Aislamiento de fibroblastos normales y el cáncer asociado-de los tejidos frescos por Clasificación células activadas por fluorescencia (FACS)

El objetivo de este procedimiento es aislar fibroblastos normales y asociados al cáncer de los tejidos frescos. Esto se logra diseccionando primero las glándulas mamarias. El segundo paso es la preparación de glándulas mamarias, suspensiones unicelulares, células siguientes sostenidas con anticuerpos específicos de fibroblastos, así como anticuerpos específicos para otras poblaciones celulares.

El paso final es realizar la obtención de células activadas por fluorescencia o hechos. En última instancia, el perfil de expresión Q-R-T-P-C-R de marcadores específicos expresados en las poblaciones celulares clasificadas se utiliza para evaluar la pureza de las poblaciones celulares clasificadas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes para el aislamiento de fibroblastos es que permite el aislamiento de la mayoría de los fibroblastos tisulares con una contaminación mínima por células inmunitarias o células epiteliales, evitando al mismo tiempo una etapa de cultivo de tejidos que puede cambiar el perfil de expresión génica de los fibroblastos.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a todas las terapias contra el cáncer de mama, ya que la comprensión y la identificación de objetivos moleculares pueden proporcionar un enfoque novedoso para combatir la progresión del cáncer de mama, prolongar la supervivencia de las pacientes y, en última instancia, ayudar a mejorar y adaptar las opciones terapéuticas individualizadas. Además de su ojo, solo la Dra. Lena, el gerente del laboratorio le demostrará el procedimiento para comenzar este procedimiento. Coloque al ratón hembra sacrificado boca arriba sobre una superficie de espuma de poliestireno y use agujas de calibre 25 para sujetar firmemente las cuatro extremidades.

Rocíe generosamente el ratón con etanol al 70% con pinzas. Levante la piel abdominal en la línea media y haga una pequeña incisión con tijeras afiladas comenzando desde la incisión. Cortar la piel hasta el cuello del animal evitando perforar las cavidades torácicas abdominales.

Corta la piel de las patas traseras desde la incisión de la línea media hacia la pierna, lo que da como resultado una forma de Y. A continuación, separe la piel del cuerpo del ratón y sujete con alfileres exponiendo las glándulas mamarias unidas a la parte inferior de la piel. Una de las cosas más problemáticas de este procedimiento es evitar tomar tejido muscular.

Para evitar este problema, tomaré solo la cuarta y quinta glándula mamaria y no la segunda, que está muy cerca del tejido muscular. Use hisopos para separar suavemente la glándula de la memoria de la piel mientras corta el tejido conjuntivo con tijeras pequeñas y afiladas para separar la glándula de la memoria hacia la columna vertebral del ratón, elimine cualquier región necrótica que se encuentre. Coloque las glándulas de memoria disecadas en PBS sobre hielo.

La forma más fácil de obtener tejido cutáneo sin tener que lidiar con la depilación es usar orejas de ratón. Use unas tijeras afiladas para cortar ambas orejas del ratón sacrificado. Coloque las orejas inmediatamente en un frasco de digestión que contenga un pequeño volumen de PBS en hielo.

Para preparar una suspensión unicelular de glándula mamaria, use tijeras curvas para picar completamente las glándulas mamarias en un frasco de digestión que contiene un pequeño volumen de PBS en hielo, agregue 20 mililitros de solución de colagenasa al tejido picado. Esta cantidad de solución de colagenasa disociará eficientemente aproximadamente cinco gramos de tejido de memoria o tumoral y orejas de hasta 15 ratones. Coloque inmediatamente en una placa de agitación en un baño de agua a 37 grados centígrados e incube durante 15 minutos mientras revuelve a una velocidad media para detener la reacción a 30 mililitros de DMEM frío más 10% de FCS.

A continuación, cuele la mezcla de tejido y medios a través de un colador de células de 70 micras colocado encima de un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar el tubo cónico durante cinco minutos a 450 veces G a cuatro grados centígrados. Si los ratones no fueron perfundidos con PBS antes del sacrificio, los glóbulos rojos de la muestra tendrán que ser mentiras antes de la tinción inmunitaria.

Las células deben ser bloqueadas para la FC endógena antes de marcar los fibroblastos y otras poblaciones celulares. Resus suspenda las células en uno a tres mililitros de tampón de fax uno, y luego agregue el bloque FC en una dilución de uno a 50 incube en hielo durante 10 a 20 minutos. No es necesario lavar las alícuotas de celda de transferencia de bloque FC de 100 microlitros para terminar los tubos de orph que se utilizarán como control sin teñir y controles de un solo color.

Dependiendo del número de anticuerpos fluorescentes utilizados en esta demostración, se utilizarán dos anticuerpos fluorescentes para marcar los fibroblastos en el receptor alfa anti PDGF. Eso se conjuga directamente con un fluor en una dilución de uno a 50 para la muestra de clasificación, así como los controles de color único para etiquetar otras poblaciones de células. Añada los anticuerpos conjugados fluorescentes apropiados a los marcadores de superficie también en una dilución de uno a 50.

Se recomienda añadir anticuerpos también a los tubos de control de un solo color adecuados, incluidos los anticuerpos para las células inmunitarias y las células epiteliales, con el fin de excluir cualquier población doble positiva y así mejorar la pureza de los fibroblastos aislados. A continuación, incubar las células con anticuerpos durante una hora en hielo en la oscuridad después de una hora lavar las células llenando tubos con tampón de fax uno y girando durante cinco minutos a 450 veces G a cuatro grados Celsius, aspirar y doblar las células en el tampón de fax uno hasta una concentración más apropiada para la clasificación con el clasificador de fax que se va a utilizar. Transfiera las células marcadas a tubos de fax con tapas de filtro y filtre las células a los tubos para evitar aglomeraciones de células, grumos para excluir las células muertas.

Un DPI para todas las muestras excepto para el control sin teñir. Mantenga las muestras en hielo durante el análisis por fax. Para comenzar este procedimiento, utilice el software clasificador de hechos para preparar la configuración fluorescente, la configuración de adquisición y la configuración de gota hidrodinámica.

Agite brevemente cada muestra para volver a suspender las células antes de cargarlas en el clasificador de células. Comience por analizar la muestra sin teñir con el fin de establecer la compuerta para la población total de células para bloquear los restos celulares y determinar la autofluorescencia o la tinción de fondo. A continuación, analice la muestra sin tinción más DPI para determinar y diferenciar la población de células vivas de la población total de células.

Analice cada uno de los controles de color para determinar y calibrar parámetros como la compensación. Analice la muestra de tinción para definir la posición de las compuertas para la clasificación. Una vez que se hayan establecido los parámetros y las puertas para las poblaciones celulares deseadas, comience a clasificar las poblaciones celulares marcadas en tubos eph o tubos cónicos de 15 mililitros que contengan medio de cultivo o tampón de lisis de ARN.

Inmediatamente después de finalizar la clasificación, haga girar las células hacia abajo y transfiéralas a un medio fresco o tampón de lisis de ARN. Dependiendo del propósito de su experimento, si se clasifican, los fibroblastos se van a cultivar, siempre placas sobre placas recubiertas de colágeno, nunca placas directamente sobre plástico, ya que esto resultará en la activación de los fibroblastos que conducirá a cambios en su expresión génica. El uso del receptor alfa de PDGF como marcador de fibroblastos da como resultado poblaciones aisladas y altamente enriquecidas de fibroblastos tisulares.

En este ejemplo, suspensiones unicelulares de glándulas mamarias de ratón se tiñeron con el receptor alfa de PDGF y anticuerpos F 44 80. El gráfico de clasificación de hechos se muestra en el panel izquierdo, donde P dos es la puerta de los fibroblastos y P cuatro es la puerta de los macrófagos. Se realizó un análisis posterior a la fuente para determinar la pureza de los fibroblastos clasificados que se muestran en el panel derecho y los macrófagos que se muestran en el panel central.

La siguiente figura muestra un análisis de la pureza de abastecimiento por Q-R-T-P-C-R de genes de control específicos de células para fibroblastos, células inmunitarias y células epiteliales. Los resultados se normalizaron a dos genes de mantenimiento, ga, DH y mgus, y la expresión relativa a gap. Se muestra DH Dichos análisis suelen mostrar entre un 0,1 y un 0,6% de contaminación.

Este nivel de pureza permite la elaboración de perfiles de transcriptoma de alta calidad de fibroblastos aislados. La cuantificación de la expresión del receptor alfa de PDGF en una población no clasificada de fibroblastos mamarios indica que aproximadamente el 85% de los fibroblastos tisulares totales en las glándulas mamarias son positivos para el receptor alfa de PDGF. Me aislé.

Los fibroblastos se pueden cultivar directamente después de la clasificación, pero pueden requerir unos días para recuperarse. Es esencial realizar todos los experimentos posteriores con células de bajo masaje, ya que los fibroblastos primarios sufren senescencia durante la propagación. En cultivo, una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas si se realiza correctamente.

Si las terceras células están designadas para ser cultivadas, se importa para recordar realizar todo el procedimiento en condiciones estériles. En esta sesión, no realizamos una clasificación estéril. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar una población altamente enriquecida de fibroblastos del tejido fresco.