiento escrito, deje que los nanocristales envejezcan durante al menos 24 horas a temperatura ambiente para el crecimiento de la cáscara.

Prepare soluciones precursoras de concha molar de 0,1 molares en matraces de 50 mililitros y tres cuellos bajo soluciones térmicas al vacío de precursores de cadmio, precursores de zinc y precursores de azufre para refluir durante una hora para producir soluciones claras, luego cargue con argón en un matraz de tres cuellos. Agregue el topo ODE y los puntos cuánticos de seleniuro de mercurio y cadmio preparados. Evacúe la hexina a temperatura ambiente usando la línea de flanco.

Aumente la temperatura a 100 grados centígrados y reflujo durante 15 minutos. Cambie la válvula de línea a gas Argonne e inserte el termopar en la solución nano Krystal. Después de aumentar la temperatura a 120 grados centígrados, agregue 0,5 monocapas o 140 microlitros de solución precursora de azufre y deje que la reacción continúe durante 15 minutos.

Aumente la temperatura a 140 grados centígrados. Añadir 0,5 monocapas o 140 microlitros de solución precursora de cadmio y dejar que la reacción continúe durante 15 minutos. A continuación, añada 500 microlitros de OLA anhidro a la solución de reacción.

Agregue 160 grados Celsius, agregue 0.5 monocapas o 220 microlitros de solución precursora de azufre, seguida de una cantidad igual de solución precursora de zinc a 170 grados Celsius con 15 minutos entre cada adición. Luego, a 180 grados Celsius, agregue 0,25 monocapas o 150 microlitros de solución precursora de azufre y solución precursora de zinc en intervalos de 15 minutos. Fresco. La solución a la temperatura ambiente y un nuevo coeficiente de extinción para estas partículas.

Usando un espectro UV vis, suponiendo que el número de nanocristales no ha cambiado, almacene la solución de reacción como una mezcla cruda en un congelador. En esta etapa, los nanocristales pueden caracterizarse mediante microscopía electrónica, espectroscopía de absorción UV vis y espectroscopía de fluorescencia. Agregue puntos cuánticos de la cáscara del núcleo purificado a un matraz de 50 mililitros y tres cuellos y elimine la hexina bajo un alto vacío.

Para obtener una película seca, llene el matraz con argonne. Agregue purina anhidra a la película de nanopartículas y caliente la suspensión a 80 grados centígrados en el transcurso de una o dos horas. Las nanopartículas se disolverán por completo.

Agregue un mililitro de un glicerol FIO a la solución y revuelva a 80 grados centígrados durante dos horas. Después de enfriar la solución a temperatura ambiente, agregue 0,5 mililitros de trietilamina para destonar el tio glicerol y revuelva durante 30 minutos. La solución puede volverse turbia después de la adición de trietilamina debido a la escasa solubilidad de los nanocristales polares en esta mezcla de solventes.

Transfiera la solución de puntos cuánticos a un tubo de centrífuga cónico de 50 mililitros que contenga una mezcla de 20 mililitros de hexano y 20 mililitros de acetona y mezcle bien. Aísle los nanocristales precipitados mediante centrifugación, seguido de un lavado de pellets con acetona, disuelva el pellet de puntos cuánticos en cinco mililitros de DMSO con sonicación en baño y siga con la centrifugación. Para eliminar posibles agregados, determine la concentración de nanopartículas a partir de un espectro de absorción UV V.

La solución de puntos cuánticos puros debe usarse dentro de las tres horas, ya que la superficie puede oxidarse lentamente en condiciones ambientales en el aire. Diluya la solución de puntos cuánticos a 10 micromolares o menos con DMSO y transfiérala a un matraz de 50 mililitros. Agregue una solución preparada de cinco miligramos por mililitro de ácido poliacrílico dilatado en DMSO, gota a gota a la solución de puntos cuánticos mientras agita y desgasifica la solución a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Purgue la solución de polímero de puntos cuánticos con Argonne y caliente a 80 grados centígrados durante 90 minutos. Después de enfriar la solución a temperatura ambiente, agregue un volumen igual de 50 milimolares de sodio y pH ocho gota a gota y revuelva durante 10 minutos. Purifique los puntos cuánticos como se describe en el procedimiento escrito y determine la concentración a partir de un espectro de absorción UV vis en un frasco de vidrio de cuatro mililitros con barra de agitación, mezcle un mol de puntos cuánticos en tampón de borato con un exceso de 40.000 veces molares de polietilenglicol mono amino Dalton.

En el procedimiento escrito se pueden encontrar instrucciones sobre cómo añadir una funcionalidad química específica a los nanocristales. Agregue rápidamente un exceso de 25.000 veces molar de una solución recién preparada de la solución del agente activador a la solución de puntos cuánticos y revuélvala a temperatura ambiente durante 30 minutos. Repita este paso cuatro veces más para saturar la superficie nano krysttal con PEG.

Finalmente, agregue 200 microlitros de un tampón tris molar para apagar la reacción antes de purificar los nanocristales Usando filtros centrífugos de diálisis o ultracentrifugación, el nano cristal resultante se puede analizar para el tamaño hidrodinámico de monodispersión y la carga superficial utilizando cromatografía líquida, electroforesis en gel y microscopía de fluorescencia. Aquí se muestra un espectro representativo de absorción y fluorescencia para nano cristales de seleniuro de cadmio, mercurio, cadmio, selenuro, nano cristales después del intercambio de cadiones, y un núcleo de seleniuro de mercurio y cadmio, cadmio de cáscara, nano cristales de sulfuro de zinc después del crecimiento de la cáscara. Los nanocristales de seleniuro de cadmio del núcleo tienen un rendimiento cuántico de fluorescencia cercano al 15%Sin embargo, esta eficiencia cae a menos del 1% después del intercambio de mercurio, probablemente debido a las trampas de portadores de carga introducidas a través de la interrupción del átomo superficial.

El crecimiento de una capa delgada de sulfuro de cadmio y zinc aumenta esta eficiencia a más del 70%, que se mantiene en gran medida después de la transferencia al agua. Por el contrario, los nanocristales de seleniuro de cadmio, cadmio de cáscara y sulfuro de zinc sin incorporación de mercurio pierden una fracción sustancial de su rendimiento cuántico en agua a menos que se cultive una cáscara gruesa. Es importante tener en cuenta que el taponado con sulfuro de cadmio y zinc cambia los espectros al rojo debido a la fuga de los portadores de carga electrónicos en el material de la carcasa.

Este cambio es de alrededor de 20 a 30 nanómetros para los núcleos de cadmio y aumenta con el aumento del contenido de mercurio en el núcleo. Por lo tanto, al incorporar mercurio en el nano cristal del núcleo, se puede mantener el pequeño tamaño del nano Krystal sin sacrificar el brillo. El pequeño tamaño se demuestra en esta micrografía electrónica de transmisión y la distribución del tamaño de partícula de los nanocristales centrales de mercurio, cadmio, seleniuro, cadmio de cáscara y sulfuro de zinc que muestran un diámetro promedio de 3,2 más o menos 0,6 nanómetros.

El uso de una transferencia de fase de dos pasos al agua es fundamental para obtener una población homogénea de nanocristales que no requieran una clasificación de tamaño adicional para eliminar los grupos y agregar la exclusión de tamaño. El cromatograma representado aquí confirma que el tamaño es similar al de la albúmina. A 75 kilodaltons y después de la modificación con 750 Dalton amino PEG, el tamaño se incrementa a solo 12 nanómetros, similar al de un anticuerpo IgG.

La modificación de PEG neutraliza la carga superficial como se confirmó en el experimento de electroforesis en gel de AROS que se muestra aquí, el pocillo está marcado con una flecha y las polaridades de los electrodos se indican a la derecha, lo que muestra que antes de la conjugación los nanocristales migran como partículas ónicas y que los nanocristales pegilados son electrostáticamente neutros. Aquí se muestra una micrografía de epifluorescencia de estos nano cristales depositados en una cubierta de vidrio y excitados con luz visible de 545 nanómetros. Estos nanocristales se observan fácilmente a nivel de una sola molécula a 30 fotogramas por segundo con una cámara CCD de multiplicación de electrones.

Este gráfico muestra que el número de partículas fluorescentes observadas en cada fotograma fluctúa con el tiempo con una excitación continua. Esto se debe a una combinación de parpadeo y fotodegradación. El parpadeo domina durante los primeros siete minutos antes de que la fotodegradación oxidativa se haga evidente lentamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar químicamente puntos cuánticos, cómo transferirlos a tampones acuosos y cómo modificarlos para aplicaciones de bioimagen. No olvide que trabajar con reactivos que contienen cadio y mercurio puede ser extremadamente peligroso, y se deben tomar precauciones adicionales para evitar la exposición personal.