Name: Un método mejorado para la rápida y precisa medición de rendimiento en vuelo Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprende a medir el rendimiento en vuelo de Drosophila con un método de alto rendimiento que utiliza un cilindro de vuelo y análisis de imágenes. Esta técnica permite identificar mutaciones y condiciones que afectan la capacidad de vuelo.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones F32 NS078958 (DTB) y R01 AG033620 (BG).

1. Ensamble Vuelo Tester <ol><li> Secure cilindro vuelo a Anillo de soporte 1 con abrazaderas de cadena. (Deje aproximadamente 3 cm por debajo del cilindro para pesar la cápsula.) (Nota: El cilindro de vuelo que utilizamos es de 90 cm de largo con un diámetro de 13,5 cm.) </li><li> Inserte pesan plato con una fina capa de aceite mineral por debajo del cilindro de vuelo. </li><li> Embudo seguro a Anillo soporte 2 con una abrazadera de anillo y abrazadera de la garra. Ajustar la altura del embudo de modo que el fondo del embudo esté a ras con la parte superior del cilindro de vuelo. (Nota: el diámetro de la punta del embudo debe ser menor que el diámetro exterior de los viales colocados en los tubos de caída de manera que los viales no se caigan a través de.) </li><li> Inserte el tubo de llenado en la parte superior del embudo y fijar con una abrazadera de la garra. (Nota: Nosotros usamos un tubo de caída que es de 25 cm de largo de Goteo volar-que contiene los viales desde esta altura permite la expulsión constante de todas las moscas con fuerza uniforme El diámetro interior del tubo de caída debe ser sligh..TLY más grande que el diámetro exterior del vial para permitir que el vial a gota libremente.) </li><li> Cortar hoja (s) de poliacrilamida al tamaño apropiado. (Nota: Para ayudar en la inserción y extracción de la hoja, la anchura debe ser ligeramente menor que la circunferencia interior del cilindro de vuelo). </li><li> Aplique una capa delgada de Maraña-Trap a la hoja. Deje reposar durante 1 hora antes de su uso. (Nota: Deje suficiente espacio en la parte superior e inferior de la hoja (aproximadamente 3 cm) sin recubrir para agarrar la hoja de inserción / extracción.) </li><li> Inserte la hoja de poliacrilamida en el cilindro de vuelo. </li><li> Montar la pista de cámara utilizando soportes de pino. (Nota: asegúrese de que la parte inferior de la pista se puede apoyar la cámara sin bloquear la lente Consulte la Figura 1B.). </li><li> Añadir tapones y el tornillo en su lugar. (Nota: colocar los tapones en lugares que permitan la cámara para ver la totalidad de la lámina de plástico en el modo panorámico.) </li></ol> 2. Ejecutar Experimento <ol> &lt;li&gt; Recoger viales de moscas para ensayar. Para obtener los mejores resultados, no use más de 20 moscas / vial. </li><li> Golpee suavemente moscas a fondo del vial, desconecte y luego insertar en el tubo de llenado y suelte vial. (Nota: El vial se cae el tubo de caída hasta que llega a la apertura estrecho embudo Cuando el vial golpea el embudo, las moscas son expulsados ​​en el cilindro de vuelo.). </li><li> Levante el tubo de caída para eliminar el vial vacío. (Nota: Varios frascos de moscas del mismo grupo de prueba se pueden ensayar en una hoja de poliacrilamida sola Encontramos que hasta 200 moscas (10 viales de 20 moscas cada uno) se pueden probar y tomar imágenes claras en una sola hoja.. </li><li> Retire la hoja de plástico y colóquelo en una superficie plana y blanca. (Nota: cartulina blanca se puede utilizar si las mesas de trabajo son de color oscuro.) </li><li> Montar la pista de cámara sobre la lámina de plástico. La cámara debe ser lo suficientemente alta por encima de la hoja de tener la parte superior e inferior de la hoja en el campo de visión. </li><li> Deslice la cámara a lo largo de the pista mientras mantiene pulsado el botón de &quot;captura&quot; para adquirir una imagen panorámica. </li><li> El número de moscas que aterrizan en el aceite puede contarse manualmente para cada ensayo. </li><li> Repetir los pasos 2.2 a 2.7 para todas las condiciones en un experimento dado. Las moscas pueden ser retirados de la hoja entre cada ensayo. Por otra parte, varias hojas se pueden usar, con una hoja nueva para cada ensayo. </li></ol> 3. Recolección de Datos <ol><li> Abrir archivos de imagen utilizando el software ImageJ. </li><li> Recorte de imágenes si es necesario para incluir sólo el área de la superficie de aterrizaje. (Esta es la zona recubierta de Maraña-Trap.) </li><li> Convertir imágenes a 8 bits en escala de grises. </li><li> Crear un &quot;umbral&quot; para filtrar el fondo blanco. (Imagen → Ajuste → Umbral). </li><li> Establezca los parámetros para identificar cada vuelo usando el menú de &quot;analizar partículas&quot;. (Analizar → Analizar Partículas) Definir los parámetros utilizados para identificar una partícula. Con nuestra creó, nos encontramos con que el uso de unárea de 5 a 90 pixeles 2 y una circularidad de 0.4-1.0 identificará con precisión todas las muestras. </li><li> Medir la ubicación de cada marcha utilizando la lista generada de coordenadas para cada partícula. Coordenada x en píxeles se puede convertir en centímetros para calcular la altura de aterrizaje. </li><li> Importar tabla en una hoja de cálculo (como Microsoft Excel). </li></ol>

<ol><li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Am%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of behavior.</a> Sci. Am. 229, 24-37 (1973).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. , e2504(2011).</li>
<li>de Vries, S. E., Clandinin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Stimulation+of+Escape+Behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster.</a> J. Vis. Exp. , e50192(2013).</li>
<li>Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+aggression+in+Drosophila+%28fruit+flies%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Studying aggression in Drosophila (fruit flies).</a> J. Vis. Exp. , e155(2007).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> J. Vis. Exp. , e3795(2012).</li>
<li>Shiraiwa, T., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proboscis+extension+response+%28PER%29+assay+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e193(2007).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li>
<li>Atkinson, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+separation+of+two+behavioral+phenotypes+by+a+mutation+affecting+the+promoters+of+a+Ca-activated+K+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel.</a> J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).</li>
<li>Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+component+of+calcium-activated+potassium+channels+encoded+by+the+Drosophila+slo+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus.</a> Science. 253, 551-555 (1991).</li>
<li>Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mutation+that+eliminates+a+calcium-dependent+potassium+current%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+control+of+flight+speed+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).</li>
<li>Mronz, M., Lehmann, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+free-flight+response+of+Drosophila+to+motion+of+the+visual+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment.</a> J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

Utilizando los métodos descritos aquí, hemos sido capaces de evaluar rápidamente el rendimiento de vuelo de un gran número de mutantes de Drosophila, que proporciona una mayor eficiencia que antes. Para nuestros experimentos, separamos rutinariamente a hombres y mujeres y criarlos a baja densidad (menos de 20 moscas / vial) para limitar la agresión que pudiera dañar las alas. Otra consideración importante es controlar adecuadamente las diferencias en el rendimiento de vuelo debido a las diferencias en el fondo ...

Drosophila ha sido utilizado para estudiar la base genética de comportamiento 1, y los investigadores han ideado un número de maneras de analizar varios tipos de conducta 2-6. Las moscas han sido particularmente útil para proporcionar modelos útiles de trastornos neuromusculares 7. Un ensayo común utilizado para estudiar el comportamiento del aparato locomotor es el rendimiento de vuelo. El probador de vuelo original es útil para identificar los vuelos mutantes defectuosos y para la evaluación cuantitativa de la habilidad de vuelo 1, pero tiene varios inconvenientes que limitan su aplicación para las pantallas de alto rendimiento: el uso de cilindros de petróleo recubierto es complicado y engorroso, ciertas características, tales como la longitud del cilindro y la introducción de las moscas en el tubo con fuerza variable a reducir la precisión cuantitativa, y es difícil de recuperar moscas en vivo desde el probador. Para superar estas limitaciones, se ha modificado el probador de vuelo para incluir una serie de mejoras. Hemos añadido una &quot;gota maser &quot;para introducir las moscas para eliminar la variabilidad entre los experimentos y los usuarios. Utilizamos láminas acrílicas removibles recubiertas con un adhesivo que permite la fácil limpieza y recuperación de las moscas individuales. Hemos aumentado la longitud del tubo de vuelo para mejorar la precisión y la fiabilidad cuantitativa. Finalmente , usamos una cámara digital y software de imágenes para calcular las alturas de aterrizaje de moscas. Creemos que estas mejoras sean de utilidad para todos los laboratorios interesados ​​en la realización de cribados genéticos a gran escala para los defectos de funcionamiento de vuelo.

<table><tbody><tr><td>Masilla</td><td>Home Depot</td><td>630147</td><td><a href="http://www.homedepot.com">www.homedepot.com</a></td></tr><tr><td>Moldura de banda trasera de pino (2x)</td><td>Home Depot</td><td>156469</td><td><a href="http://www.homedepot.com">www.homedepot.com</a></td></tr><tr><td>Tablero de tiras de rasar</td><td>Home Depot</td><td>164704</td><td><a href="http://www.homedepot.com"> www.homedepot.com</a></td></tr><tr><td>Trampa para enredos con recubrimiento de trampas para insectos</td><td>BioControl Network</td><td>268941</td><td><a href="http://www.biconet.com">www.biconet.com</a></td></tr><tr><td>Laptop Computer&nbsp;</td><td>Apple</td><td></td><td><a href="http://www.apple.com/mac/">www.apple.com/mac/</a></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26291</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Cartulina blanca</td><td>Grapas</td><td>247403</td><td><a href="http://www.staples.com">www.staples.com</a></td></tr><tr><td>Plato de pesaje de poliestireno</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67091A</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>Sony</td><td>DSC-TX7</td><td><a href="http://www.store.sony.com">www.store.sony.com</a> </td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td><a href="http://www.finescience.com">www.finescience.com</a></td></tr><tr><td>Cilindro de policarbonato (tubo de caída)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8585K62</td><td><a href="http://www.mcmaster.com">www.mcmaster.com</a></td></tr><tr><td>Cilindro de vuelo (acrílico)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8486K943</td><td><a href="http:// www.mcmaster.com">www.mcmaster.com</a></td></tr><tr><td>Láminas de policarbonato</td><td>McMaster-Carr</td><td>85585K25</td><td><a href="http://www.mcmaster.com">www.mcmaster.com</a></td></tr><tr><td>soporte de anillo (2x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47808</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Soporte de anillo</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47791</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Abrazaderas de extensión de tres puntas (x2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-7Q</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Embudo</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-3</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>abrazaderas de cadena (2x)</td><td>VWR</td><td>21573-275</td><td><a href="http://www.vwr.com">www.vwr.com</a></td></tr><tr><td>Viales de vidrio</td><td>VWR</td><td>66020-198</td><td><a href="http://www.vwr.com/">www.vwr.com</a></td></tr></tbody></table>

un método mejorado para la rápida y precisa medición de rendimiento en vuelo<em&gt; drosophila</em

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila ha demostrado ser un sistema modelo útil para el análisis del comportamiento, incluyendo el vuelo. El probador de vuelo involucrado caída inicial vuela en un aceite recubierto probeta; altura aterrizaje proporciona una medida de la capacidad de vuelo mediante la evaluación de cómo las moscas lejos caerán antes de producir empuje suficiente para hacer contacto con la pared del cilindro. Aquí se describe una versión actualizada del probador de vuelo con cuatro mejoras importantes. En primer lugar, hemos añadido un &quot;tubo de caída&quot; para asegurarse de que todas las moscas entran en el cilindro de vuelo a una velocidad similar entre los ensayos, lo que elimina la variabilidad entre los usuarios. En segundo lugar, hemos sustituido el recubrimiento de aceite con láminas de plástico desmontables revestidos en Maraña-Trap, un adhesivo diseñado para capturar insectos vivos. En tercer lugar, se utiliza un cilindro más largo para permitir la discriminación más precisa de la capacidad de vuelo. En cuarto lugar se utiliza una cámara digital y software de imágenes para automatizar la puntuación de rendimiento de vuelo. Estas mejoras permiten el rapIdentificación, evaluación cuantitativa del comportamiento de vuelo, útil para grandes conjuntos de datos y pantallas de genética a gran escala.

<html> Figura 1A muestra un esquema del montaje probador de vuelo actualizado. Figura 1B ilustra el diseño de la pista permite la cámara para tomar una imagen panorámica sin bloquear el campo de visión. Los resultados representativos se muestran en la Figura 2, en el que el rendimiento de vuelo de moscas mutantes Slowpoke, que tienen un vuelo conocido defecto de 8-10, se comparan con los de tipo salvaje Canton-S vuela. Control de moscas aterr...

Aquí se describe un método para la medición rápida y exacta de funcionamiento de vuelo en Drosophila, lo que permite detección de alto rendimiento.

Un método mejorado para la rápida y precisa medición de rendimiento en vuelo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

El objetivo general de este procedimiento es medir de forma rápida y precisa el rendimiento de vuelo en Drosophila. Esto se logra primero dejando caer moscas dentro de un cilindro de vuelo. El segundo paso del procedimiento consiste en obtener imágenes de la superficie de aterrizaje con una cámara digital.El paso final consiste en analizar los datos utilizando software de imágenes mediante la medición de la altura de aterrizaje de cada mosca. En definitiva, este procedimiento ayuda a identificar mutaciones y condiciones como el envejecimiento o la neurodegeneración, que afectan la capacidad de vuelo, y permite cuantificar el rendimiento en vuelo. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el analizador de vuelo original, es que resulta más adecuada para ensayos de alto rendimiento de mutantes y otras condiciones que afectan el vuelo.La idea de este método surgió cuando nos dimos cuenta de cuánto tiempo implicaba probar un gran número de genotipos utilizando el dispositivo original de prueba de vuelo. Sujete el cilindro de vuelo a un soporte anular utilizando abrazaderas de cadena. Deje aproximadamente tres centímetros debajo del cilindro para el recipiente de caída.Cargue el plato con una capa delgada de aceite mineral y deslícelo debajo del cilindro de vuelo. Sujete el embudo a un segundo soporte con anillo. Ajuste la altura del embudo de manera que la parte inferior del embudo quede alineada con la parte superior del cilindro de vuelo.La parte más estrecha del embudo debe ser más estrecha que un frasco para moscas. El diámetro del tubo de caída debe ser ligeramente más ancho que un frasco para moscas, de modo que el frasco pueda caer libremente. Introduzca el tubo de caída en la parte superior del embudo y sujételo utilizando una pinza de sujeción.A continuación, de una lámina de poliacrilamida, corte un trozo rectangular con la longitud del cilindro de vuelo y un ancho ligeramente menor que la circunferencia interna del cilindro de vuelo. Aplique una capa delgada de adhesivo tangle trap sobre la lámina, dejando suficiente espacio en la parte superior e inferior sin recubrir para poder sostener la lámina. Después de que el adhesivo sobre la lámina haya secado durante una hora, introduzca la lámina en el cilindro de vuelo con el adhesivo hacia el interior.A continuación, ensamble la pista de la cámara utilizando soportes de pino. Asegúrese de que la parte inferior de la pista pueda sostener la cámara sin bloquear el lente. Luego atornille los topes en su lugar de modo que no interrumpan la vista de la cámara hacia la lámina de plástico.Recolecte viales de moscas para ser analizadas, con no más de 20 moscas por vial. Toque suavemente el vial para hacer que las moscas bajen al fondo. Desenrosque el vial e insértelo en el tubo de caída.Suelte el vial. Cuando el vial golpea las paredes del embudo estrechado, las moscas son expulsadas al cilindro de vuelo. Levante el tubo de caída para retirar el vial vacío y cargue más moscas si se desea.Hasta 200 moscas cargadas desde 10 viales pueden probarse e imagenarse fácilmente en una sola lámina de poliacrilamida. Ahora, retire la lámina de plástico y colóquela sobre una superficie blanca plana; puede utilizarse una cartulina blanca si las mesadas de trabajo son de color oscuro. Monte la pista de la cámara sobre la lámina de plástico.La cámara debe estar lo suficientemente alta sobre la hoja como para que tanto la parte superior como la inferior de la hoja estén dentro del campo de visión. Deslice la cámara a lo largo de la pista mientras mantiene presionado el botón de captura para obtener una imagen panorámica. El número de moscas que aterrizan en el aceite del recipiente debajo de la cámara de vuelo puede contarse manualmente.Entre cada ensayo, las moscas pueden retirarse de la hoja y la hoja puede reutilizarse. Abra los archivos de imagen en el software ImageJ y recorte las imágenes si es necesario para incluir únicamente el área de aterrizaje. El área recubierta es la trampa de enredo.Convierta las imágenes a escala de grises de ocho bits y cree un umbral para filtrar el fondo blanco. Establezca los parámetros para identificar cada mosca.Mediante el menú analizar partículas, defina los parámetros. Se utiliza para identificar una partícula usando el aparato de demostración. Un área de cinco a 90 píxeles cuadrados y una circularidad de 0,4 a 1,0 identificará con precisión todas las muestras.Ahora, mida la ubicación de cada mosca utilizando la lista generada de coordenadas para cada partícula. La coordenada X en píxeles puede convertirse a centímetros. Para calcular la altura de aterrizaje, importe la tabla a una hoja de cálculo y continúe con el análisis.Se comparó el rendimiento en vuelo de moscas mutantes slow poke, que presentan un defecto conocido en el vuelo, con el de moscas de tipo silvestre canton s. Todas las moscas tenían tres días de edad y se criaron a temperatura ambiente; las moscas de control aterrizaron consistentemente cerca de la parte superior del cilindro. La dispersión del aterrizaje fue mucho mayor en los mutantes slow poke.La altura media de aterrizaje de los cantones a 73 centímetros fue significativamente mayor que la de los mutantes slow poke a 44 centímetros. Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar métodos adicionales como la histología para responder preguntas adicionales sobre la integridad estructural de los músculos de vuelo, las neuronas motoras o las uniones neuromusculares. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo puedes evaluar rápidamente el rendimiento de vuelo en oph.

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