Aislamiento de células endoteliales linfático humano por Multi-parámetro de clasificación de células activadas por fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células endoteliales linfáticas de alta pureza que recubren los vasos linfáticos de las malformaciones linfáticas humanas y los prepucios mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia. Esto se logra primero mediante la digestión enzimática de una muestra de tejido del paciente. En el segundo paso, la suspensión de una sola célula se cultiva para enriquecer el número de células endoteliales linfáticas.

En la muestra. A continuación, las células se marcan con anticuerpos contra los marcadores de superficie celular de interés y se clasifican mediante la clasificación celular activada por fluorescencia multiparamétrica. En última instancia, la malformación del prepucio y linfática, las células endoteliales linfáticas se pueden expandir en cultivo celular para su posterior análisis.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que la clasificación celular activada por fluorescencia produce células con una pureza superior al 99%, evitando los problemas asociados a la pérdida de células endoteliales linfáticas debido al sobrecrecimiento por células contaminantes. Comience pesando un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de medio, complementado con una solución antibiótica y antimicótica. A continuación, transfiera la malformación linfática o la muestra de cuatro pieles al tubo y vuelva a pesar el tubo para determinar el peso del tejido.

A continuación, en un gabinete de bioseguridad de clase dos, use pinzas estériles para transferir el tejido y el medio a una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros con tijeras estériles. Por último, pica el tejido en trozos de un milímetro cúbico. Luego transfiera las piezas a un tubo de 50 mililitros con 10 mililitros de antibiótico antimicótico fresco. Medio.

Gire el tubo unas cuantas veces para volver a suspender el tejido y luego gire la muestra. Después de eliminar el sobrenadante, agregue un mililitro de solución de digestión precalentada por cada 100 miligramos de tejido picado e incube el tejido en una incubadora a 37 grados centígrados con agitación constante a 200 RPM para un enriquecimiento exitoso de las células endoteliales linfáticas. Es fundamental reconocer cuándo las células han estado suficientemente expuestas a la colagenasa y a la reacción del espacio para que sobrevivan al aislamiento.

Esto se logra a través de un monitoreo cuidadoso del proceso de digestión de los tejidos y deteniendo la reacción cuando la mayoría de los tejidos se han digerido en fragmentos finos. Al final de la incubación, confirme que casi todo el tejido se ha digerido en pequeños fragmentos y filtre la suspensión de tejido a través de un colador de 70 micras en un tubo estéril de 50 mililitros. Ahora use un pistón de jeringa de tres mililitros con émbolo de goma para triturar el tejido restante hasta que solo se observen pequeños rastros de matriz extracelular.

A continuación, lave el filtro de células con un volumen de medio celular endotelial equivalente al volumen del medio enzimático disociante y centrifuga las células. Suspenda el pellet en hasta 20 mililitros de medio de células endoteliales, dependiendo del tamaño de la muestra. Luego, después de contar la semilla, dos veces 10 a las seis células en un matraz de 150 centímetros cuadrados precodificado con fibronectina en un volumen final de 20 mililitros de medio celular endotelial para el cultivo durante la noche.

A la mañana siguiente, lave las células no unidas con tres enjuagues de PBS suplementado con una solución antibiótica y antimicótica. Luego, para expandir el número de células endoteliales linfáticas, agregue medio de células endoteliales frescas a las células e incube el cultivo durante cinco a siete días hasta que el cultivo sea aproximadamente 80% confluente. Para teñir las células para su clasificación mediante clasificación de células activadas por fluorescencia multiparamétrica.

Primero, retire los medios celulares, lave las celdas tres veces en PBS. Luego agregue siete mililitros de solución de desprendimiento después de una incubación de cinco a siete minutos a 37 grados centígrados. Recoja las células disociadas, inactive las enzimas con tres volúmenes de medio celular endotelial y transfiera la suspensión celular a un tubo estéril.

Centrifugar las celdas tres veces lavando el pellet en cinco mililitros de PBS para el segundo y tercer giro después del último lavado. Vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de PBS fresco y cuente el número de células viables por exclusión de azul trian. Siguiendo el conteo de células.

Transfiera asépticamente las células a tubos de tinción de citometría de flujo y centrifuga las células para bloquear la unión inespecífica. Vuelva a suspender las células al 5% F-B-S-P-B-S e incube en hielo durante 20 minutos. Después de bloquear la centrífuga, las células eliminan el sobrenadante y resus.

Suspenda el pellet en CD 34, CD 31 potano y cóctel de anticuerpos del receptor tres del VEGF. Después de 20 minutos en hielo, lave las células tres veces en dos mililitros de F-B-S-P-B-S para eliminar cualquier anticuerpo no unido y resus. Suspender el pellet en 300 microlitros de yoduro de propidio en solución F-B-S-P-B-S sobre hielo.

Finalmente, clasifique las células endoteliales linfáticas humanas purificadas en un instrumento de clasificación de células activadas por fluorescencia multiparamétrica. A continuación, gire las celdas clasificadas y vuelva a suspender los gránulos en el medio adecuado para la siembra de cultivos celulares. Aquí, los vasos linfáticos y de malformación linfática humana normales marcados con anticuerpos contra el desplano de la olla se observan la marcada dilatación y la considerable variación del tamaño de la luz dentro de los vasos de la malformación linfática humana.

De hecho, la mayoría de las malformaciones linfáticas contienen estructuras quísticas anormales pequeñas o microquísticas y grandes o macroquísticas después de la digestión inicial del tejido y 24 horas de cultivo en las muestras no fraccionadas. Se pueden observar distintas colonias de células endoteliales, además de las células similares a los fibroblastos y las células de músculo liso después de la clasificación y otras 24 horas en cultivo celular. Sin embargo, el CD 34, el receptor de VEGF positivo CD 31 bajo, tres planos de podo positivos y células positivas adheridas al contenedor de cultivo exhiben la morfología típica de adoquines observada en estas imágenes.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar con alta pureza la célula endotelial linfática que recubre la malformación linfática humana y los vasos linfáticos de la piel completa mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia. No olvide que trabajar con tejido humano primario puede ser peligroso, ya que puede contener agentes infecciosos nocivos para la salud humana. Siempre se deben tomar precauciones estándar, como el uso de guantes, gafas protectoras y batas de laboratorio, mientras se realiza este procedimiento.