Un método mejorado para la rápida y precisa medición de rendimiento en vuelo Drosophila
13 de febrero de 2014
Aquí se describe un método para la medición rápida y exacta de funcionamiento de vuelo en Drosophila, lo que permite detección de alto rendimiento.
El objetivo general de este procedimiento es medir de forma rápida y precisa el rendimiento de vuelo en Drosophila. Esto se logra dejando caer primero las moscas en un cilindro de vuelo. El segundo paso del procedimiento es obtener imágenes de la superficie de aterrizaje con una cámara digital.
El paso final es analizar los datos utilizando un software de imágenes midiendo la altura de aterrizaje de cada mosca. En última instancia, este procedimiento ayuda a identificar mutaciones y condiciones como el envejecimiento o la neurodegeneración, que afectan la capacidad de vuelo y ayuda a cuantificar el rendimiento de vuelo. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el probador de vuelo original, es que es más apropiado para pantallas de alto rendimiento para mutantes y otras condiciones que perjudican el vuelo.
La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de cuánto tiempo implicaba probar un gran número de genotipos utilizando el probador de vuelo original. Asegure el cilindro de vuelo a un soporte de anillo con abrazaderas de cadena. Deje aproximadamente tres centímetros debajo del cilindro para el plato de vía.
Cargue la antena con una fina capa de aceite mineral y deslícela por debajo del cilindro de vuelo. Asegure el embudo a un segundo soporte de anillo. Ajuste la altura del embudo para que la parte inferior del embudo quede al ras con la parte superior del cilindro de vuelo.
La parte más estrecha del embudo debe ser más estrecha que un vial de mosca. El diámetro del tubo de caída debe ser ligeramente más ancho que el de un vial para moscas, de modo que el vial pueda caer libremente. Inserte el tubo de caída en la parte superior del embudo y asegúrelo con una abrazadera de garra.
A continuación, de una lámina de poliacrilamida, corte una pieza rectangular de la longitud del cilindro de vuelo con un ancho ligeramente menor que la circunferencia interior del cilindro de vuelo. Aplique una capa delgada de adhesivo para atrapar enredos a la hoja, dejando suficiente espacio en la parte superior e inferior sin recubrimiento para sostener la hoja. Después de que el adhesivo de la hoja se haya secado durante una hora, deslice la hoja en el cilindro de vuelo con el adhesivo hacia adentro.
A continuación, ensamble el riel de la cámara con soportes de soporte de pino. Asegúrese de que la parte inferior de la pista pueda soportar la cámara sin bloquear el objetivo. A continuación, atornille los topes en su lugar donde no interrumpan la vista de la cámara de la lámina de plástico.
Recoja viales de moscas para analizarlos con no más de 20 moscas por vial. Golpee suavemente las moscas en el fondo del vial. Desenchufe el vial e insértelo en el tubo de bajada.
Libere el vial. Cuando el vial golpea las paredes del embudo de estrechamiento, las moscas que son expulsadas al cilindro de vuelo. Levante el tubo de caída para extraer el vial vacío y cargue más moscas si lo desea.
Se pueden analizar y obtener imágenes fácilmente de hasta 200 moscas cargadas en 10 viales en una sola hoja de poliacrilamida. Ahora, retire la lámina de plástico y colóquela sobre una superficie blanca plana Se puede usar una cartulina blanca si las mesas de trabajo son de color oscuro. Ensamble el riel de la cámara sobre la lámina de plástico.
La cámara debe estar lo suficientemente alta por encima de la hoja para tener tanto la parte superior como la inferior de la hoja en el campo de visión. Deslice la cámara a lo largo de la pista mientras mantiene presionado el botón de captura para obtener una imagen panorámica. El número de moscas que aterrizan en el aceite en el plato debajo de la cámara de vuelo se puede contar manualmente.
Para cada ensayo entre ensayos, las moscas se pueden eliminar de la hoja y la hoja se puede reutilizar. Abra los archivos de imagen en el software image J, recorte las imágenes si es necesario para incluir solo el área de la superficie de aterrizaje. La trampa de enredos recubierta de área.
Convierta las imágenes a una escala de grises de ocho bits y cree un umbral. Para filtrar el fondo blanco. Establezca los parámetros para identificar cada mosca.
Mediante el menú analizar partículas, defina los parámetros. Se utiliza para identificar una partícula utilizando el aparato de demostración. Un área de cinco a 90 píxeles cuadrados y una circularidad de 0,4 a 1,0 identificarán con precisión todas las muestras.
Ahora, mida la ubicación de cada mosca usando la lista generada de coordenadas para cada partícula. La coordenada X en píxeles se puede convertir a centímetros. Para calcular la altura de aterrizaje, importe la tabla en una hoja de cálculo y continúe con el análisis.
El rendimiento de vuelo de las moscas mutantes de empuje lento, que tienen un defecto de vuelo conocido, se comparó con las moscas de cantón de tipo salvaje. Todas las moscas tenían tres días de edad, criadas a temperatura ambiente, las moscas de control se posaban constantemente cerca de la parte superior del cilindro. La propagación del desembarco fue mucho mayor para los mutantes de empuje lento.
La altura media de aterrizaje de los cantones, a 73 centímetros, fue significativamente mayor que la de los mutantes de empuje lento, a 44 centímetros. Después de este procedimiento, se pueden utilizar métodos adicionales, como la histología, para responder preguntas adicionales sobre la integridad estructural de los músculos de vuelo, las neuronas motoras o las uniones neuromusculares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo puede evaluar rápidamente el rendimiento de vuelo en oph.
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Descripción general
Este artículo describe un método para la medición rápida y precisa del rendimiento de vuelo en Drosophila, facilitando el cribado de alto rendimiento. El procedimiento consiste en soltar moscas dentro de un cilindro de vuelo, capturar imágenes de la superficie de aterrizaje y analizar los datos para medir la altura de aterrizaje.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Análisis del comportamiento
- Genética
Antecedentes
- El rendimiento en vuelo es una medida fundamental en el estudio de Drosophila.
- Los métodos existentes para medir la capacidad de vuelo suelen tener un bajo rendimiento.
- La identificación de mutaciones que afectan el vuelo puede proporcionar información sobre la neurodegeneración.
- Este método mejora la capacidad de cribar diversas condiciones que afectan el vuelo.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método de alto rendimiento para evaluar el desempeño en vuelo en Drosophila.
- Identificar mutaciones genéticas y condiciones que afecten la capacidad de vuelo.
- Cuantificar con precisión el desempeño en vuelo.
Métodos Utilizados
- Se dejan caer Drosophila en un cilindro de vuelo.
- Una cámara digital captura imágenes de la superficie de aterrizaje.
- Un software de imagen analiza los datos para medir la altura de aterrizaje.
- El método permite la selección rápida de múltiples muestras.
Resultados principales
- El método proporciona mediciones precisas del rendimiento de vuelo.
- Es adecuado para el cribado de alto rendimiento de mutantes.
- Se pueden evaluar condiciones como el envejecimiento y la neurodegeneración.
- Los resultados pueden ayudar a comprender la base genética del deterioro del vuelo.
Conclusiones
- Esta técnica mejora los métodos existentes para la medición del rendimiento de vuelo.
- Permite a los investigadores realizar análisis de alto rendimiento de manera efectiva.
- Los hallazgos pueden contribuir a la comprensión de las influencias genéticas sobre el comportamiento.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La medición cuantitativa del rendimiento de vuelo de Drosophila permite el cribado genético y fenotípico de alto rendimiento, apoyando la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en la investigación de neurobiología y envejecimiento. El flujo de trabajo mejorado estandariza los ensayos conductuales, aumentando la confianza predictiva para estudios funcionales posteriores y la selección de carteras. Esta capacidad acelera la identificación de modificadores genéticos y fenotipos relevantes para enfermedades en sistemas modelo preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite una rápida evaluación de los factores genéticos y ambientales que afectan la función neuromuscular.
- Apoya la validación funcional de dianas mediante la cuantificación de fenotipos conductuales asociados a perturbaciones génicas.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al distinguir entre un rendimiento de vuelo normal y uno deteriorado.
- Mejora la confianza predictiva para la priorización de dianas genéticas en vías de neurodegeneración y envejecimiento.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara modelos validados de Drosophila para flujos de trabajo de cribado conductual escalables y reproducibles.
- Normaliza las condiciones del ensayo mediante el control de la velocidad de entrada y la automatización de la captura de datos.
- Permite lecturas cuantitativas de alto rendimiento, adecuadas para cribados genéticos o con compuestos a gran escala.
- Facilita la evaluación confiable de genes candidatos o intervenciones que afectan la función motora.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relaciona los resultados fenotípicos con puntos finales relevantes para la enfermedad en la investigación sobre neurodegeneración y envejecimiento.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento genético hasta la validación preclínica de resultados funcionales.
- Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en datos conductuales cuantitativos y robustos.
- Apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales al vincular el genotipo con el fenotipo funcional.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la detección genética inicial hasta la validación en modelos preclínicos, proporcionando un ensayo conductual estandarizado para la investigación en genómica funcional y neurobiología.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al cuantificar el deterioro del vuelo entre genotipos y condiciones.
- Tamizaje: Proporciona resultados cuantitativos reproducibles para tamizajes de mutantes o intervenciones de alto rendimiento.
- Análisis: Ofrece imágenes digitales y mediciones basadas en software de la altura de aterrizaje para una comparación objetiva de datos.
- Investigación Traducional: Relaciona los fenotipos conductuales de Drosophila con resultados funcionales relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma escalable y reutilizable para diversas campañas de tamizaje genético y fenotípico.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y el rendimiento de los ensayos conductuales.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más informadas de avance/no avance y una gestión eficiente del portafolio en función del capital.
- Impacto en el portafolio: Facilita la priorización y el avance ajustados al riesgo de dianas genéticas e intervenciones.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de Drosophila y en el montaje de ensayos conductuales.
- Necesita equipo de imagen digital y software de análisis de imágenes para obtener lecturas cuantitativas.
- Exige la estandarización entre equipos de los parámetros del ensayo y de los flujos de trabajo de análisis de datos.
- Adaptable a diversos fondos genéticos y condiciones experimentales en Drosophila.
- Limitado a sistemas modelo en los que el rendimiento de vuelo sea un punto final funcional relevante.
