Name: Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 52 s
Description: Aprende a aislar y caracterizar células madre de pulpa dental humana mediante digestión enzimática y crecimiento directo. Este método compara la viabilidad celular y el potencial odontogénico de ambos protocolos.

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Queremos agradecer a la Dra. Leila Shakeri y el Dr. Aref Dournaei para su discusión crítica y el Sr. Mohammad Reza Khadem Sharif por su apoyo técnico.

1. Preparar la solución de enzima y medio de proliferación (PM) <ol><li> Hacer colagenasa tipo I Solución: Pesar colagenasa tipo I (12 mg / ml) y se disuelven en 1 ml de PBS y el filtro utilizando un filtro de 0,2 micras jeringa. A continuación, colóquelo tubo de 15 ml y conservarse a -20 ° C hasta su utilización. </li><li> Hacer la solución de dispasa: Pesar dispasa (16 mg / ml) y se disuelven en 1 ml de PBS y el filtro utilizando un filtro de 0,2 micras jeringa. A continuación, colóquelo tubo de 15 ml y conservarse a 4 ° C hasta su utilización. </li><li> Hacer solución de enzima: Añadir 1 ml de colagenasa tipo I soluciones (12 mg / ml) y 1 ml de soluciones de dispasa (16 mg / ml) en el 2 ml de PBS estéril que contiene 100 mg / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina. La concentración total de dispasa y colagenasa I en el volumen final debe ser de 4 mg / ml y 3 mg / ml, receptivamente. Luego, alícuota de este volumen en a cuatro tubo de 15 ml, conteniendo cada uno 1 ml de solución de enzima. Cada tubo se podría utilizar para la digestión de pulpa uno. </li><li> Hacer la disolución de lavado: Añadir 100 mg / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina en PBS. </li><li> Hacer que los medios básicos: modificación Alfa de medio de Eagle (α-MEM) suplementado con FBS al 10% y 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Hacer que los medios Proliferación (PM): modificación Alfa de medio de Eagle (α-MEM) suplementado con FBS al 10%, 100 mM ácido L-ascórbico 2-fosfato, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml estreptomicina, 0,25 mg / ml de anfotericina B. </li><li> Hacer que los medios odontogénicos: modificación Alfa de medio de Eagle (α-MEM) suplementado con FBS al 10%, 100 mM ácido L-ascórbico 2-fosfato, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 0,01 mM dexametasona, 5 mM β-glicerol fosfato, fosfato monopotásico 1,8 mM. </li></ol> 2. Preparar Tejido Humano Pulpa Dental para Isolatio célula madre de la pulpa dentaln <ol><li> Normales de los terceros molares humanos se obtuvieron de los adultos (21-29 años de edad) en la Clínica Dental del Imam Ali bajo aprobadas por la junta de revisión institucional (IRB). </li><li> Los dientes se coloca en el medio de base (α-MEM suplementado con FBS al 10%) y se transfirieron en laboratorio a 4 ° C. </li><li> Bajo la condición estéril, trabajando dentro de una campana de flujo laminar biohazard, set-up se hizo uno de 100 mm placas de Petri para cada diente para ser procesado. Superficies de los dientes se limpiaron por 70% de etanol. </li><li> Mientras se trabaja en una de las placas Petri, diente se mantuvo por fórceps dentales y una hoja de bisturí fue utilizado para limpiar los desechos y el ligamento periodontal en las raíces. </li><li> Unión cemento-esmalte se redujo lentamente mediante el uso de disco esterilizado dental para revelar la cámara pulpar. Se debe considerar que el proceso de corte debe llevarse a cabo lentamente para reducir el sobrecalentamiento del tejido dental. </li><li> El tejido pulpar se separó suavemente de la corona y la raíz. </li&gt; <li> Tejido de la pulpa se cortó en trozos pequeños con la ayuda de una cuchilla de escalpelo. </li></ol> 3. Aislamiento Humano Pasta Dental <ol><li> Tejidos de la pulpa fueron sometidos a la disociación enzimática de la pulpa o fruto directo de células de explantes de tejidos de celulosa para el aislamiento de hDPSCs. </li><li> Disociación enzimática del tejido pulpar: <ol><li> Pequeños trozos de tejidos de la pulpa se transfiere a la solución de enzima durante 1 hora a 37 ° C. Vortex cada 30 minutos para ayudar a romper el tejido. </li><li> Después, los grandes agregados celulares se retiraron y solo suspensiones de células se obtuvieron haciendo pasar las células a través de un filtro de células 70-m. </li><li> Solo suspensiones de células se centrifugaron a 1.200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente apagado y el sedimento se resuspendió en 1 ml de medio de proliferación (PM). (Nota: FBS en medio de proliferación terminar enzimática disasociación.) </li><li> Solo suspensiones de células de la pulpa dental se sembró en 25 cm matraz de cultivo con 2 PM y después se incubó a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> El medio de cultivo se cambió cada tres días hasta la confluencia celular se logró. </li></ol></li><li> Consecuencia directa de células de explantes de tejido pulpar: <ol><li> Tejido de la pulpa fue picado en 1-2-mm fragmentos, y cada pieza se colocó en 25-cm 2 frascos de cultivo con PM y después se incubó a 37 ° C en 5% de CO 2. Se debe considerar que el volumen total de la PM para excrecencia de célula debe ser compatible con la unión de piezas de pasta de excrecencia celular adicional (2-3 ml por matraz). </li><li> El medio se cambió después de excrecencia se observó. </li><li> Las células no caben en confluencia se subcultivaron en una relación de 1:4 (paso 1). </li></ol></li></ol> 4. Inmunofenotipificación <ol><li> 250.000 células /tubo de ambos tipos de células en el paso 3 se incubaron por PE o FITC-conjugado con anticuerpos anti-humanos con sus isotipos durante 30 min a 4 ° C en un lugar oscuro. (Nota:. La concentración de anticuerpos se aplicó de acuerdo con el protocolo de fabricación) </li><li> Después del tiempo de incubación, 100 l de PBS o solución de FACS dilución se añadió a cada tubo y se centrifugó a 1.200 rpm durante 5 min en un lugar oscuro. </li><li> Se eliminaron los sobrenadantes y sedimentos se resuspendieron en 100 l de PBS o dilución FACS en lugar oscuro. </li><li> Targeted marcadores de superficie (marcadores CD) fueron evaluados por BD FACSCalibur. </li></ol> 5. La inducción de la diferenciación de las células en DPSCs mineralizadas y cuantificado de Ensayo Rojo de alizarina S <ol><li> DPSCs que fueron obtenidos por cualquiera de disociación enzimática de tejido de la pulpa (conocido como DPSC-ED) o excrecencia celular directa de explantes de tejido de la pulpa (DPSC-OG) fueron sub-cultivadas durante 3 pasajes. </li><li> Lat Paso 3, las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a 5.000 células / pocillo. </li><li> En la confluencia de 60%, medio odontogénico se sustituye por PM convencional. Tres pocillos se mantuvo como un control negativo mediante la adición de medio de crecimiento. </li><li> Media cambian cada 3 días hasta el día 21. </li><li> Al día 21, se lavaron las células con PBS y se fijaron por 1 ml / pocillo de 10% de paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Entonces paraformaldehído se pipeteó cuidadosamente y las células se lavaron 3 veces (5-10 min para cada tiempo) con agua destilada H 2 O. (Nota: Evite perturbar la monocapa.) </li><li> Después del lavado, 1 ml / pocillo rojo de alizarina S se añadieron durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Las células se lavaron por H2O desionizada cuatro veces (5 min por cada vez con agitación suave) para eliminar cualquier adicional rojo de alizarina. </li><li> 1 ml / pocillo de H 2 O se añadieron a evitar que las células de secado. </li><li> Las placas se supone que ins visualespección y / o adquisición de la imagen. </li><li> Para el ensayo de cuantificación de rojo de alizarina S, H 2 O se sustituye por 1 ml de 10% de ácido acético a cada pocillo de 6-así placa y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente con agitación. </li><li> Entonces, monocapa de células / pocillo fueron rascado y tanto el ácido acético y las células se transfirieron a los separados 1,5 ml de microcentrífuga tubos. (Nota:. Cada pozo debe ser separado de transferencia en un tubo de ensayo es decir, tres pozos y tres pozos de control para cada grupo de ED &amp; OG) </li><li> Los tubos se agitaron vigorosamente durante 30 segundos. </li><li> Calentar a 85 ° C durante 10 min. (Nota: para evitar la evaporación, los tubos se sellaron con parafilm.) </li><li> Después del calentamiento, los tubos se transfirieron a hielo durante 5 min. (Nota: Los tubos no deben abrirse hasta llegar a ser enfriado.) </li><li> Las suspensiones se centrifugaron a 20.000 xg durante 15 min. Mientras centrifugación, la alizarina normas rojas se hicieronarriba. </li></ol> Estándar de rojo de alizarina S se prepararon diluyendo en primer lugar el tampón de dilución y utilizado para la fabricación de 2 veces la dilución sobre la base de la mesa. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="7"> De gama alta concentración de colorante </td><td colspan="7"> Concentración de colorante de bajo rango </td></tr><tr><td> 2 mM </td><td> 1 mM </td><td> 500 mM </td><td> 250 mM </td><td> 125 mM </td><td> 62,5 mM </td><td> 31,3 mM </td><td> 15,6 mM </td><td> 7,8 mM </td><td> 3,9 mM </td><td> 1,9 mM </td><td> 0,9 mM </td><td> 0,4 mM </td><td> En blanco </td></tr></tbody></table><ol start="16"><li> Después de la centrifugación, 1 ml de sobrenadante / tubo se transfirieron a nuevos separados 1,5 ml de microcentrífuga tubos. </li><li> El pH se neutralizó con ~ 375 l 10% De hidróxido de amonio por tubo. (Nota: la rabia pH debe ser 4.1-4.5). </li><li> 150 ml de estándar y muestras (incluye pruebas por separado y controles) se añadieron en un opaco pared, fondo transparente de 96 pocillos. </li><li> La absorbancia se leyó a 405 nm y los valores de la DO de las muestras se compararon con trama estándar para el análisis adicional. </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este protocolo describe el proceso de aislamiento y caracterización de hDPSCs de pulpa dental utilizando dos métodos, la disociación enzimática y la consecuencia directa de las células madre a partir de explantes de tejido de la pulpa. Además, la diferenciación in vitro de estas células en odontoblastos, se evaluó por el ensayo cuantitativo rojo de alizarina S &amp; QPCR. Los protocolos existentes para el aislamiento de tejido de la pulpa de los dientes humanos se habían ut...

Las células madre son células clonigénicas que poseen dos características notables, conocidas como multi-potencia y auto-renovación 15. Entre todas las células madre con potencias diferentes replicativos, las células madre dentales como las células madre postnatales han llamado la atención en los últimos años debido a su accesibilidad, la plasticidad y alta capacidad proliferativa en comparación con otras células madre adultas 16. Característicamente, similar a las células madre mesenquimales, células madre de pulpa dental están adheridas las células clonogénicas que tienen la capacidad de diferenciación en múltiples mesénquima y / o no-mesénquima linajes, tanto in vitro como in vivo. 1-8,17,18 DPSCs se identifican por su expresión negativa de antígenos hematopoyéticos (por ejemplo, CD45, CD34, CD14), y la expresión positiva de CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 y STRO 1-19,20. Fácil potencial obtenida con un mínimo de dolor y morbilidad hacer DPSCs humanos como una valiosafuente capaz de MSCs en comparación con las fuentes comunes, tales como células madre mesenquimales de la médula ósea 21. En general, DPSCs se han aislado por cualquier método de derivación, es decir, la migración de las células madre a partir de explantes de tejido de pulpa (DPSC-OG) 22-24, y / o mediante digestión enzimática (DPSC-ED) 4,6,25. Estudios anteriores han demostrado que el método de aislamiento y las condiciones de cultivo pueden inducir diferentes poblaciones o linajes bajo pasajes in vitro 26,27. En el caso de los dientes permanentes (pDPSCs), Huang et al puesto de manifiesto que enzimáticas pDPSCs digeridos tienen un mayor potencial de proliferación en comparación con los DPSCs superado. 26 Por otra parte, en el caso de los dientes deciduos (dDPSCs), se demostró que STRO-1 y CD34 marcadores expresa más en DDPSC-DE en comparación con DDPSC-OG. Además, DDPSC-ED mostraron un aumento significativo en la tasa de mineralización definida osteo / odonto medio. 27 Por lo tanto, debido al gran potencial de DPSCs en regenerative medicina, más estudios se requerirán para un mejor entendimiento de las posibles poblaciones diferentes que se derivan de diferentes métodos de aislamiento. Aquí, era intento de introducir de manera fácil extracción de la pulpa, mediante el uso de un solo paso disco de diamante dental para facilitar el proceso de extracción de la pulpa. Por otra parte, tras el aislamiento de las células madre derivadas de la pulpa mediante la aplicación de métodos o ED OG, propiedades generales y capacidad de diferenciación entre dos grupos también fueron investigados.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo o Lot. número </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> α-MEM </td><td> GIBCO </td><td> 11900-073 </td><td></td></tr><tr><td> La colagenasa tipo I </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-100MG </td><td></td></tr><tr><td> Dispasa </td><td> GIBCO </td><td> 17105-041 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> La anfotericina B </td><td> GIBCO </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Suero bovino fetal definido (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido L-ascórbico 2-fosfato </td><td> Sigma </td><td> A8960-5G </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> GIBCO </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> Dexametasona </td><td> Sigma </td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> β-glicerol fosfato disódico hidrato de sal, BioUltra </td><td> Sigma </td><td> G9422-100G </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potasio monobásico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Osteogénesis Kit de ensayo </td><td> Millipore </td><td> PS01802031 </td><td></td></tr><tr><td> IgG2b de ratón-PE de control de isotipo </td><td> BD Pharmingen </td><td> 50808088029 </td><td></td></tr><tr><td> FITC IgG2b de ratón control del isotipo </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559532 </td><td></td></tr><tr><td> FITC isotipo IgG1 de ratón κ </td><td> BD Pharmingen </td><td> 11471471 </td><td></td></tr><tr><td> FITC / PE de ratón anti-humano CD34/CD45 </td><td> BD Pharmingen </td><td>341071 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti-humana de CD146 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550315 </td><td></td></tr><tr><td> Monoclonal de ratón anti-humano CD90/FITC </td><td> Daka </td><td> 00034418 </td><td></td></tr><tr><td> PE de ratón anti-CD73 humano </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550257 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-h CD105/Endoglin PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> FAB10971P </td><td></td></tr><tr><td> PE de ratón anti-humano CD11b/Mac1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 5553888 </td><td></td></tr><tr><td> CD44 PE ratón anti-humano </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555479 </td><td></td></tr><tr><td> Con solución tampón fosfato (PBS) </td><td> GIBCO </td><td> 003000 </td><td></td></tr><tr><td> 70-m de células colador </td><td> Halcón </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td&gt; 0,2 micras filtro de jeringa </td><td> Millex-GV </td><td> SLGV033RB </td><td></td></tr><tr><td> 25 cm 2 cultura matraz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z707481 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPO </td></tr><tr><td> BD FACSCalibur </td><td> BD </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Multiskan espectrofotómetro de microplacas </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51119200 </td><td></td></tr><tr><td> Fleurcense Microscopio </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluir versión del software 2.3.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la pulpa dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

<p class="jove_content"&gt; Desarrollo de las muelas del juicio son de fácil acceso fuente de células madre durante la edad adulta que se podría obtener por la rutina de tratamientos de ortodoncia. Humanos derivados de células madre de pulpa (hDPSCs) poseen potencial de proliferación de altura con capacidad de diferenciación multi-linaje comparar con el origen común de las células madre adultas<sup&gt; 1-8</sup&gt;, Por lo tanto, podría ser hDPSCs los buenos candidatos para el trasplante autólogo en ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa. Junto con estas ventajas, que posea las células madre mesenquimales (MSC) características, tales como el efecto immunolodulatory, hacer hDPSCs más valioso, incluso en el caso de trasplante de aloinjerto<sup&gt; 6,9,10</sup&gt;. Por lo tanto, el primer paso para el uso de esta fuente de células madre es seleccionar el mejor protocolo para aislar hDPSCs de tejido de la pulpa. Con el fin de lograr este objetivo, es crucial para investigar el efecto de diferentes condiciones de aislamiento en diferentes comportamientos celulares, tales como sus marcadores de superficie comunes y también su capacidad de diferenciación.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Por lo tanto, aquí nos separamos tejido pulpar humano a partir de los terceros molares, y después utilizar ambos protocolos existentes basados ​​en la literatura, por hDPSCs aislamiento,<sup&gt; 11-13</sup&gt;<em&gt; Es decir,</em&gt; Disociación enzimática del tejido pulpar (DPSC-ED) o la extensión de explantes de tejidos (DPSC-OG). En este aspecto, hemos tratado de facilitar los métodos de aislamiento mediante disco de diamante dentales. Entonces, estas células se caracteriza en términos de estroma marcadores asociados (CD73, CD90, CD105 y CD44), marcadores hematopoyéticos / endotelial (CD34, CD45 y CD11b), marcador perivascular, como CD146 y también STRO 1-. Después, estos dos protocolos se compararon sobre la base de la potencia diferenciación en odontoblastos tanto por reacción en cadena de la polimerasa (QPCR) y tinción Rojo de alizarina. QPCR se utilizaron para la evaluación de la expresión de los genes relacionados con la mineralización-(fosfatasa alcalina; ALP, phosphoglycoprotein matriz extracelular; MEPE y dentina sialophosphoprotein; DSPP).<sup&gt; 14</sup</p

<ol><li> DPSCs que fueron obtenidos por disociación enzimática (DPSC-ED) se muestran aquí, en días 10, 15,18 (Figura 1). Las colonias iniciados para formar en casi 3 a 5 días después del aislamiento. </li><li> DPSCs superado (DPSC-OG) se muestran en la Figura 2 en el día 5, 10, 13 y 18. Similares a fibroblastos células comenzaron a migrar de tejido de la pulpa en el matraz por paralelo ordenar por casi 5 días después de la siembra. </li><li> DPSCs en el paso 3 con ambos métodos se muestran en la Figura ...

El método se describe el aislamiento y caracterización de células humanas de la Pulpa Dental madre (hDPSCs) mediante el uso de cualquiera de los dos<strong&gt; Disociación enzimática de la pulpa (DPSC-ED)</strong&gt; O<strong&gt; Consecuencia directa de las células madre a partir de explantes de tejido pulpar (DPSC-OG). A continuación, seguido por</strong&gt;<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación comparativo de ambos tipos de hDPSCs en odontoblastos.

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Los dientes del juicio en desarrollo son una fuente de células madre fácilmente accesible durante la edad adulta, que pueden obtenerse mediante tratamientos ortodóncicos rutinarios. Humano...

El objetivo general de este procedimiento es aislar, caracterizar y diferenciar células madre del pulpo dental humano de dientes permanentes mediante dos métodos. Esto se logra recolectando muelas del juicio incluidas sanas, cortándolas alrededor de la unión cemento-esmalte al inicio. Las células madre del pulpo dental (D PSCs) se aíslan mediante dos métodos diferentes.En el primer método, los tejidos de pólipo se digieren enzimáticamente mediante incubación en colagenasa tipo uno más solución de espacio discal. Aquí los denominamos ed. Considerando el método de aislamiento en el segundo método, los tejidos palp se colocan únicamente en el frasco sin ninguna digestión.De esta manera, las dpss comienzan a migrar desde el tejido hacia el matraz. Estas células denominadas OG hacen referencia al método de aislamiento por crecimiento periférico. El segundo paso del procedimiento es la identificación de células madre mediante citometría de flujo.El tercer paso del procedimiento es la inducción de la diferenciación de odontoblastos, y el paso final es la evaluación comparativa de la diferenciación de odontoblastos entre dos grupos mediante tinción en rojo y QBCR. Soy RA Kde del Departamento de Células Madre y Biología del Desarrollo del Instituto Rian. Hoy les mostraré el aislamiento, caracterización y diferenciación comparativa de células madre mesenquimales humanas utilizando dos métodos.Hola, soy el Dr. Rezaian del Instituto Rio. Estamos trabajando en un proyecto relacionado con células madre del pulpo dental humano. Estas células son un tipo de células madre mesenquimatosas, que son fáciles de obtener con mínima molestia y morbilidad.Las células madre mesenquimales se caracterizan por su capacidad plástica de formar colonias y su potencial de diferenciación múltiple. Hola, soy la Dra. Ami del Departamento de Células Madre. En el instituto, utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para aislar células madre con fines de estudios de investigación y aplicaciones futuras.En medicina regenerativa, el primer paso para utilizar esta fuente de células madre en futuras terapias basadas en células madre consiste en elegir el mejor protocolo para aislar células madre a partir de tejido pulpar humano. Para alcanzar este objetivo, es fundamental investigar ciertos aspectos del comportamiento celular bajo distintas condiciones de aislamiento de células madre. Primero, voy a aislar células madre de la pulpa dental humana mediante la disociación enzimática de la pulpa o mediante la migración de células madre a partir de implantes de tejido.Luego, caraterícelos y diferéncielos en blastocito. Así que comencemos. En primer lugar, disuelva la enzima y la colagenasa tipo I en PBS.Luego, filtrelos utilizando un filtro de jeringa de 0,2 micrones. Transfiera ambos al tubo cónico. A continuación, agregue pener y PBS para obtener una concentración final.Transfiera dientes del juicio sanos al laboratorio en medio básico frío y bajo condiciones estériles. Limpie la superficie del diente con etanol al 70 % antes de estudiarlo. Asegúrese de eliminar cualquier partícula de la superficie del diente.Corte el diente alrededor de la unión cemento-esmalte utilizando un disco dental esterilizado para exponer la cámara pulpar. Debe tenerse en cuenta que el proceso de corte debe realizarse lentamente para reducir el sobrecalentamiento del tejido dental. Luego, separe suavemente el tejido pulpar de la corona, es decir, corte el tejido pulpar en fragmentos de uno a dos milímetros con la hoja de Scarpa.Transfiera pequeñas porciones de tejido pulpar a una mililitro de solución enzimática durante una hora a 37 grados Celsius, agitando en vórtex cada 30 minutos para ayudar a desagregar los tejidos pulpares. Posteriormente, elimine los agregados grandes pasándolos a través de un filtro celular de 70 micrones. Luego, agregue PBS que contenga PENER y centrifugue a 1.200 RPM durante cinco minutos.Retire cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, suspendemos la placa en el medio de proliferación pm, la transferimos al frasco de cultivo y agregamos medio. Luego, incubamos.Cambie el medio cada tres días hasta alcanzar la confluencia celular para el método de trabajo externo. Repita el proceso de corte. Después de cortar, coloque los tejidos dentales en fragmentos de uno a dos milímetros.Luego colóquelos en el cultivo. Incube con el medio de proliferación. Debe tenerse en cuenta que el volumen total del medio de proliferación debe favorecer la adhesión de todos los fragmentos para el posterior crecimiento celular.Cambie el medio después de observar el crecimiento y luego cada tres días hasta alcanzar la confluencia celular. Para la inmunofenotipificación, incube ambos tipos de D PSC con anticuerpos conjugados con PE o FITC durante 30 minutos a cuatro grados Celsius en la oscuridad. Luego agregue PBS y centrifugue a 1.200 RPM durante cinco minutos.Elimine el sobrenadante, resuspenda la placa en PBS y finalmente evalúe los marcadores de superficie mediante citometría de flujo. Subcultive ambos tipos de DPC durante tres pasajes. Luego, retire con tripsina en hielo y transfiera las células a seis placas de cultivo rojas con una confluencia del 60 %, reemplazando el medio de mantenimiento (PM) por medio odontogénico. Deje tres pocillos como control negativo añadiendo PM.Cambie el medio cada tres días; en el día 21, lave las células con PBS. Luego, fíjelas con un mililitro por pocillo de gel de formal al 10 % durante 15 minutos a temperatura ambiente.Después de 15 minutos, retire cuidadosamente el fijador y enjuague las células tres veces con agua destilada. Luego, sustituya el agua por un mililitro por alza roja en solución de tinción roja. Después de 20 minutos, eliminamos el exceso de colorante y lavamos las células cuatro veces con agua desionizada.Luego, agregue un milímetro por pozo de agua para evitar que las células se sequen. Después de la tinción, puede observar tres rieles superiores que se vuelven rojos en comparación con los controles bajo el microscopio; puede ver la absorción del colorante alrededor de la célula mediante un aumento elevado para la cuantificación de la tinción roja. Después de eliminar el agua, agregue un mililitro por pozo de ácido acético al 10 % y luego incube durante 30 minutos con agitación.Luego, retire suavemente las células de la placa utilizando un raspador celular. A continuación, transfiéralas a tubos separados. Agite vigorosamente durante 30 segundos.Luego, caliente a 85 grados Celsius durante 10 minutos. Para evitar la evaporación, selle los tubos con ParaView y transfiera los tubos a hielo durante cinco minutos; luego centrifúgelos a 20.000 G durante 15 minutos. Mientras tanto, prepare una dilución seriada estándar de rojo de aluminio según el protocolo de la región.Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y transfiera los tubos a nuevos tubos. Neutralice el pH con hidróxido de amonio al 10 %. Luego agregue los patrones y también las muestras en 96.Coloque en placas de cultivo y luego mida la absorbancia a 405 nanómetros y analice los datos según la dilución seriada estándar. Aquí puede observar DPCs, que se aíslan mediante disociación enzimática en los días 10, 15 y 18, así como DPCs expandidos en los días 5, 10, 13 y 18. Ambos tipos de dpss en el caso tres tienen casi el mismo tamaño y morfología. Los resultados de inmunofenotipado muestran la presencia de marcadores de células madre mesenquimales como CD 44, CD 73 y CD 19, y la ausencia de marcadores hematopoyéticos y endoteliales como CD 34, CD 45 y CD 11 B. Curiosamente, las expresiones de CD 1 0 5 y CD 146 son mayores en las dPSCs expandidas en comparación con las D-P-S-C-E-D. La cuantificación de la tinción roja de enzima en el día 21 de diferenciación en odontoblastos muestra una mayor deposición de calcio en las D-P-S-C-E-D en comparación con las células madre dentales sin inducir.Los resultados de qPCR también indican expresiones significativamente más altas de MEP y A LP como marcadores de mineralización en D-P-S-C-D en comparación con las células madre dentales salientes. Mientras tanto, ambos genes se regulan durante la diferenciación y además la expresión de DSPP como marcador odontogénico aumenta durante la diferenciación. Sin embargo, no hay variación significativa en la expresión de DSVP en células diferenciadas entre los grupos ED y OG.Acabamos de mostrarle cómo aislar células madre de partes dentales humanas utilizando ya sea la disociación enzimática de la pulpa o el crecimiento de células madre a partir de explantes de tejido. Eso es todo. Le deseamos mucha suerte al intentar utilizar este procedimiento en su experimento.Gracias.

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Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes (Video) | JoVE Journal

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

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