Trans-vivo hipersensibilidad de tipo retardada Ensayo para Antigen Reglamento Específico

El objetivo general de este procedimiento es utilizar el ensayo DTH transvivo para monitorizar las respuestas específicas de antígenos proinflamatorios y antiinflamatorios en sujetos humanos. En primer lugar, aislar las células mononucleares de sangre periférica de la sangre periférica del sujeto humano. Luego mezcle la preparación de PBMC con PBS.

Antígeno de retractación: antígeno de prueba y antígeno de prueba más antígeno de retractación. Proceda con las mediciones preliminares de la almohadilla del pie e inyecte las mezclas preparadas en ratones deslizantes. Las almohadillas para los pies repiten las mediciones 24 horas después. Tres.

Los patrones definitivos de las respuestas DTH son posibles regulatorios, no regulatorios y sensibilizados. El ensayo de hipersensibilidad trans vivo de tipo retardado se puede aplicar para determinar parámetros clínicos como las respuestas de reacción allo donde la fuente de antígeno son las células del donante de trasplante. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos in vitro existentes es que se pueden detectar fácilmente las respuestas proinflamatorias y reguladoras a todos los antígenos, autoantígenos o antígenos tumorales utilizando un solo sistema de ensayo.

Egon, un investigador de mi laboratorio, ahora demostrará el procedimiento utilizando sangre periférica humana fresca recolectada en tubos de citrato ácido dextrosa para evitar la activación de las plaquetas. Aislar PBMC utilizando un medio de separación de linfocitos de acuerdo con los métodos estándar. Lave la preparación de PBMC con PBS para eliminar las plaquetas contaminantes.

Si hay una contaminación notable de glóbulos rojos, realice la lisis de los glóbulos rojos utilizando un tampón de lisis CK. A continuación, realiza dos lavados más con PBS Resus. Suspender la PBMC en PBS a una concentración de 10 millones de PBMC por mililitro para el antígeno alo.

Comience con BMC P, aisladas de la sangre periférica del donante mediante el procedimiento mostrado anteriormente. A continuación, resus. Suspender las células donantes en PBS a una concentración de 120 millones de células por mililitro y añadir un micromolar de PMSF para evitar la degradación de proteínas.

Ahora sonique la suspensión de la celda usando siete pulsos de un segundo con una sonda sónica de dos milímetros. Uso de un hemocímetro. Verifique la interrupción de más del 90% de las celdas.

A continuación, centrifuga la mezcla a 14.000 rpm a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo de dos cerraduras seguras y determine la concentración de proteínas mediante métodos estándar para cada inyección. Alícuota siete por 10 a la sexta P BMC en dos mililitros.

Los tubos de bloqueo seguro granulan las células por centrifugación. Primero, prepare la suspensión de control negativo de PBMC en 35 microlitros de PBS. Luego, para el control positivo, agregue 25 microlitros de un antígeno de retirada, tétanos, toxoide, difteria, toxoide, y ajuste el volumen de inyección a 35 microlitros con PBS.

De acuerdo con el diseño experimental para evaluar la respuesta específica del donante, vuelva a suspender el pellet de células en 10 microlitros de antígeno del donante más 25 microlitros de PBS para un volumen total de 35 microlitros. Para evaluar la regulación experimental específica del antígeno del donante, suspenda el pellet celular en 35 microlitros agregando 10 microlitros de antígeno del donante y 25 microlitros de antígeno TT DT de recuerdo. Después de anestesiar, el ratón deslizante con flúor coloca una pinza accionada por resorte en el centro de una almohadilla para el pie con un borde que toca la última almohadilla para caminar del pie para proporcionar un punto de referencia para mantener el sitio de medición constante cuando la lectura del medidor se ha estabilizado.

Registre el grosor de la almohadilla de base para la inyección de la almohadilla del pie. Coloque la jeringa con la aguja apuntando hacia los dedos y el bisel hacia arriba. Ahora comience las inyecciones subcutáneas de cada suspensión celular en las almohadillas traseras del pie para el mouse.

Número uno, inyecte lentamente la almohadilla del pie derecho con una preparación de control negativo. A continuación, inyecte la almohadilla del pie izquierdo con el control positivo de PBMC más TT dt. Ahora regrese el mouse a su jaula para mouse.

Número dos, inyecte la almohadilla del pie derecho con PBMC más allo antígeno y la almohadilla del pie izquierdo con PBMC más allo antígeno más TT dt. Asegúrese de que no haya fugas alrededor de 18 a 24 horas después de la inyección. Anestesiar a cada ratón con flúor y repetir la medición de la hinchazón de la almohadilla del pie.

Reste el grosor de cada almohadilla para los pies antes de la inyección del valor posterior a la inyección para obtener el valor de hinchazón de las almohadillas para los pies. A continuación, calcule la hinchazón neta específica del antígeno restando el valor de hinchazón de la almohadilla de control de los valores de hinchazón de la almohadilla del pie obtenidos de los tratamientos. Verifique la lectura de control positivo: una respuesta de control positivo al antígeno de recuerdo TT DT de mayor o igual a 25 veces 10 a menos cuatro pulgadas de más.

Se requiere una respuesta en segundo plano a PBS para que la prueba se considere válida. A continuación, determine la inhibición de las respuestas de recuerdo en presencia de antígenos del donante. Este experimento evalúa a los receptores de trasplante renal para determinar la respuesta específica del antígeno del donante y la regulación.

Existen tres patrones principales de hipersensibilidad de tipo tardío en los receptores de trasplantes: regulatorio, no regulatorio y sensibilizado. Todos los pacientes respondieron fuertemente al control positivo del antígeno de recuerdo tt. El paciente número 62 muestra el patrón regulatorio caracterizado por una respuesta débil al antígeno del donante y una marcada supresión ligada a la respuesta del antígeno de recuerdo en presencia del antígeno del donante.

Este es el patrón que se ha encontrado asociado con la tolerancia al aloinjerto de órganos. El paciente número 48 presenta un patrón no regulador, que tiene la característica de una respuesta débil al donante, pero sin supresión relacionada. Este patrón se ha observado con frecuencia en pacientes que toman fármacos inmunosupresores.

El paciente número ocho presenta el patrón de sensibilización al donante, caracterizado por una alta respuesta al antígeno del donante y sin supresión ligada. Esta respuesta se asocia con el rechazo del injerto. En estudios de casos clínicos, se analizaron las BMC P de los sujetos inscritos en un ensayo observacional para determinar la vía indirecta específica del donante, el efector T y las respuestas reguladoras T para evaluar el papel de la regulación específica del donante en la tolerancia clínica.

Las respuestas indirectas de los tectores a los antígenos del donante revelan un espectro distinto en los grupos de inscripción. La hinchazón de la almohadilla del pie aumenta a medida que el estado clínico del paciente pasa de ser tolerante a ser de rechazo crónico. En este caso, el ensayo de supresión enlazada mide la vía indirecta del antidonante de la respuesta reguladora de la T.

Estos datos muestran una disminución de las respuestas regulatorias en el rango de pacientes más tolerantes a los pacientes intermedios a menos tolerantes que rechazan crónicamente. En conjunto. La regulación inmunitaria, medida por el ensayo transvivo DTH parece ser un mecanismo importante para la aceptación del aloinjerto renal.

Un área prometedora es la aplicación del ensayo TDTH en el seguimiento de la autoinmunidad. Nuestro estudio del papel del colágeno tipo cinco en el proceso patológico del síndrome de bronquiolitis OBL reveló que el mayor riesgo relativo de desarrollo de SBO se observó en pacientes con una respuesta positiva al colágeno. Cinco pbmc de receptores de trasplante de pulmón, pero no de controles sanos ni de colágeno.

Síndrome de cuatro pastos buenos reactivos Los pacientes después del trasplante renal fueron frecuentemente reactivos al colágeno cinco. El ensayo TDTH también se puede utilizar para evaluar la reactividad de la pbmc de los pacientes con cáncer a los antígenos específicos del tumor. Por ejemplo, la presencia de células T reguladoras específicas de PAP en pacientes con cáncer de próstata puede limitar la respuesta a la vacunación con antígeno de PAP.

El ensayo TRANSVAAL DTH es una nueva prueba diagnóstica con aplicación clínica en la evaluación de las respuestas inmunitarias mediadas por células en pacientes con cáncer trasplantado y autoinmunes. Es valioso porque no solo es útil para monitorear las respuestas de recuerdo del efector T, sino que también se puede usar para detectar respuestas reguladoras de T porque no se basa en una medición de citocinas particular para detectar células T de efecto o reguladoras. Es muy flexible y ampliamente aplicable.