Trans-vivo hipersensibilidad de tipo retardada Ensayo para Antigen Reglamento Específico

El objetivo general de este procedimiento es utilizar el ensayo de DTH trans vivo para monitorear tanto las respuestas específicas frente a antígenos proinflamatorias como antiinflamatorias en sujetos humanos. Primero, aísle las células mononucleares de la sangre periférica a partir de la sangre periférica del sujeto humano. Luego, mezcle la preparación de PBMC con PBS.

Antígeno de prueba de antígeno de recuerdo y antígeno de prueba más antígeno de recuerdo. Proceda con las mediciones previas en las almohadillas plantares e inyecte las mezclas preparadas en ratones. Repita las mediciones en las almohadillas plantares 24 horas después. Tres.

Los patrones definitivos de respuestas de HRT pueden ser reguladoras, no reguladoras y sensibilizadas. El ensayo de hipersensibilidad retardada trans vivo puede aplicarse para determinar parámetros clínicos como las respuestas aloreactivas, en los que la fuente del antígeno son las células del donante del trasplante. La ventaja principal de esta técnica frente a los métodos in vitro existentes es que se pueden detectar fácilmente tanto las respuestas proinflamatorias como las reguladoras frente a antígenos alo, autoantígenos o antígenos tumorales utilizando un único sistema de ensayo.

Egon, un investigador en mi laboratorio, demostrará ahora el procedimiento utilizando sangre periférica humana fresca recolectada en tubos de dextrosa citrato ácido para evitar la activación de plaquetas. Aísle los PBMC utilizando medio de separación de linfocitos según métodos estándar. Lave la preparación de PBMC con PBS para eliminar plaquetas contaminantes.

Si hay una contaminación notable por glóbulos rojos, realice la lisis de las células rojas utilizando un tampón de lisis CK. Luego, realice otros dos lavados con PBS Resus. Suspender los PBMC en PBS a una concentración de 10 millones de PBMC por mililitro para el antígeno alo.

Comience con BMC de P, aislados de la sangre periférica del donante mediante el procedimiento mostrado anteriormente. Luego, resuspenda las células donantes en PBS a una concentración de 120 millones de células por mililitro y agregue un micromolar de PMSF para prevenir la degradación de proteínas.

Ahora someta la suspensión celular a sonicación utilizando siete pulsos de un segundo con una sonica con sonda de dos milímetros. Mediante un hemocitómetro, verifique la ruptura de más del 90 % de las células.

A continuación, centrifugue la mezcla a 14.000 RPM a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo seguro de dos mililitros y determine la concentración de proteína mediante métodos estándar para cada inyección. Aliquote siete veces 10 a la sexta PBMC en dos mililitros.

Los tubos Safe Lock pelletizan las células mediante centrifugación. Primero, prepare la suspensión de control negativo de PBMC en 35 microlitros de PBS. Luego, para el control positivo, agregue 25 microlitros de un antígeno de memoria, toxoide del tétanos, toxoide de la difteria, y ajuste el volumen de inyección a 35 microlitros con PBS.

Según el diseño experimental para evaluar la respuesta específica del donante, re suspenda el sedimento celular en 10 microlitros de antígeno del donante más 25 microlitros de PBS, para un volumen total de 35 microlitros. Para evaluar la regulación específica del antígeno del donante en el experimento, re suspenda el sedimento celular en 35 microlitros añadiendo 10 microlitros de antígeno del donante y 25 microlitros de antígeno TT DT de memoria. Después de anestesiar, coloque un calibrador con resorte cargado en el centro de la almohadilla del pie del ratón con isoflurano, con un borde tocando la última almohadilla de apoyo del pie, para establecer un punto de referencia que mantenga constante el sitio de medición cuando la lectura del medidor se haya estabilizado.

Registre el grosor basal de la almohadilla plantar para la inyección en la almohadilla. Coloque la jeringa con la aguja orientada hacia los dedos del pie y el bisel hacia arriba. A continuación, comience las inyecciones subcutáneas de cada suspensión celular en las almohadillas plantares traseras del ratón.

Primero, inyecte lentamente la almohadilla del pie derecho con la preparación del control negativo. A continuación, inyecte la almohadilla del pie izquierdo con el control positivo de PBMC más TT dt. Ahora devuelva el ratón a su jaula.

Paso dos, inyecte la almohadilla del pie derecho con PBMC más antígeno alo y la almohadilla del pie izquierdo con PBMC más antígeno alo más TT dt. Asegúrese de que no haya fugas alrededor de las 18 a 24 horas posteriores a la inyección. Anestesie cada ratón con isoflurano y repita la medición de la hinchazón de la almohadilla del pie.

Reste el grosor de cada almohadilla plantar antes de la inyección al valor posterior a la inyección para obtener el valor de hinchazón de la almohadilla plantar. Luego, calcule la hinchazón neta específica al antígeno restando el valor de hinchazón de la almohadilla plantar del control a los valores de hinchazón obtenidos de los tratamientos. Verifique la lectura del control positivo con una respuesta del control positivo al antígeno de memoria TT DT mayor o igual a 25 veces 10 a la menos cuatro pulgadas.

Se requiere una respuesta de fondo a PBS para que la prueba se considere válida. A continuación, determine la inhibición de las respuestas de memoria en presencia de antígenos del donante. Este experimento evalúa a los receptores de trasplante renal en busca de respuesta específica a antígenos del donante y de regulación.

Existen tres patrones principales de hipersensibilidad retardada en receptores de trasplantes: regulador, no regulador y sensibilizado. Todos los pacientes respondieron fuertemente al control positivo del antígeno de memoria tt. El paciente número 62 muestra el patrón regulador, caracterizado por una respuesta débil al antígeno donante y una marcada supresión vinculada a la respuesta frente al antígeno de memoria en presencia del antígeno donante.

Este es el patrón que se ha encontrado asociado con la tolerancia al aloinjerto de órganos. El paciente número 48 presenta un patrón no regulador, que se caracteriza por una respuesta débil frente al donante, pero sin supresión vinculada. Este patrón se ha observado frecuentemente en pacientes que toman fármacos inmunosupresores.

El paciente número ocho presenta el patrón sensibilizado al donante, caracterizado por una respuesta elevada al antígeno del donante y ausencia de supresión vinculada. Esta respuesta se asocia con el rechazo del injerto. En estudios clínicos de casos, se analizaron las BMC del donante de sujetos inscritos en un ensayo observacional para evaluar la vía indirecta específica del donante, así como las respuestas de linfocitos T efector y T reguladores frente al donante, con el fin de determinar el papel de la regulación específica del donante en la tolerancia clínica.

Las respuestas tectoras indirectas a los antígenos del donante revelan un espectro distinto entre los grupos de inclusión. La inflamación de la almohadilla plantar aumenta a medida que el estado clínico del paciente progresa desde aquellos que son tolerantes hasta aquellos que rechazan de forma crónica. Aquí, el ensayo de supresión vinculada mide la vía indirecta anti donante de la respuesta de linfocitos T reguladores.

Estos datos muestran una disminución de las respuestas reguladoras en el rango que va desde los pacientes más tolerantes hasta los menos tolerantes con rechazo crónico. En conjunto, la regulación inmune medida mediante el ensayo de DTH en trans vivo parece ser un mecanismo importante para la aceptación del aloinjerto renal.

Un área prometedora es la aplicación del ensayo TDTH en el monitoreo de la autoinmunidad. Nuestro estudio sobre el papel del colágeno tipo cinco en el proceso patológico del síndrome de bronquiolitis obliterante (BOS) reveló que el mayor riesgo relativo de desarrollo de BOS se observó en pacientes con respuesta positiva al colágeno. Cinco pbmc de receptores de trasplante pulmonar, pero no de controles sanos ni del colágeno.

Cuatro pacientes con síndrome de buen pasto reactivo tras trasplante renal fueron frecuentemente reactivos al colágeno cinco. El ensayo TDTH también puede utilizarse para evaluar la reactividad de los PBMC de pacientes con cáncer frente a antígenos específicos del tumor. Por ejemplo, la presencia de células T reguladoras específicas de PAP en pacientes con cáncer de próstata puede limitar la respuesta a la vacunación con el antígeno PAP.

El ensayo TRANSVAAL DTH es una prueba diagnóstica novedosa con aplicación clínica para evaluar las respuestas inmunitarias mediadas por células en pacientes trasplantados, con cáncer y con enfermedades autoinmunitarias. Es valioso porque no solo es útil para monitorear las respuestas de memoria de los linfocitos T efector, sino que también puede utilizarse para detectar respuestas de los linfocitos T reguladores, ya que no depende de la medición de una citocina específica para identificar células T efectoras o reguladoras. Es muy flexible y ampliamente aplicable.