Imágenes de fluorescencia con un nanómetros Precisión (FIONA)

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo llevar a cabo imágenes de fluorescencia con una precisión de un nanómetro o experimentos de Fiona. Esto se logra configurando primero el equipo requerido y alineando la óptica para la reflexión interna total, la fluorescencia, la microscopía o el césped. El siguiente paso es inmovilizar CY 3D NA en la superficie interna de una cámara de muestras y localizar moléculas individuales de CY 3D NA con precisión nanométrica.

Posteriormente, se aplica Fiona para estudiar el movimiento de una sola miosina truncada cinco un motor marcado con un punto cuántico. En última instancia, el tamaño del paso de la miosina a medida que camina, Acton, se midió como 36 nanómetros mediante el análisis de Fiona. Aunque este método puede proporcionar información sobre los motores moleculares, también se puede aplicar a otros sistemas, como el seguimiento de receptores en la membrana de las células.

La demostración visual de este método es fundamental ya que los detalles experimentales son difíciles de aprender. Es importante usar gafas de seguridad láser en todo momento durante la configuración. Para reflexión interna total, fluorescencia, microscopía o césped.

Para comenzar, configure las alturas de todos los componentes ópticos a la altura del centro del microscopio, el puerto posterior, monte el láser, el obturador láser y los filtros ND. Utilice filtros ND para atenuar la potencia del láser lo más bajo posible mientras mantiene el haz visible. Apriete los tornillos con las llaves hexagonales adecuadas.

Planifique una trayectoria de haz como se ilustra con las líneas azules punteadas. En este esquema, marque la trayectoria del haz con cinta adhesiva o marcador en la mesa óptica. Coloque el espejo M1 en el primer giro en ángulo recto, coloque los dos iris a lo largo de la segunda sección recta de la trayectoria del haz planificada.

Ajuste tanto la posición como la inclinación de M1 de modo que el láser atraviese el iris, coloque el espejo M dos. En el segundo giro en ángulo recto, coloque el expansor de haz 10 x a lo largo de la tercera sección recta del camino. Ajuste su inclinación de modo que el expansor de haz quede paralelo tanto a la mesa óptica como a la trayectoria del haz planificada.

El siguiente paso es ajustar M1 y M dos de forma iterativa de modo que el láser pase directamente por los centros de ambas lentes, L uno y L dos del expansor de haz. Use un pedazo de papel blanco para bloquear el haz después del expansor de haz para verificar el perfil del haz a ojo. Ajuste hasta que el perfil de la viga expandida no sea ED.

Gaussiano ajusta la distancia entre L uno y L dos de modo que el haz se intercale. El láser desenrosca el objetivo del microscopio y lo atornilla en una alineación fluorescente. Coloque el objetivo en los espejos M tres y M cuatro para dirigir el haz expandido hacia el puerto del microscopio y hacia el espejo dicroico.

Dentro de la torreta. Ajuste M tres para centrar la parte más brillante del haz en el objetivo fluorescente y M cuatro para hacer que el haz se incline verticalmente, obstruya el láser y vuelva a atornillar el objetivo. Multa. Ajuste las inclinaciones de M tres y M cuatro para optimizar la potencia del láser y el perfil del haz fuera del objetivo.

Monte una cámara E-M-C-C-D en el microscopio y conecte la cámara a una computadora. Inicie el software de la cámara. Monta una muestra fluorescente en el microscopio.

Mira el punto fluorescente brillante de la cámara. Compruebe que el punto no se desplaza en la pantalla ya que el enfoque ha cambiado. Coloque la lente TIR en la etapa de traslación XY, Z a una distancia del plano focal posterior del objetivo que sea igual a la distancia focal, la L tres, que es de aproximadamente 30 centímetros.

Ajuste la posición de L tres de modo que el láser atraviese el centro de la lente. Traslade L tres a lo largo de la trayectoria de la viga para ajustar la intercalación de la viga. Asegúrese de que el haz de luz siga centrado en el monitor y tenga una forma simétrica.

Traslade L tres perpendiculares a la trayectoria del haz para inclinar el haz fuera del objetivo. Siga traduciendo la lente TIR de manera que se logre TIR antes de realizar una Fiona. Experimento sobre la localización y movilización de CY 3D NA. Las moléculas individuales construyen cámaras de muestra como se detalla en el texto del protocolo.

Se aplican dos tiras de cinta adhesiva de doble cara en el portaobjetos a lo largo de los bordes largos, dejando un espacio de tres a cinco milímetros en el centro y luego se coloca un cubreobjetos limpio en la parte superior del portaobjetos, se muestran las vistas laterales de la cámara desde la derecha y desde el frente. Los extremos abiertos de la cámara se dejan abiertos y sirven como entrada y salida para inmovilizar SI 3D NA en las superficies internas de la cámara de muestras. Pipetear 10 microlitros de biotina BSA en la cámara.

Espere cinco minutos. Lave la cámara de muestras pipeteando 40 microlitros de T 50 BSA en la cámara. A continuación, pipetear 10 microlitros de travaína neutra en la cámara e incubar durante cinco minutos.

Lavar de nuevo la cámara con 40 microlitros de pipeta T 50 BSA, 20 microlitros de SI 3D NA en la cámara de muestras e incubar durante cinco minutos. Por último, lavar la cámara con 80 microlitros de T 50 BSA. Para comenzar el procedimiento de obtención de imágenes de moléculas individuales de SI 3D NA bajo césped, pipetee 30 microlitros de tampón de imagen en la cámara de muestras y espere de ocho a 10 minutos.

Monte la muestra para obtener imágenes en un microscopio de césped que esté equipado con un láser verde, un objetivo de inmersión en aceite de 100 X y una cámara E-M-C-C-D. Ajuste el tiempo de exposición y la ganancia EM. Adquiera una película de la muestra por 1000 fotogramas.

Compile y ejecute Fiona Pro para el análisis de Fiona. Utilice este programa IDL para importar la imagen adquirida para ingresar el tamaño de píxel efectivo y el factor de conversión de intensidad a número de fotones y para elegir puntos para el análisis de Fiona. Al final, el programa generará los resultados de ajuste con funciones gaussianas 2D, así como el número total de fotones y la precisión de la localización, compilará y ejecutará pH count pro.

Para caracterizar el conteo de fotones, use este programa DL para medir el número promedio de fotones emitidos por una flora. Cuatro antes del fotoblanqueo para importar la imagen adquirida e introducir el factor de conversión de intensidad a número de fotones. El programa detectará puntos fluorescentes, calculará automáticamente los recuentos de fotones en función del número de fotograma y generará las trazas de los recuentos de fotones.

Prepare la muestra para este experimento pipeteando 20 microlitros de BSA biotinilado a un miligramo por mililitro en DD H2O en una cámara de muestra. Incubar durante 10 minutos. Enjuagar con 30 microlitros de D ddh, dos pipetas O en 0,5 miligramos por mililitro de neutro travaína e incubar durante dos minutos.

Lavar la cámara con 30 microlitros de M five PSA. El acton para este experimento debe prepararse el día anterior como se describe en el texto del protocolo. Diluya la actina preparada 25 veces en general, tampón de actina hasta una concentración final de aproximadamente 0,004 miligramos por mililitro.

Pipetee la solución de actina en la cámara y espere 10 minutos. Enjuague la cámara con 30 microlitros de tampón diluido miosina cinco A con etiquetas de bandera por 30. Doble un tampón M five hasta una concentración final de 250 nano molares.

Mezclar un microlitro de miosina diluida con un microlitro de Anti-Flag Q.Do 7 0 5. Agregue ocho microlitros de M cinco para llenar hasta 10 microlitros y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Incubar bien durante 10 minutos en hielo.

Pipetee 20 microlitros de tampón de imagen que contiene miosina Q dot en la cámara de muestras. Incubar durante ocho a 10 minutos. Visualice la muestra en el microscopio de césped con una exposición de 30 milisegundos.

Adquiera al menos 1000 fotogramas para comenzar el análisis de datos. Abra el archivo de video en la imagen J y recorte el video alrededor de un punto en movimiento. Rastrea el anuncio a través del video para generar coordenadas X e Y a través del tiempo en píxeles aplicando el análisis de Fiona a todos y cada uno de los fotogramas del video.

Convierta píxeles a nanómetros como se describe en el texto del protocolo. Calcule el desplazamiento desde la posición inicial en función del tiempo. Realice una prueba T en el desplazamiento para obtener los pasos de la miosina al caminar.

Elimine todos los valores cero de la columna de tamaño de paso. Trace la distribución de los tamaños de paso utilizando origin o matlab. Ajuste un gaussiano al histograma.

En esta imagen típica de superficie inmovilizar SI 3D NA. La flecha amarilla apunta a una sola molécula SI 3D NA cuya función de dispersión de puntos o PSF se muestra aquí. El PSF está equipado con una función gaussiana bidimensional, y también se muestran los residuos de ajuste. Este gráfico es una traza típica del recuento de fotones frente al número de fotogramas y el ajuste exponencial da el número promedio de fotones de aproximadamente 1,4 veces 10 al sexto para medir el tamaño del paso de miosina un archivo de video con buena señal a ruido de una sola miosina.

A medida que camina, se captura un filamento de actina. Se muestran tres fotogramas de ejemplo. La aplicación de Fiona a cada fotograma produce una traza de distancia frente al tiempo trazada en rojo.

Se utiliza un algoritmo de búsqueda de pasos basado en la prueba T para extraer pasos individuales y la salida se superpone en blanco, los tamaños de paso y nanómetros se etiquetan en blanco. Cuando los pasos de varias trazas se combinan en un histograma, los tamaños de paso medidos se distribuyen gaussianos aproximadamente 35,8 más o menos 0,4 nanómetros. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo llevar a cabo experimentos con Fiona, incluida la configuración de un microscopio de césped Para lograr los mejores resultados Con estos procedimientos, es importante minimizar el daño fotográfico por el uso de fuerza y experimentos en el piso.

No olvide que trabajar con microscopía de césped y Fiona puede ser extremadamente peligroso y se deben usar precauciones como gafas de seguridad mientras se realiza este procedimiento.