Name: Aislamiento de fibroblastos normales y el cáncer asociado-de los tejidos frescos por Clasificación células activadas por fluorescencia (FACS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a aislar fibroblastos normales y asociados al cáncer de tejidos frescos mediante FACS utilizando PDGFRα como marcador de superficie. Este método garantiza alta pureza y preserva el perfil de expresión génica celular.

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Agradecemos al Dr. Itzjak Oschry y el Dr. Orit Sagi-Asif, por su ayuda con la clasificación de FACS. Esta investigación fue apoyada por las subvenciones a NE del Programa Europeo sobre el Séptimo Programa Marco de la Unión (FP7/2007-2013) en el marco del acuerdo de subvención n º [276890], de la Asociación de Cáncer de Israel (# 20110078), y de la Israel Cancer Research Fund (Investigación Career Development Award).

1. La disección del tejido mamario o la piel de ratones <ol><li> Antes de diseccionar el tejido deseado de los ratones, preparar los siguientes materiales y reactivos: Suministros: <ul><li> Herramientas de cirugía (lavado con detergente y después se sumergieron en 70% de etanol). </li><li> Superficie de espuma de poliestireno para descansar el ratón durante la disección. </li><li> Alfileres o agujas para sujetar ratones durante la disección. </li><li> Tarro de cristal con tapa para la digestión, que contiene una barra de agitación magnética (autoclave). </li><li> Baño de agua a 37 ° C, que contiene un agitador magnético sumergible y agua suficiente para sumergir el frasco de digestión, mientras descansa sobre la placa de agitación. </li></ul> Reactivos: <ul><li> Tampón FACS I: (4 ° C): Fosfato de Dulbecco salina tamponada con CMF (magnesio calcio libre) + 0,5% de BSA </li><li> Solución de colagenasa (hecha inmediatamente antes de su uso): 0,05 g de colagenasa II 0,05 g de colagenasa IV 0,01 g Deoxyribonucarrendar 20 ml tampón FACS I. Mantener la solución de colagenasa en hielo hasta su uso. </li><li> PharmLyse (Cloruro de Amonio Reactivo de Lisis). </li><li> Tampón FACS II: Fosfato de Dulbecco salina tamponada con CMF + 1% de FCS. </li></ul></li><li> La disección de las glándulas mamarias (véase también 17). <ul><li> Eutanasiar ratones hembras que utilizan dióxido de carbono (CO 2) inhalación. </li><li> En una superficie de espuma de poliestireno, coloque el ratón sobre la espalda y el pin con firmeza los cuatro miembros que utilizan agujas de calibre 25 (Figura 1A). Pulverizar el ratón generosamente con 70% de etanol. </li><li> Con unas pinzas, tire hacia arriba de la piel abdominal en la línea media y hacer una pequeña incisión con tijeras afiladas. </li><li> A partir de la incisión, corte la piel hasta el cuello del animal mientras que evita la perforación de las cavidades abdominales o torácicas. </li><li> Cortar la piel de las patas traseras de la incisión de línea media hacia la pierna, lo que resulta en una &quot;forma de Y&quot;. </li><li> Tire de la piel lejos del mouse cuerpo y fijar abajo, exponiendo las glándulas mamarias unidos a la parte inferior de la piel (Figura 1B). </li><li> Utilizar Q-consejos para separar suavemente las glándulas mamarias de la piel durante el corte del tejido conjuntivo, con pequeñas tijeras afiladas para separar la glándula mamaria hacia la espina dorsal del ratón. </li><li> Las glándulas abdominales (# 4, 5) son los mejores para este protocolo. También puede utilizar la glándula mamaria 2 º, pero hay que tener en cuenta que estas glándulas están anatómicamente situado en las proximidades del músculo pectoral que pueden ser difíciles de separar, lo que resulta en células de origen del tejido mixto. </li><li> Nota: Cuando la disección de tejido tumoral, se recomienda eliminar regiones necróticas. </li></ul></li><li> La disección de tejido de la piel: La forma más fácil de obtener tejido de la piel, sin tener que lidiar con la eliminación del vello es usar orejas de ratón. Si una mayor cantidad de tejido es necesario, puede afeitarse el pelo de ratón torso y diseccionar la piel. <ul><li> Eutanasiar ratones ucantar inhalación de CO 2. </li><li> Usando unas tijeras afiladas, corte ambos oídos y el lugar inmediatamente en el tarro de digestión que contiene un volumen pequeño (~ 0,5 ml) de PBS en hielo. </li></ul></li></ol> 2. Preparación de la glándula mamaria / piel suspensión de células individuales <ul><li> Coloque glándulas mamarias / piel en el tarro de digestión que contiene un pequeño volumen de PBS en hielo. Si el tejido es lavado con sangre x2 con PBS, y luego descartar el exceso de PBS. </li><li> Pique a fondo con tijeras curvas. </li><li> Añadir (nota: esta cantidad de solución de colagenasa de manera eficiente se disocian aproximadamente 5 g de tejido mamario o del tumor y las orejas de un máximo de 15 ratones) 20 ml de solución de colagenasa. </li><li> Coloque inmediatamente en una placa de agitación a 37 ° C baño de agua, y se incuba durante 15 minutos mientras se agitaba a velocidad media. </li></ul> Nota: Los tiempos óptimos de incubación puede variar si la digestión de otros tejidos. <ul><li> Para detener la reacción, agregar 30 ml de DMEM frío + 10% FCS. </li><li> Filtrar la mezcla de tejido / medios de comunicación a través de un filtro de 70 micras celda colocada en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Centrifugar el tubo cónico durante 5 min a 450 xg, a 4 ° C. </li></ul> 3. Lisis de los glóbulos rojos Nota: este paso no es necesario si los ratones eran de corazón perfundido con PBS antes de ser sacrificado. <ul><li> Aspirar el sobrenadante utilizando una pipeta de vidrio unido a vacío, sin alterar el sedimento celular. </li><li> Para lisar RBC, se resuspende el sedimento celular en 10 ml de solución PharmLyse e incubar durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Neutralizar la solución PharmLyse añadiendo aproximadamente 40 ml de tampón FACS I. </li><li> Girar el tubo cónico con las células durante 5 min a 450 xg, a 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante </li></ul> 4. El bloqueo de Fc Endógeno <ul><li> Opcional: contar las células para determinar el volumen adecuado para la siguiente steps. </li><li> Resuspender las células en 1.3 ml de tampón FACS I (según el número de células y la cantidad de anticuerpos que desea utilizar). </li><li> Añadir FcBlock (anti-ratón CD16/CD32) para alcanzar una dilución 1:50 (10 mg / ml), e incubar en hielo durante 10-20 &#39;. No hay necesidad de lavar FcBlock. </li></ul> 5. La tinción <ul><li> Sacar 100 ml de alícuotas a tubos eppendorf que se utilizó como control un-manchado y controles individuales de color (de acuerdo con el número de anticuerpos fluorescentes utilizados). </li><li> Para fibroblastos etiqueta: añadir anti-PDGFR (directamente conjugado con fluoróforo) a una dilución de 1:50 (10 mg / ml). </li><li> Para etiquetar las otras poblaciones de células (por ejemplo células del sistema inmune, macrófagos, células endoteliales, etc): añadir apropiados anticuerpos conjugados con fluorescencia para marcadores de superficie, a una dilución de 1:50. </li></ul> Nota: aunque PDGFR es un marcador robusto para los fibroblastos, se recomienda incluir anticuerpos para icélulas mmune y de células epiteliales con el fin de excluir cualquier poblaciones positivas dobles y por lo tanto mejorar la pureza de los fibroblastos aislados. <ul><li> Añadir 2 l de cada anticuerpo para cada uno de los individuales de control de color tubos eppendorf. </li><li> Se incuban las células con anticuerpos de 1 hora en hielo en la oscuridad. </li><li> Para lavar: llenar los tubos con tampón FACS I y girar durante 5 minutos a 450 xga 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante, resuspender las células en tampón FACS I a una concentración de aproximadamente 2 x 10 6 células / ml, o cualquier concentración más adecuada para la clasificación con su clasificador FACS disponible. </li></ul> Opcional: Las células pueden ser resuspendidas en tampón FACS II para la duración de la clasificación. Esto puede mejorar la viabilidad celular. Sin embargo, la exposición a factores en suero pueden tener una expresión génica efecto, que debe ser probado, y tenerse en cuenta. <ul><li> Transfiera las células marcadas en tubos FACS con filtro superior: filtros de células en los tubos paraevitar los agregados celulares. </li><li> Para excluir las células muertas, añadir 7AAD (0,5 g / ml) o yoduro de propidio (PI) para muestras (excepto para el control sin manchas). </li></ul> Nota: Para evitar la pérdida de las células, usted puede agregar 7AAD/PI a la muestra sin manchas después de grabar en el FACS, y utilizar de nuevo como 7AAD de sólo control. <ul><li> Mantener las muestras en hielo durante el análisis. </li></ul> 6. Aislamiento de células por FACS (Nota: esta parte del protocolo requiere conocimientos previos en el funcionamiento de un clasificador FACS, por ejemplo, BD FACS AriaII, o la ayuda de un técnico especializado). <ul><li> Utilizando el software clasificador FACS (BD FACSDiva), preparar parcelas de análisis adecuados para analizar dispersión frontal (FSC), dispersión lateral (SSC), 7AAD, FITC, PE y cualquier otro fluoróforo utilizado para marcar células (Figura 2). </li><li> Antes de cargar cada muestra para el clasificador de células, vórtice brevemente para resuspender las células. </li><li> Comience por analiING la muestra sin manchar con el fin de establecer la activación periódica de la población total de células, a la puerta de salida restos de células, y para determinar la autofluorescencia o la tinción de fondo. </li><li> Analizar la muestra sin teñir + 7AAD para determinar y puerta de la población de células vivas de la población celular total. </li><li> Analizar cada control de un solo color para determinar y calibrar los parámetros tales como la compensación. </li><li> Analizar la muestra teñida para definir la posición de las puertas para la clasificación. </li><li> Una vez que los parámetros y las puertas para las poblaciones de células deseadas se han establecido, empezar a clasificar las poblaciones celulares marcadas en tubos eppendorf o tubos de 15 ml cónicos que contienen medio de cultivo o tampón de lisis de ARN (por ejemplo, tampón RLT o Trizol). </li></ul> Nota: Si la clasificación de un gran número de células, no se recomienda para ordenar directamente en tampón de lisis de ARN, como el gran volumen de fluido de vaina que acompaña a las células, se diluirá el tampón de lisis y reducen el rendimiento. <ul><li> Spin celdas hacia abajo inmediatamente después de su clasificación ha terminado, y la transferencia a un medio fresco o tampón de lisis de ARN, dependiendo del propósito de su experimento. </li><li> Si la clasificación con el fin de cultivar células aisladas, realice clase estéril. Para una mejor recuperación de las células, el uso de rojo fenol libre de DMEM + 5% de FCS en lugar de tampón FACS II y recoger las células en medio de cultivo con FCS al 20%. </li><li> Si el cultivo de fibroblastos ordenados, alwaysplate en placas recubiertas de colágeno y nunca directamente sobre plástico, ya que resulta en la activación de fibroblastos que producen cambios en su expresión génica. </li></ul>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Mientras que los experimentos realizados en cultivo de tejidos puede ser informativo y sugieren principios funcionales que se pueden verificar in vivo, se sabe que ocurren grandes cambios en la expresión génica de las células en cultivo 11,12. Con el fin de evitar una etapa de cultivo de tejidos cuando el perfil de expresión de genes en fibroblastos, hemos desarrollado un protocolo que permite el aislamiento de normales, así como los asociados al cáncer de fibroblastos de ratón fresco o tejido humano...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nombre del reactivo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Comentarios (opcional)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 41965</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS</td&gt;<td&gt; Industrias Biológicas</td&gt;<td&gt; 02-023-1A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Colagenasa II</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS4176</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; La colagenasa IV</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS4188</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Desoxirribonucleasa</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS2007</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PharmLyse</td&gt;<td&gt; BD</td&gt;<td&gt; 555899</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cell filtro de 70 micras</td&gt;<td&gt; SPL</td&gt;<td&gt; 93070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Purificado anti-ratón CD16/CD32</td&gt;<td&gt; BD Pharmingen</td&gt;<td&gt; 553142</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; A través de la sonda (7AAD)</td&gt;<td&gt; E-Bioscience</td&gt;<td&gt; 00-6993-50</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-ratón CD140a-PE (PDGFRA)</td&gt;<td&gt; E-Bioscience</td&gt;<td&gt; 12-1401-81</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-ratón FITC F4/80-</td&gt;<td&gt; Cederlane</td&gt;<td&gt; CL8940F</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM w / o rojo fenol</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 31053</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Colágeno tipo I</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 354236</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

aislamiento de fibroblastos normales y el cáncer asociado-de los tejidos frescos por clasificación células activadas por fluorescencia (facs)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Asociados con el cáncer fibroblastos (CAF) son el tipo celular más importante en el estroma tumoral de muchos tipos de cáncer, en particular, carcinoma de mama, y su presencia prominente menudo está asociada con mal pronóstico 1,2. CAFs son una subpoblación de fibroblastos estromales activados, muchas de las cuales expresan el marcador de miofibroblastos α-SMA 3. CAF se originan a partir de los fibroblastos del tejido local, así como de derivados de médula ósea células reclutadas en el tumor en desarrollo y adoptar un fenotipo CAF bajo la influencia del microambiente del tumor 4. CAF se muestra para facilitar la iniciación del crecimiento del tumor y la progresión a través de señalización que promueve la proliferación de células tumorales, angiogénesis, invasión y 5-8. Hemos demostrado que la CAF estimular el crecimiento tumoral mediante la mediación de tumor que promueven la inflamación, a partir de las primeras etapas de pre-neoplásicas 9. A pesar de la creciente evidencia de las CAF papel clave que desempeñar para facilitar el crecimiento del tumor,CAF estudian ha sido un reto en curso debido a la falta de marcadores específicos de CAF y la gran heterogeneidad de estas células, con muchos subtipos co-existentes en el microambiente tumoral 10. Además, el estudio de fibroblastos in vitro se ve obstaculizada por el hecho de que su perfil de expresión de genes a menudo se altera en cultivo de tejidos 11,12. Para abordar este problema y para permitir la expresión de genes de perfiles imparcial de fibroblastos de ratón fresco y tejidos humanos, hemos desarrollado un método basado en los protocolos anteriores para la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) 13,14. Nuestro enfoque se basa en la utilización de PDGFR como un marcador de superficie para aislar fibroblastos de ratón fresco y el tejido humano. PDGFR se expresa abundantemente por ambos fibroblastos normales y cafés 9,15. Este método permite el aislamiento de poblaciones puras de fibroblastos normales y cafés, incluyendo, pero no limitado a α-SMA + activado miofibroblastos. Fibroblastos aislados pueden entonces serutilizado para la caracterización y la comparación de la evolución de la expresión génica que se produce en los CAF durante la tumorigénesis. De hecho, nosotros y otros informaron de perfiles de expresión de los fibroblastos aislados por clasificación celular 16. Este protocolo se realizó con éxito para aislar y crear un perfil poblaciones altamente enriquecidas de fibroblastos de tejidos de piel, páncreas mamaria, y pulmón. Además, este método también permite el cultivo de células clasificadas, con el fin de realizar los experimentos funcionales y para evitar la contaminación por las células tumorales, lo cual es a menudo un gran obstáculo cuando se trata de los CAF de cultivo.

Uso de PDGFR como un marcador para los resultados de fibroblastos en el aislamiento de poblaciones altamente enriquecidas de los fibroblastos del tejido. El nivel de pureza después de la clasificación fue del 99%, cuantificada por análisis post-especie (Figura 2A). Estimando el porcentaje de contaminación de las células de fibroblastos no por la expresión relativa de los genes de control específicos de la célula (Figura 2B) muestra típicamente 0.1-0.6% de contaminación. Este nivel de pu...

Cáncer de fibroblastos asociados (CAF) facilitar la iniciación del crecimiento del tumor y la progresión a través de señalización que promueve la proliferación, la angiogénesis y la inflamación. Aquí se describe un método para aislar poblaciones puras de los fibroblastos normales y CAFS de ratón fresco y tejidos humanos por clasificación de células, usando PDGFR como un marcador de superficie.

Aislamiento de fibroblastos normales y el cáncer asociado-de los tejidos frescos por Clasificación células activadas por fluorescencia (FACS)

Los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) son el tipo celular más prominente dentro del estroma tumoral de muchos cánceres, en particular del carcinoma de mama, y su...

El objetivo de este procedimiento es aislar fibroblastos asociados a tejidos normales y tumorales a partir de tejidos frescos. Esto se logra primero mediante la disección de las glándulas mamarias. El segundo paso consiste en preparar las glándulas mamarias, suspensiones de células individuales, seguido del etiquetado celular con anticuerpos específicos para fibroblastos, así como con anticuerpos específicos para otras poblaciones celulares.El paso final consiste en realizar la clasificación de células activada por fluorescencia o FACS. Finalmente, se utiliza el perfilado de expresión mediante Q-R-T-P-C-R de marcadores específicos expresados en las poblaciones celulares clasificadas para evaluar la pureza de dichas poblaciones celulares. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes para el aislamiento de fibroblastos es que permite el aislamiento de la mayoría de los fibroblastos del tejido con una contaminación mínima por células inmunitarias o células epiteliales, evitando al mismo tiempo un paso de cultivo de tejidos que podría alterar el perfil de expresión génica de los fibroblastos.La implicación de esta técnica se extiende a todos los tratamientos contra el cáncer de mama, ya que comprender e identificar dianas moleculares podría proporcionar un enfoque combinatorio novedoso para combatir la progresión del cáncer de mama, prolongar la supervivencia del paciente y, en última instancia, ayudar a mejorar y personalizar opciones terapéuticas individualizadas. Además de usted, solo la Dra. Lena, la encargada del laboratorio, demostrará el procedimiento. Para comenzar este procedimiento, coloque el ratón hembra sacrificado sobre su espalda en una superficie de espuma de poliestireno y utilice agujas de calibre 25 para fijar firmemente las cuatro extremidades.Rocíe al ratón abundantemente con etanol al 70 % utilizando pinzas. Levante la piel abdominal en la línea media y realice una pequeña incisión con tijeras afiladas a partir de esa incisión. Corte la piel hasta el cuello del animal, evitando perforar las cavidades abdominotorácicas.Corte la piel de las patas traseras desde la incisión media hacia la pata, obteniendo una forma de Y. A continuación, tire de la piel alejándola del cuerpo del ratón y sujétela para exponer las glándulas mamarias adheridas a la cara interna de la piel. Una de las cosas más problemáticas en este procedimiento es evitar tomar tejido muscular.Para evitar este problema, tomaré solo la cuarta y quinta glándula mamaria y no la segunda, que se encuentra en proximidad cercana al tejido muscular. Utilice hisopos para separar suavemente la glándula mamaria de la piel mientras corta el tejido conjuntivo con tijeras pequeñas y afiladas para separar la glándula mamaria hacia la columna vertebral del ratón, y elimine cualquier región necrótica que se encuentre. Coloque las glándulas mamarias diseccionadas en PBS sobre hielo.La forma más sencilla de obtener tejido cutáneo sin tener que eliminar el vello es utilizar las orejas de ratón. Utilice tijeras afiladas para cortar ambas orejas del ratón sacrificado. Coloque inmediatamente las orejas en un frasco de digestión que contenga un pequeño volumen de PBS sobre hielo.Para preparar una suspensión de células individuales de glándula mamaria, utilice tijeras curvas para picar completamente las glándulas mamarias en un frasco de digestión que contenga un pequeño volumen de PBS sobre hielo; agregue 20 mililitros de solución de colagenasa al tejido picado. Esta cantidad de solución de colagenasa disociará eficientemente aproximadamente cinco gramos de tejido mamario o tumoral y orejas de hasta 15 ratones. Coloque inmediatamente en una placa agitadora dentro de un baño de agua a 37 grados Celsius e incube durante 15 minutos agitando a velocidad media, deteniendo la reacción con 30 mililitros de DMEM frío más 10% de FCS.A continuación, filtre la mezcla de tejido y medio a través de un filtro celular de 70 micrones colocado encima de un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugue el tubo cónico durante cinco minutos a 450 ×g a cuatro grados Celsius. Si los ratones no fueron perfundidos por el corazón con PBS antes de la eutanasia, los glóbulos rojos en la muestra tendrán que lisarse antes de la tinción inmunológica.Las células deben bloquearse para el FC endógeno antes de etiquetar fibroblastos y otras poblaciones celulares. Resuspenda las células en uno a tres mililitros de tampón fax buffer uno y luego agregue el bloqueador de FC en una dilución de uno a 50; incube en hielo durante 10 a 20 minutos. No es necesario lavar el bloqueador de FC; transfiera alícuotas de 100 microlitros de células a tubos eppendorf para usarlos como control sin tinción y controles de un solo color.Dependiendo del número de anticuerpos fluorescentes utilizados en esta demostración, se emplearán dos anticuerpos fluorescentes para marcar los fibroblastos con anticuerpo anti receptor de PDGF alfa. Esto se conjuga directamente a un fluoróforo en una dilución de uno a 50 en la muestra a clasificar, así como en los controles de un solo color, para marcar otras poblaciones celulares. Añada los anticuerpos conjugados fluorescentemente apropiados a los marcadores de superficie también en una dilución de uno a 50.Añada también anticuerpos a los tubos de control de color único apropiados, incluyendo anticuerpos para células inmunitarias y células epiteliales, lo cual se recomienda para excluir cualquier población doblemente positiva y así aumentar la pureza de los fibroblastos aislados. A continuación, incube las células con los anticuerpos durante una hora en hielo y a oscuras; transcurrida una hora, lave las células llenando los tubos con tampón fax uno y centrifugando durante cinco minutos a 450 ×g a cuatro grados Celsius, aspire el sobrenadante y resuspenda las células en tampón fax uno hasta una concentración adecuada para la clasificación con el clasificador fax que se vaya a utilizar. Transfiera las células marcadas a tubos fax con tapas filtrantes y filtre las células dentro de los tubos para evitar agregados o grumos celulares y excluir células muertas.Un DPI para todas las muestras, excepto para el control sin tinción. Mantenga las muestras en hielo durante el análisis por citometría. Para comenzar este procedimiento, utilice el software del citómetro para preparar la configuración de fluorescencia, la configuración de adquisición y la configuración hidrodinámica de gotas.Vortexee brevemente cada muestra para resuspender las células antes de cargarlas en el citómetro de clasificación. Comience analizando la muestra sin teñir para establecer la selección de la población total de células, con el fin de excluir los restos celulares, y para determinar la autofluorescencia o la tinción de fondo. A continuación, analice la muestra sin teñir más DPI para determinar y seleccionar la población de células viables a partir de la población total de células.Analice cada control de color individual para determinar y calibrar parámetros como la compensación. Analice la muestra teñida para definir la posición de las compuertas para el ordenamiento. Una vez que se hayan establecido los parámetros y compuertas para las poblaciones celulares deseadas, comience a separar las poblaciones celulares marcadas en tubos eppendorf o tubos cónicos de 15 mililitros que contengan medio de cultivo o tampón de lisis de ARN.Inmediatamente después de finalizar la clasificación, centrifugar las células y transferirlas a medio fresco o a tampón de lisis de ARN. Dependiendo del propósito del experimento, si los fibroblastos clasificados deben cultivarse, sembrarlos siempre en placas recubiertas con colágeno, nunca directamente sobre plástico, ya que esto provocaría la activación de los fibroblastos, lo que conlleva cambios en su expresión génica. Utilizar el receptor alfa de PDGF como marcador para los fibroblastos permite obtener poblaciones altamente enriquecidas de fibroblastos tisulares.En este ejemplo, suspensiones de células individuales de glándulas mamarias de ratón se tiñeron con anticuerpos contra el receptor alfa de PDGF y F cuatro 80. El gráfico de clasificación se muestra en el panel izquierdo, donde P dos es la puerta para fibroblastos y P cuatro es la puerta para macrófagos. Se realizó un análisis posterior a la clasificación para determinar la pureza de los fibroblastos clasificados, mostrada en el panel derecho, y de los macrófagos, mostrados en el panel central.Esta figura siguiente muestra un análisis de la pureza del origen mediante Q-R-T-P-C-R de genes de control específicos de células para fibroblastos, células inmunitarias y células epiteliales. Los resultados se normalizaron a dos genes de control, ga, DH y mgus, y a la expresión relativa respecto a gap. DH se muestra que estos análisis típicamente revelan una contaminación del 0,1 al 0,6 %.Este nivel de pureza permite un perfilado de transcriptoma de alta calidad de fibroblastos aislados. La cuantificación de la expresión del receptor alfa de PDGF en una población no clasificada de fibroblastos mamarios indica que aproximadamente el 85 % de los fibroblastos tisulares totales en las glándulas mamarias son positivos para el receptor alfa de PDGF. Lo aislé.Los fibroblastos pueden cultivarse directamente después de la clasificación, pero pueden requerir unos días para recuperarse. Es esencial realizar todos los experimentos posteriores con células de bajo pase, ya que los fibroblastos primarios entran en senescencia durante la propagación. En cultivo, una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuatro horas si se lleva a cabo adecuadamente.Si las células divididas en tres partes están destinadas a ser cultivadas, es importante recordar realizar todo el procedimiento bajo condiciones estériles. En este experimento, no realizamos una clasificación estéril. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar una población altamente enriquecida de fibroblastos a partir de tejido fresco.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El objetivo de este protocolo es aislar las células endoteliales que recubren linfáticos malformación linfática buques y prepucios humanos como quistes utilizando células activadas por fluorescencia (FACS). Cultivo celular posterior y la expansión de estas células permite un nuevo nivel de sofisticación experimental para estudios genéticos, proteómicos, funcionales y diferenciación celular.

Aislamiento de células endoteliales linfático humano por Multi-parámetro de clasificación de células activadas por fluorescencia

El comportamiento de los fibroblastos subyace en un espectro de entidades clínicas, pero siguen estando mal caracterizadas, en gran parte debido a su heterogeneidad inherente. La investigación tradicional de fibroblastos se basa en la manipulación in vitro, enmascarando el comportamiento de los fibroblastos in vivo. Describimos un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos de piel de ratón que no requiere cultivo celular.

Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS

Aquí, se presenta un protocolo para aislar y establecer cultivos primarios de fibroblastos/miofibroblastos (MF) a partir de células gástricas, del intestino delgado y de colon congeladas productoras de tejido con un fenotipo MF. Estas células expresan CD90, α-SMA y vimentina. Los MF se pueden utilizar para una variedad de ensayos funcionales, incluida la actividad enzimática y la producción de citocinas.

Aislamiento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de congelados Humanos gastrointestinales Especímenes

Este manuscrito describe un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana. Elude la cultura in vitro que era inevitable con el protocolo de aislamiento de uso común a través de culturas explantes. Los subconjuntos de fibroblastos que emanan son funcionalmente distintos y muestran la expresión génica diferencial y la localización dentro de la dermis.

Aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana mediante la clasificación celular activada por fluorescencia

Presentamos un protocolo para aislar los fibroblastos adultos primarios de una manera fácil, rápida y confiable, realizable por principiantes (por ejemplo, estudiantes). El procedimiento combina la digestión del tejido enzimático y la agitación mecánica con ondas ultrasónicas para obtener fibroblastos primarios. El protocolo se puede adaptar fácilmente a requisitos experimentales específicos (por ejemplo, tejido humano).

Aislamiento de fibroblastos para adultos primarios aumentados por ultrasonidos

La obtención de una población pura de fibroblastos es crucial para estudiar su papel en la reparación de heridas y fibrosis. Aquí se describe un método detallado para aislar fibroblastos y miofibroblastos de corazones de ratón no lesionados y lesionados seguidos de la caracterización de su pureza y funcionalidad por inmunofluorescencia, RTPCR, clasificación celular asistida por fluorescencia, y contracción del gel de colágeno.

Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos

Este artículo tiene como objetivo proporcionar un protocolo para el aislamiento y cultivo de fibroblastos asociados al cáncer primario a partir de un modelo murino singénico de cáncer de mama triple negativo y su aplicación para el estudio preclínico de nuevas nanopartículas diseñadas para dirigirse al microambiente tumoral.

Aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer primario a partir de un modelo murino singénico de cáncer de mama para el estudio de nanopartículas dirigidas

La identificación precisa de las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) y las células madre musculares (MuSC) es fundamental para estudiar su función biológica en condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo proporciona pautas para el aislamiento, purificación y cultivo de FAP y MuSC de músculos de ratones adultos.

FACS-aislamiento y cultivo de progenitores fibroadipogénicos y células madre musculares a partir de músculo esquelético de ratón imperturbable y lesionado

Se prepararon esferoides tumorales 3D multicelulares con células de adenocarcinoma de pulmón, fibroblastos y monocitos, seguidos del aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) de estos esferoides. Los CAF aislados se compararon con fibroblastos normales para evaluar la salud mitocondrial mediante el estudio del potencial transmembrana mitocondrial, las especies reactivas de oxígeno y las actividades enzimáticas.

Evaluación de la salud mitocondrial en fibroblastos asociados al cáncer aislados de esferoides tumorales de pulmón multicelulares 3D

Este protocolo proporciona un procedimiento integral para aislar, expandir e inmortalizar fibroblastos de prostatectomías radicales. Además, describe ensayos desarrollados para evaluar los efectos funcionales de la diafonía fibroblasto-células tumorales, aprovechando tanto el tratamiento con medio condicionado como el cocultivo.

Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos asociados al cáncer de próstata

Aprenda a aislar fibroblastos normales y asociados al cáncer de tejidos frescos mediante FACS utilizando PDGFRα como marcador de superficie. Este método garantiza alta pureza y preserva el perfil de expresión génica celular.

Aislamiento de fibroblastos normales y el cáncer asociado-de los tejidos frescos por Clasificación células activadas por fluorescencia (FACS) (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de fibroblastos normales y el cáncer asociado-de los tejidos frescos por Clasificación células activadas por fluorescencia (FACS)

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