Análisis y construcción de estructuras de ácidos nucleicos con 3DNA

El objetivo general de este procedimiento es llevar el conjunto de programas 3D NA a los científicos de laboratorio y otros para investigar la organización espacial del ADN y el ARN con herramientas computacionales de última generación. Esto se logra descargando primero el software del foro de 3D NA e instalándolo en una computadora local. El segundo paso es analizar una estructura de ADN representativa a nivel de los pasos del par de bases constituyentes.

A continuación, la misma estructura de ADN se modifica en el nivel de paso del par de bases y, a continuación, se reconstruye utilizando los parámetros de paso del par de bases recién definidos. El siguiente paso es el análisis de un gran conjunto de estructuras relacionadas. El paso final es la alineación de un conjunto de estructuras de ADN relacionadas en un marco de referencia común para visualizar las distorsiones globales de las estructuras.

En última instancia, las herramientas 3D NA se utilizan para examinar cómo los pasos de los pares de bases individuales, incluidos los unidos a fármacos y proteínas, contribuyen al plegamiento general del ADN y para identificar los sitios y direcciones de distorsiones globales considerables. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que el software es robusto y ampliamente aplicable a una variedad de diferentes estructuras que contienen ácidos nucleicos. El método puede ayudar a responder preguntas clave en bioquímica y biofísica, como cómo se organizan los genomas en tres dimensiones y qué tipo de deformación puede adoptar el ADN.

Para comenzar la instalación del paquete de software, conéctese a las tres website@xthreed. de DA y haga clic en el enlace al foro de 3D NA dentro del foro. Seleccione el enlace de registro y siga las instrucciones para crear una nueva cuenta.

Una vez que se haya establecido un nombre de usuario y una contraseña, inicie sesión en el foro, seleccione el enlace de descargas en la sección de bienvenida y, en la nueva página, elija Descarga 3D NA. Haga doble clic en el archivo tar gz para crear una carpeta llamada X 3D NA dash V 2.1, que contiene el software 3D NA. Abra la aplicación de terminal, que normalmente se encuentra en utilidades en un Macintosh, y cambie al directorio X 3D NA dash V 2.1.

Ejecute el script de instalación necesario para que 3D NA funcione correctamente. Todos los comandos utilizados en este video se pueden encontrar en el protocolo de texto. A continuación, copie las dos configuraciones de exportación de línea que aparecen impresas en la pantalla.

Si el usuario ha colocado el software en el directorio de aplicaciones, las dos líneas deberían aparecer como se muestra aquí. Abra la aplicación de edición de texto que se encuentra en el directorio de aplicaciones. En el menú de formato, seleccione Crear texto sin formato.

Si existe un archivo BRC, abra el archivo en texto, edite y pegue la configuración de exportación al final del archivo. Si no, existe el archivo bash RC, pegue la configuración de exportación en un archivo en blanco y guárdelo con el nombre de archivo bash RC en el directorio de inicio. Para que la nueva configuración esté disponible, ejecute el archivo Bash RC recién guardado dentro del programa de terminal.

Este vídeo muestra el análisis de una estructura representativa de ácido nucleico, el ADN unido a la proteína HBB de la bacteria Borrelia bergdorf eye. El primer paso en el análisis de NA 3D es la creación de un archivo que enumere todas las bases emparejadas. Esto se hace escribiendo un comando para aplicar el programa Find para a la estructura atómica almacenada en el archivo a NP two, MP two pdb.

El siguiente paso en el análisis es determinar los parámetros geométricos que caracterizan la estructura. El comando analyze toma como entrada el archivo de par base y crea varios archivos de salida que aparecen en el directorio de trabajo. Los valores geométricos se pueden calcular escribiendo, analizar dos MP dos bps.

Los archivos de salida generados incluyen dos MP dos fuera, que contiene una descripción general de los parámetros calculados y bpco step par, que contiene una lista de los parámetros del cuerpo rígido además del análisis de una estructura de ácido nucleico, el software 3D NA proporciona la capacidad de construir un modelo estructural a partir de parámetros de cuerpo rígido utilizando el comando de reconstrucción para crear un modelo atómico aproximado, que incluye coordenadas para los átomos de la columna vertebral y la base. Escriba el comando que aparece en el texto. Este comando indica a 3D NA que introduzca una confirmación de red troncal BDNA estándar en la construcción de modelos a partir de parámetros de cuerpo rígido.

A continuación, se puede construir un modelo helicoidal doble con los parámetros de cuerpo rígido que se encuentran en la estructura H-B-B-D-N-A escribiendo el comando adecuado. El archivo bpco step par se puede editar para generar una estructura modificada. Aquí, se modifican los ángulos de balanceo extremos formados en los dos sitios de mayor flexión.

A continuación, la estructura se construye con el conjunto modificado de parámetros de paso como archivo de entrada. Los dos modelos se pueden ver con un visor molecular estándar en contraste con el análisis de una estructura que contiene un solo ácido nucleico. Esta parte del video mostrará cómo analizar un gran conjunto de estructuras en un conjunto de archivos, comenzando con los nombres MD underguion set one PDB y terminando con un número.

El primer paso en el análisis es la identificación de las bases emparejadas obtenidas ejecutando el programa find pair como antes, dado que todo el conjunto de estructuras comparte el mismo esquema de emparejamiento de bases, es necesario ejecutar find pair una vez en un archivo representativo aquí, el archivo termina en 1001. Esto genera la información de emparejamiento base y la almacena en el archivo MD en el conjunto uno BPS PS. El siguiente paso encuentra los parámetros geométricos de todo el conjunto de estructuras utilizando el conjunto ncore de Command X 3D. Analizar. A continuación, los parámetros de cuerpo rígido deseados se pueden extraer del archivo de salida de resumen MD en el primer ajuste.

Esto se realiza utilizando el comando X tres extractos de conjunto DCO. Se extraen los ángulos de balanceo y se crea un archivo de texto separado por comas de los ángulos de balanceo. Este archivo se puede leer en otros programas para su posterior análisis y trazado.

La versión más reciente de 3D NA tiene una nueva característica que permite al usuario ver múltiples estructuras desde una perspectiva común. El comando X three DCO ensemble reorient superpone una colección de estructuras relacionadas en un par de bases común o un paso de par de bases, como en los protocolos anteriores. El primer paso es calcular el apareamiento de bases del ADN con el programa de búsqueda de pares.

En este caso, el archivo de entrada es dos KEK pdb el archivo que contiene las 10 estructuras de la CIA coli, O 3D NA operador unido a la pieza principal de la proteína represora LAC. La reorientación del conjunto Command X three DCO alineará los modelos individuales en una estructura multimodelo en un marco de referencia común. Este comando requiere tanto el archivo PDB como el archivo de emparejamiento base del paso anterior como entrada.

También se incluye en el comando la identidad del paso del par de bases con el que se alinean todas las estructuras. La interfaz web de W 3D NA incluye algunas características populares del paquete de software 3D NA. Esta parte del video llama la atención sobre la capacidad de construir modelos tridimensionales de ADN decorado con proteínas con el servidor web.

El primer paso para construir un modelo de ADN decorado con proteínas es visitar el sitio web de W 3D NA ubicado en W three d.rutgers.edu. La selección de la reconstrucción en el menú en la parte superior izquierda de la página activa las capacidades de construcción de modelos en línea. El siguiente paso es seleccionar el enlace de la plantilla de ADN de proteína unida que se encuentra en el cuadro ligeramente sombreado en el centro de la nueva página.

Esta selección activará un menú desplegable, que permite al usuario especificar el número de proteínas unidas. La selección del número de proteínas unidas conduce a una nueva página de especificación. A continuación, el usuario puede escribir o pegar en la secuencia deseada.

En el cuadro de texto, en el centro de la nueva página, hay un menú desplegable debajo del cuadro de texto para seleccionar la confirmación helicoidal de las regiones no unidas del ADN. Hay un cuadro de texto cerca de la parte inferior de la página de especificaciones para introducir las posiciones de unión y los nombres de archivo de las proteínas unidas. La posición de unión especifica la ubicación del centro del fragmento unido a la proteína en la secuencia de ADN.

En la parte inferior de la página de especificaciones, hay un cuadro que permite al usuario generar una vista previa del ADN unido a proteínas. En este caso, se marca esa casilla y se hace clic en el botón continuar. Esta acción genera una página de revisión en la que se enumeran los parámetros seleccionados, así como los errores que puedan haber surgido de la superposición de los sitios de enlace seleccionados.

El usuario puede seleccionar el botón Atrás si es necesario realizar algún cambio, o el botón de compilación para continuar. La página siguiente muestra una imagen estática del complejo de proteínas de ADN en su disposición más extendida y permite la visualización interactiva en línea a través de la web. El usuario también puede descargar un archivo que contiene coordenadas atómicas.

Las herramientas de software 3D NA se utilizan de forma rutinaria para analizar estructuras de ácidos nucleicos. Los valores de los parámetros del cuerpo rígido revelan distorsiones en la estructura tridimensional, como los dos sitios de flexión extrema del ADN en la ranura principal con grandes ángulos de balanceo positivos que se encuentran en los pasos 13 y 22. En el complejo cristalino del ADN con la Borrelia Bergdorf, proteína RHBB.

La capacidad del software para reconstruir estructuras a partir de estas cantidades permite determinar cómo los pasos de bases individuales y pares de bases contribuyen al pliegue molecular general. Como se ilustra aquí, la flexión global del ADN inducida por el HBB refleja algo más que las dos distorsiones extremas del papel señaladas anteriormente. El ADN permanece muy curvado cuando se reconstruye con estos pasos de pares de bases enderezados.

Es entonces cuando los dos valores más grandes del rol se han establecido en cero. La nueva capacidad de NA 3D para examinar un gran número de estructuras relacionadas permite extraer patrones dependientes de la secuencia y del tiempo en las disposiciones espaciales de las moléculas de ADN y ARN simuladas. Por ejemplo, el recubrimiento de color amarillo de los ángulos de balanceo entre pares de bases sucesivos en dos grandes conjuntos de estructuras de ADN simuladas revela la flexión preferencial de estas moléculas en los pasos del par de bases de purina del Pérmico.

Los valores más altos de balanceo representados en rojo que persisten durante cortos períodos en los extremos del ADN sugieren un derretimiento localizado y un rearrodillamiento de la estructura de doble hélice. Los patrones variacionales de otros parámetros del cuerpo rígido, como los ángulos y las distancias entre bases complementarias, pueden ayudar a descifrar las distorsiones estructurales precisas. La capacidad del software 3D NA para reorientar moléculas relacionadas en un marco de referencia común revela características de la estructura general ocultas en muchos de los archivos almacenados en el banco de datos de proteínas.

Por ejemplo, la alineación convencional de estructuras relacionadas sobre la base de un ajuste cuadrático medio de los átomos correspondientes produce una serie de vías espaciales similares que se superponen aproximadamente entre sí aquí, los modelos basados en 10 RMN de la Esia coli, O operador 3D NA unido a las piezas principales de la proteína represora LAC, La superposición de las mismas estructuras en un marco de coordenadas común en el par de bases terminales principales de cada dúplex revela distorsiones considerables de la estructura global en la que las moléculas se flexionan en direcciones apreciablemente diferentes. La variabilidad estructural puede influir en la facilidad con la que la proteína represora de CIA coli LAC se une a O tres e induce un bucle entre O tres y operadores secuencialmente distantes en la operación de LAC. Como se ilustra aquí, la ubicación precisa de una proteína arquitectónica como el HBB de Borrelia burgdorferi puede tener un efecto dramático en el plegamiento general del ADN.

Si dos copias de la estructura de alta resolución conocida están separadas por 43 pares de bases, un par de 81 bases, el fragmento de ADN se cierra en una configuración apretada, casi circular. Si las dos proteínas están separadas por cinco pares de bases adicionales, el ADN sigue un camino serpenteante abierto. Las muy diferentes disposiciones del dúplex decorado con proteínas muestran cómo el espaciamiento de las proteínas arquitectónicas puede afectar la ciclación o el bucle del ADN después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural de los ácidos nucleicos exploraran las interacciones entre el ADN y las proteínas, el ARN, el plegamiento y el diseño de nanopartículas con el fin de comprender mejor los defectos del desarrollo y enfermedades como el cáncer y diseñar nuevas terapias.