Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

El objetivo general de este procedimiento es aislar cardiomiocitos viables a partir de muestras ventriculares humanas de tejido enfermo y caracterizar sus alteraciones funcionales. Esto se logra primero recolectando y picando rápidamente muestras ventriculares frescas en una solución cardioplégica fría con hielo para evitar una degradación excesiva del tejido y daño celular. El segundo paso consiste en realizar una digestión escalonada de los fragmentos miocárdicos utilizando un dispositivo de digestión personalizado y soluciones enzimáticas.

En seis ciclos, la celda que contiene el tampón se recoge en un tubo en cada ciclo y se diluye con una solución conservadora de células. El paso final consiste en resuspender las células contenidas en los seis tubos en un volumen menor de solución fisiológica estándar con concentraciones normales de calcio para realizar la caracterización funcional. Finalmente, se utiliza la técnica de registro por parche para grabar los potenciales de acción y evaluar simultáneamente el calcio intracelular mediante colorantes fluorescentes, con el fin de mostrar las alteraciones en la acción, la duración del potencial y el ciclo del calcio intracelular en cardiomiocitos de pacientes con miocardiopatía hipertrófica.

La principal ventaja de DYS único frente a un método de 16 pasos, como el método estándar de expulsión de fragmentos, es que, en asociación con la solución enzimática, utilizamos un dispositivo de digestión personalizado, que permite una desasociación conjunta de células variables gracias a sus raspadores de silicona. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cardiología, como cómo los conocidos remodelado molecular y estructural asociados a enfermedades cardíacas se reflejan en alteraciones de cardiomiocitos individuales, que pueden analizarse mediante nuestro método y ser blanco de fármacos específicos. Así, las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de enfermedades cardíacas genéticas, como la miocardiopatía hipertrófica.

De hecho, este método puede utilizarse para probar nuevos enfoques neuropáticos en cardiomiocitos ventriculares de pacientes con enfermedades cardíacas hipertróficas o isquémicas que se sometieron a cirugía cardíaca. Tuvimos la idea de este método al comparar la analogía entre muestras de arteria humana y biopsias ventriculares obtenidas durante la cirugía cardíaca. Comience este procedimiento vertiendo 40 mililitros de solución cardioplégica en un tubo de 50 mililitros y guárdela en hielo para el transporte rápido de la muestra desde el quirófano hasta el laboratorio de aislamiento celular; transfiera rápidamente la muestra al área del laboratorio e inicie el procesamiento de la muestra dentro de los 10 minutos posteriores a la escisión del tejido.

Obtenga a continuación una muestra colectiva de miocardio ventricular del quirófano inmediatamente después de la escisión. Lávela con solución CP fría con hielo y almacénela en el tubo manteniendo la muestra en tampón CP frío con hielo. Posteriormente, retire cuidadosamente la capa fibrosa endocárdica utilizando tijeras finas.

Corte el tejido miocárdico en pequeños fragmentos de dos a tres milímetros de longitud, con una cantidad total de miocardio ventricular entre 100 miligramos y un gramo para cada aislamiento. Después de transferir los fragmentos a la cámara de raspado del dispositivo de digestión, cambie el tampón CP en la cámara por tampón de disociación frío sin calcio. A continuación, coloque el dispositivo de digestión en un baño termostático.

Coloque el baño a 37,5 grados Celsius y enciéndalo. A continuación, encienda el motor del dispositivo de digestión y ajuste la velocidad de rotación a una revolución por segundo. Realice tres ciclos de lavado con DB y cambie la solución en la cámara por DB limpio saturado con oxígeno a 37 grados Celsius cada ocho minutos.

Después de eso, prepare el tampón enzimático uno añadiendo 250 unidades por mililitro de colagenasa tipo cinco y cuatro unidades por mililitro de proteasa. Tipo 24 a la solución DB. Luego prepare el tampón enzimático dos añadiendo 250 unidades por mililitro de colagenasa.

Coloque cinco en la solución de DB para oxigenar EB uno y caliéntela hasta 37 grados Celsius. Luego, realice dos ciclos de 12 minutos de digestión en el dispositivo de digestión rotatorio con tres mililitros de EB uno oxigenado al 100 % a 37 grados Celsius. Retire la solución mediante aspiración con pipeta y deséchela después de cada ciclo.

A continuación, prepare seis tubos de 15 mililitros para la recolección de células y 80 mililitros de solución de cerveza artesanal a cuatro grados Celsius para eliminar los tampones oxigenados EB dos y eleve la temperatura hasta 37 grados Celsius. Posteriormente, realice un primer ciclo de digestión de 15 minutos con tres mililitros de EB dos al 100% oxigenado a 37 grados Celsius. Después del ciclo de digestión, recoja la solución que contiene los miocitos asociados en primer lugar en un tubo de 15 mililitros y diluya la suspensión celular con 12 mililitros de solución KB fría.

Guarde el tubo en posición horizontal a temperatura ambiente, realice otros cinco ciclos de digestión de 12 minutos con tres mililitros de EB dos a 37 grados Celsius y recoja el tampón que contiene los miocitos en cada ciclo en un tubo cónico de 15 mililitros. Recuerde también diluir el tampón recolectado de tres mililitros con 12 mililitros de solución KB en cada ciclo. Al final, guarde los seis tubos que contienen células a temperatura ambiente.

En este paso, agregue un miligramo por mililitro de albúmina sérica bovina a 20 mililitros de tampón Tyro sin calcio. Luego, filtre la solución y centrifugue los seis tubos cónicos que contienen miocitos a 100 ×g durante cinco minutos. Para forzar el sedimentado de los miocitos, retire el sobrenadante y resuspenda las células en cada tubo con una cantidad variable de TB que contenga BSA a temperatura ambiente.

Aumente gradualmente la concentración de calcio en la celda que contiene el tampón añadiendo pequeñas cantidades de solución de cloruro de calcio 100 milimolar por litro en los dos primeros pasos. La concentración de calcio se eleva a 50 micromoles por litro y 100 micromoles por litro, respectivamente. Los siguientes pasos de adición de calcio se realizan cada cinco minutos, y la concentración se incrementa en 100 micromolar por litro en cada paso hasta alcanzar una concentración final de 0,9 milimolar por litro.

Para evaluar el rendimiento del procedimiento de aislamiento, transfiera 0,5 mililitros de la solución que contiene miocitos a la cámara con fondo de vidrio de un microscopio. Evalúe 15 campos microscópicos con un aumento objetivo de 10 x y calcule el porcentaje de miocitos sanos, como aquellas células con forma de varilla, con estriaciones definidas y sin inclusiones significativas. Los rendimientos esperados deben ser de aproximadamente 20 % para demostrar la evaluación funcional de cardiomiocitos humanos, incluyendo grabaciones simultáneas de potenciales de acción y flujos intracelulares de calcio.

Primero, prepare la solución para pipeta para experimentos de registro de parche en configuración de parche perforado. Luego agregue 1,8 milimolar de cloruro de calcio al tb sin calcio. Utilice la solución para la superfusión de cardiomiocitos durante experimentos de fluorescencia de registro de parche.

A continuación, transfiera un mililitro de la suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros y agregue flu fort a 10 micromolar por litro y 10 microlitros de power load. Incube concentrado durante 30 minutos a temperatura ambiente en posición horizontal. Posteriormente, coloque el tubo en posición vertical y deje que las células sedimenten durante cinco minutos.

Luego, aspire el sobrenadante y re suspenda el botón celular en tampón con calcio. Transfiera 0,25 mililitros de la suspensión celular a una pequeña cámara de grabación montada en el microscopio con control de temperatura. Superfunda por gravedad con un sistema microfusor calentado a un flujo de 0,3 mililitros por minuto a 37 grados Celsius.

Utilizando un tirador de micropipetas, prepare pipetas para registro de parche con un diámetro de punta de tres a cinco micrómetros y una resistencia de tres a 4,5 megaohmios cuando se llenan con ps. A continuación, agregue anfotericina B al PS hasta alcanzar una concentración de 250 microgramos por mililitro y úsela para llenar los electrodos, luego monte el electrodo en el porta-pipeta. A continuación, seleccione la célula con forma de Ron que presente estrías claras y esté libre de inclusiones.

Forme el sello giga y espere de cinco a 10 minutos hasta que la resistencia de acceso disminuya por debajo de 20 ohmios. Posteriormente, induzca potenciales de acción en modo de fijación de corriente mediante pulsos breves a diferentes frecuencias de estimulación. Durante la fase de grabación, encienda la iluminación de campo brillante a 492 nanómetros y detecte la fluorescencia de Fluor fort entre 505 y 520 nanómetros.

Luego adquiera las señales de fluorescencia y potencial de membrana. Esta figura muestra las alteraciones de los potenciales de acción en cardiomiocitos ventriculares de las muestras de MCH. A continuación se muestran los potenciales de acción superpuestos representativos inducidos a 0,2 hercios, 0,5 hercios y un hercio, provenientes de un miocito control y un miocito de MCH.

Los potenciales de acción superpuestos a 0,5 hercios de un miocito control. Se muestran en ausencia y en presencia de isoproterenol 10⁻⁷ molar, y aquí se observa el trazo representativo del potencial de membrana de un cardiomiocito de un paciente con MCH, que presentó varias despolarizaciones espontáneas tempranas tras la despolarización. La figura muestra las alteraciones del transitorio de calcio en cardiomiocitos ventriculares de muestras de MCH.

A continuación se muestran las transitorios representativos de calcio superpuestos, inducidos durante la estimulación a 0,2 hercios mediante la pipeta de registro en un miocito control y una célula con MCH. Se presentan la cinética de los transitorios de calcio en miocitos cardíacos con MCH y control en diferentes momentos, y aquí hay trazas representativas prolongadas que muestran el calcio intracelular durante la estimulación a tres frecuencias distintas, lo que resalta el aumento del calcio diastólico a tasas elevadas de estimulación en el miocito con MCH. Esta figura muestra aplicaciones experimentales adicionales utilizando miocitos ventriculares humanos.

Los trazos representativos superpuestos que muestran la corriente de calcio de tipo L registrada a diferentes voltajes de membrana se muestran a la izquierda, y la densidad pico promedio de la corriente de calcio de tipo L de 18 células aisladas de muestras de MCH a diferentes voltajes de membrana se muestra a la derecha; aquí se muestra también el trazo de calcio intracelular registrado de un miocito ventricular durante la estimulación eléctrica por campo a un hercio. Al realizar este procedimiento, es importante recordar comenzar poco después de la recolección de la muestra procedente del quirófano para asegurar la viabilidad. Siguiendo este procedimiento para aislar cardiomiocitos ventriculares humanos. Se pueden realizar otros métodos como microscopía confocal con láser o inmunoquímica, lo cual será crucial para responder preguntas fundamentales, como, por ejemplo, cómo se altera la localización subcelular de las estructuras de membrana y las unidades de liberación de calcio en las enfermedades cardíacas tras su desarrollo.

Esta técnica abrió el camino en la cardiología celular para estudiar las anomalías funcionales en los cardiomiocitos ventriculares y para probar la utilidad potencial de nuevas opciones terapéuticas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar cardiomiocitos individuales viables a partir de muestras humanas y de cómo caracterizar la función celular en diferentes condiciones.