Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

El objetivo general de este procedimiento es aislar cardiomiocitos viables de muestras ventriculares humanas enfermas y caracterizar sus alteraciones funcionales. Esto se logra primero recolectando y picando rápidamente muestras ventriculares frescas en una solución cardiopléjica helada para evitar la degradación excesiva del tejido y el daño celular. El segundo paso es realizar una digestión escalonada de los trozos de miocardio utilizando un dispositivo de digestión hecho a medida y soluciones enzimáticas.

En seis ciclos, la célula que contiene tampón se recoge en un tubo en cada ciclo y se diluye con una solución que conserva la célula. El paso final es resuspender las células contenidas en los seis tubos en un volumen menor de solución fisiológica estándar con concentraciones normales de calcio para realizar la caracterización funcional. En última instancia, el registro de los potenciales de acción y la evaluación simultánea del calcio intercelular mediante colorantes fluorescentes se utilizan para mostrar las alteraciones de la acción, la duración potencial y el ciclo del calcio intracelular en cardiomiocitos de pacientes con miocardiopatía hipertrófica.

La principal ventaja de DYS único sobre un método de 16, al igual que el método estándar de deyección de trozos, es que en una asociación con solución enzimática, utilizamos un dispositivo de digestión hecho a medida, que permite una disociación conjunta de citos variables gracias a sus raspados de silicona. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cardiología, como por ejemplo, cómo la conocida remodelación molecular y estructural asociada a las enfermedades cardíacas se refleja en la alteración de cardiomiocitos individuales que pueden ser analizados por nuestro método y dirigidos por fármacos específicos. Por lo tanto, las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de enfermedades cardíacas genéticas como la miocardiopatía hipertrófica.

De hecho, este método se puede utilizar para probar nuevos enfoques neuropáticos en cardiomiocitos ventriculares de pacientes con enfermedades cardíacas hipertróficas o isquémicas que se sometieron a cirugía cardíaca. La idea de este método fue al comparar la analogía entre las muestras de arteria humana y las biopsias ventriculares obtenidas durante una cirugía cardíaca. Comience este procedimiento vertiendo 40 mililitros de solución cardiopléjica en un tubo de 50 mililitros y guárdela en hielo para el transporte de la muestra desde la sala de operaciones hasta el laboratorio de aislamiento celular, transfiera rápidamente la muestra al área del laboratorio y comience el procesamiento de la muestra dentro de los 10 minutos posteriores a la escisión de la muestra.

Siguiente muestra miocárdica ventricular colectiva del quirófano inmediatamente después de la escisión. Lávelo con una solución de CP helada y guárdelo en el tubo mientras mantiene la muestra en un tampón de CP helado. Retire con cuidado la capa fibrótica endocárdica con unas tijeras finas después.

Cortar el tejido miocárdico en trozos pequeños de dos a tres milímetros de largo con la cantidad total de miocardio ventricular entre 100 miligramos y un gramo por cada aislamiento. Después de que los trozos se transfieran a la cámara de raspado del dispositivo de digestión, cambie el tampón CP en la cámara con un tampón de disociación libre de calcio frío. Luego coloque el dispositivo de digestión en un baño termostático.

Pon la bañera a 37,5 grados centígrados y enciéndela. A continuación, encienda el motor del dispositivo de digestión y ajuste la velocidad de rotación a una revolución por segundo. Realizar tres ciclos de lavado con DB y cambiar la solución en la cámara con DB limpia saturada de oxígeno a 37 grados centígrados cada ocho minutos.

Después de eso, prepare el tampón enzimático uno agregando 250 unidades por mililitro de colagenasa tipo cinco y cuatro unidades por mililitro de proteasa. Escriba 24 en la solución de base de datos. A continuación, prepare el tampón enzimático dos añadiendo 250 unidades por mililitro de colagenasa.

Tipo cinco a la solución DB oxigena EB uno y caliéntala hasta 37 grados centígrados. Luego realice dos ciclos de digestión de 12 minutos en el dispositivo de digestión giratorio con tres mililitros de EB 100% oxigenado uno a 37 grados centígrados. Retire la solución por aspiración con pipeta y deséchela después de cada ciclo.

A continuación, prepare seis tubos de 15 mililitros para la recolección de células y 80 mililitros de solución de preparación artesanal de cuatro grados centígrados para eludir los tampones, oxigenar EB dos y trabajar hasta 37 grados centígrados. Posteriormente, realizar un primer ciclo de digestión de 15 minutos con tres mililitros de EB 100% oxigenado dos a 37 grados centígrados. Después del ciclo de digestión, recoja la solución que contiene los primeros miocitos asociados en un tubo de 15 mililitros y diluya la suspensión celular con 12 mililitros de solución fría de KB.

Almacene el tubo plano a temperatura ambiente, realice otros cinco ciclos de digestión de 12 minutos con tres mililitros de EB dos a 37 grados Celsius y recoja el tampón que contiene miocitos en cada ciclo en un tubo cónico de 15 mililitros. Recuerde también diluir los tres mililitros de tampón recolectados con 12 mililitros de solución de KB en cada ciclo. Al final, guarde las seis celdas que contienen tubos a temperatura ambiente.

En este paso, agregue un miligramo por mililitro de albúmina sérica bovina a 20 mililitros de tampón tiroico libre de calcio. A continuación, filtre la solución y centrifugue los seis tubos cónicos que contienen miocitos a 100 queso durante cinco minutos. Para forzar la sedimentación de los miocitos, se retira el sobrenadante y se vuelven a suspender las células de cada tubo con una cantidad variable de BSA que contenga TB a temperatura ambiente.

Aumente gradualmente la concentración de calcio en la celda que contiene tampón agregando pequeños OTT de 100 milimolares por litro de solución de cloruro de calcio en el primer y segundo paso. La concentración de calcio se eleva a 50 micro molares por litro y 100 micro molares por litro respectivamente. Los siguientes pasos de adición de calcio se realizan cada cinco minutos, y la concentración se eleva en 100 micromolares por litro en cada paso hasta una concentración final de 0,9 milimolares por litro.

Para evaluar el rendimiento del procedimiento de aislamiento, transfiera 0,5 mililitros de solución que contiene miocitos a la cámara con fondo de vidrio de un microscopio. Evalúe 15 campos de microscopio con un aumento objetivo de 10x y calcule el porcentaje de miocitos sanos, como las células en forma de bastón con estrías claras y sin inclusiones significativas. Los rendimientos esperados deben ser de alrededor del 20% para demostrar la evaluación funcional de los cardiomiocitos humanos, incluidos los registros simultáneos de los potenciales de acción y los flujos de calcio intracelular.

En primer lugar, prepare la solución de pipeta para los experimentos de pinza de parche en la configuración de parche perforado. A continuación, añada 1,8 milimolar de cloruro de calcio a la tb libre de calcio. Utilice la solución para la superfusión de cardiomiocitos durante los experimentos de fluorescencia con pinza de parche.

A continuación, transfiera un mililitro de suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros y agregue 10 micromolares por litro y 10 microlitros de carga de energía. Concentrado incubado durante 30 minutos a temperatura ambiente en posición horizontal. A continuación, coloque el tubo en posición vertical y deje que las células se asienten durante cinco minutos.

A continuación, pipetear el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en tb que contiene calcio. Punto de transferencia de 25 mililitros de suspensión celular a una pequeña cámara de registro montada en un microscopio de temperatura controlada. Súper fusionado por gravedad con un sistema de micro fuer calentado a un caudal de 0,3 mililitros por minuto a 37 grados centígrados.

Con un extractor de micropipetas, prepare pipetas de abrazadera de parche con un diámetro de punta de tres a cinco micrómetros y una resistencia de tres a 4,5 mega ohmios cuando estén llenas de ps. Después de eso, agregue anfotericina B a PS a 250 microgramos por mililitro y utilícela para llenar los electrodos, luego monte el electrodo en el soporte de la pipeta. A continuación, seleccione la celda en forma de Ron con estrías claras y desprovista de inclusiones.

Forme el sello giga y espere de cinco a 10 minutos hasta que la resistencia de acceso caiga por debajo de 20 ohmios. Posteriormente, provocan potenciales de acción en modo de pinza amperimétrica utilizando pulsos cortos a diferentes frecuencias de estimulación. Durante la fase de grabación, encienda la iluminación de campo brillante a 492 nanómetros y detecte la fluorescencia del fuerte de flúor a 505 a 520 nanómetros.

A continuación, adquiera las señales de fluorescencia y potencial de membrana. En esta figura se muestran las alteraciones de los potenciales de acción en cardiomiocitos ventriculares a partir de las muestras de HCM. Estos son los potenciales de acción representativos superpuestos provocados a 0,2 hercios, 0,5 hercios y un hercio de un miocito de control y un miocito HCM.

Los potenciales de acción superpuestos a 0,5 hercios de un miocito control. En ausencia y presencia de 10 a siete molares se muestra isoproterenol, y aquí está el rastro representativo del potencial de membrana de un cardiomiocitos de un paciente con HCM, que mostró varias despolarizaciones espontáneas temprano después de las despolarizaciones. La figura muestra las alteraciones transitorias del calcio en los cardiomiocitos ventriculares de las muestras de HCM.

Aquí están los transitorios de calcio superpuestos representativos provocados durante la estimulación a 0,2 hercios a través de la pipeta de parche en un miocito de control y una célula HCM. Se muestra la cinética de los transitorios de calcio en los cardiomiocitos HCM y control en diferentes momentos, y aquí se muestran los trazos largos representativos que muestran el calcio intracelular durante la estimulación a tres frecuencias diferentes, lo que destaca el aumento del calcio diastólico a altas tasas de estimulación en el miocito HCM. Esta figura muestra las aplicaciones experimentales adicionales con miocitos ventriculares humanos.

Las trazas superpuestas representativas que muestran la corriente de calcio tipo L registrada a diferentes voltajes de membrana se muestran a la izquierda, y la densidad máxima promedio de corriente de calcio tipo L de 18 células aisladas de muestras de HCM a diferentes voltajes de membrana se muestra a la derecha y aquí se muestra la traza de calcio intracelular registrada de un miocito ventricular durante la estimulación del campo eléctrico a un hercio. Al intentar este procedimiento, es importante recordar comenzar el procedimiento poco después de la recolección de la muestra del quirófano para garantizar que se siga este procedimiento para aislar los cardiomiocitos ventriculares humanos. Se pueden realizar otros métodos como la microscopía confocal de estilo de vida o la inmunoquímica, y esto será crucial para responder a preguntas fundamentales como, por ejemplo, cómo se altera la localización subcelular de las estructuras de membrana y las unidades de liberación de calcio en las enfermedades cardíacas después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino en cardiología celular para estudiar las anomalías funcionales en los cardiomiocitos ventriculares y probar la utilidad potencial de nuevas opciones terapéuticas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar cardiomiocitos individuales viables de muestras humanas y cómo caracterizar la función celular en diferentes condiciones.