Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

El objetivo general de este procedimiento es aislar, caracterizar y diferenciar las células madre de legumbres gentiles humanas de los dientes permanentes mediante el uso de dos métodos. Esto se logra recolectando muelas del juicio sanas impactadas, cortándolas alrededor del cemento para la unión del esmalte al principio. Las células madre dentales D PSC se aíslan mediante dos métodos diferentes.

En el primer método, los tejidos de los pólipos se digieren enzimáticamente incubándolos en una solución de colagenasa tipo uno más espacio en disco. Aquí los llamamos ed. Teniendo en cuenta el método de aislamiento en el segundo método, los tejidos palpos solo se colocan en el matraz sin ninguna digestión.

De esta manera, los dpss comienzan a migrar del tejido al matraz. Estas células llamadas OG se refieren al método de aislamiento de excrecencias. El segundo paso del procedimiento es la identificación de las células madre mediante citometría de caída.

El tercer paso del procedimiento es la inducción de la diferenciación del odontoblasto, y el paso final del procedimiento es la evaluación comparativa de la diferenciación del odontoblasto entre dos grupos mediante tinción en rojo y QBCR. Soy RA Kde, del Departamento de Células Madre y Biología del Desarrollo del Instituto Rian. Hoy os voy a mostrar el aislamiento, caracterización y diferenciación comparativa de células madre mesenquimales humanas mediante el uso de dos métodos.

Hola, soy el Dr. Rezaian del Instituto de Río. Estamos trabajando en un proyecto relacionado con las células madre de la pulpa dental humana. Estas células son una especie de células madre mecánicas, que son fáciles de obtener con un mínimo de dolor y morbilidad.

Las células madre mecánicas especifican con capacidad plástica, formación de colonias y capacidad de diferenciación múltiple. Hola, soy la Dra. Ami del Departamento de Células Madre. En el instituto, utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para aislar células madre con el fin de realizar estudios de investigación y aplicaciones futuras.

En medicina regenerativa, el primer paso para utilizar esta fuente de células madre para la futura terapia basada en células madre es elegir el mejor protocolo para aislar las células madre del tejido de la parte humana. Para lograr este objetivo, es crucial investigar ciertos aspectos del comportamiento celular en diferentes condiciones de aislamiento de células madre. En primer lugar, voy a aislar células madre de la pulpa dental humana mediante la disociación enzimática de la pulpa o el crecimiento de las células madre de los implantes de tejido.

A continuación, caractécelos y diferéntalos en ráfaga de ogen. Así que comencemos. De primera manera, el espacio y la colagenasa tipo uno disuelven ambos en PBS.

A continuación, fíltralos con un filtro de jeringa de 0,2 micras. Tire de ambos en el tubo cónico. Luego agregue pener y PBS para lograr la concentración final.

Transfiera las muelas del juicio sanas al laboratorio en el medio básico frío bajo la condición de acero. Limpie la superficie del diente con etanol al 70% antes de estudiar. Asegúrese de limpiar la brisa de la superficie del diente.

Corte el diente alrededor de la unión del esmalte de cemento utilizando un disco dental esterilizado para revelar la cámara pulpar. Hay que tener en cuenta que el proceso de corte debe realizarse lentamente para reducir el sobrecalentamiento del tejido dental. A continuación, separe suavemente el tejido pulpar de la corona, es decir, el tejido pulpar en trozos de uno a dos milímetros con la cuchilla Scarpa.

Transfiera pequeños trozos de tejidos pulposos a una solución enzimática de mililitros durante una hora a 37 grados Celsius de vórtice cada 30 minutos para ayudar a romper los tejidos pulpares. A continuación, elimine los agregados grandes pasándolos a través de una cepa de celdas de 70 micras. A continuación, añada las centrífugas que contienen PBS PENER a 1.200 rpm durante cinco minutos.

Retire el supernat con cuidado. A continuación, suspendemos la placa en el medio de proliferación pm, la transferimos al matraz de cultivo y añadimos el medio. A continuación, incubar incubado.

Cambie el medio cada tres días hasta que se logre la confluencia celular para el método de trabajo. Repita el proceso de corte. Después de cortar el diente, los tejidos se rompen en fragmentos de uno a dos milímetros.

Luego colócalos en la cultura. Destellos con proliferación, medios e incubados. Se debe tener en cuenta que el volumen total del medio de proliferación debe ser el soporte de la unión de todas las piezas para un mayor crecimiento celular.

Cambie el medio después de observar el crecimiento y luego cada tres días hasta que se logre la confluencia celular. Para el inmunofenotipado, incubar ambos tipos de PSC D con anticuerpos conjugados PE o FITC durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. A continuación, añada las vistas PBS y centi a 1.200 RPM durante cinco minutos.

Retirar el sobrenadante y resus, suspender la placa en PBS y finalmente evaluar los marcadores de superficie mediante el uso de subcultivo de citómetro de flujo, ambos tipos de DPC para tres pasajes. A continuación, triplica en hielo y transfiérelos a seis placas de cultivo rojo al 60%Co fluidez sustituye PM por medio odontogénico. Se mantienen tres pozos como control negativo mediante la adición de pm.

Cambie el medio cada tres días el día 21 de lavado de celdas con PBS. Luego fíjalos en un mililitro por pozo. 10%Altura del gel formal durante 15 minutos a temperatura del hogar.

Después de 15 minutos, retire el fijador con cuidado y enrolle las celdas tres veces con agua destilada. A continuación, sustituya el agua por un mililitro por alza roja en solución de tinte rojo. Pasados los 20 minutos, retiramos el exceso de tinte y lavamos las células cuatro veces con agua desionizada.

Luego agregue un milímetro por pozo de agua para evitar que las celdas se sequen. Después de la tinción, puede ver que tres rieles superiores se vuelven rojos en comparación con los controles bajo el microscopio, puede ver la absorción del color de la tinción alrededor de la celda mediante un gran aumento para la cuantificación de una tinción roja. Después de eliminar el agua, agregue un mililitro por pocillo, 10% de ácido ácido, luego incube durante 30 minutos con agitación.

A continuación, raspe suavemente las células de la placa con un raspador de células. Luego transfiéralos a los tubos separados. El VOR se toma vigorosamente durante 30 segundos.

Luego caliéntelos a 85 grados centígrados durante 10 minutos. Para evitar la evaporación, selló los tubos con el tubo de transferencia ParaView a hielo durante cinco minutos, los utilizaron a 20.000 G durante 15 minutos. Mientras tanto, haga la dilución en serie del estándar rojo de Alzheimer de acuerdo con el protocolo de la región.

Después de la centrifugación, retire los snat y transfiéralos a los nuevos tubos. Neutralizar el pH con hidrocito de amonio al 10%. A continuación, añada los estándares y también las muestras en 96.

A continuación, mida la absorbancia a 405 nanómetros y analice los datos de acuerdo con la dilución en serie estándar. Aquí se pueden ver los DPC, que se aíslan por disociación enzimática los días 10, 15 y 18, y también los DPC que se quedan pequeños los días quinto, 10, 13 y 18. Los resultados del inmunofenotipado muestran la presencia de marcadores de células madre mesenquimales como CD 44, CD 73 y CD 19, y la ausencia de marcadores hematopoyéticos y endoteliales como CD 34, CD 45 y CD 11 B. Curiosamente, las expresiones de CD 1 0 5 y CD 146 son más en las PSC d superadas en comparación con D-P-S-C-E-D, la cuantificación de la tinción de rojo enzimático en el día 21 de la diferenciación de odontoblastos muestra una mayor deposición de calcio en D-P-S-C-E-D en comparación con la parte superior sin condental de las células madre.

Los resultados de QPCR también indican expresiones significativamente más altas de MEP y A LP como marcadores de mineralización en D-P-S-C-D en comparación con las células madre dentales salientes. Mientras tanto, ambos genes se regulan durante la diferenciación y también la expresión de DSPP ya que el marcador odontogénico aumenta durante la diferenciación. Sin embargo, no hay variación significativa en la expresión de DSVP en células diferenciadas entre los grupos ED y OG.

Acabamos de mostrarle cómo aislar células madre de partes dentales humanas mediante el uso de la disociación enzimática de la pulpa o el crecimiento de células madre a partir de la explanación de tejidos. Así que eso es todo. Le deseo buena suerte para intentar utilizar este procedimiento en su experimento.

Gracias.