En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

El objetivo general de este experimento es permitir la detección de la muerte específica del antígeno in vivo de una célula diana en un modelo murino. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la inmunología, como la suficiencia y la detección de la muerte citolítica específica del antígeno de las células diana en un sistema inmunitario atacado y cómo esto podría modificarse mediante la manipulación de las células T para mejorar la función in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que permite al investigador evaluar el potencial citolítico específico del antígeno de forma directa y rápida, ya que el ensayo no depende del crecimiento del tumor ni de la infección.

Presentando estos procedimientos estarán Cara Haymaker, y Yared Hailemichael para instruirnos desde el Departamento de Oncología Médica del Melanoma. Después de anestesiar a los ratones, de acuerdo con el protocolo de texto, use alcohol isopropílico al 70% para rociar el área de la base de la cola para la inyección. Usando una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa, y con el lado del bisel hacia arriba, penetre de cuatro a cinco milímetros en la región de la base de la cola e inyecte 100 microlitros de solución peptídica previamente preparada.

Luego, lateralmente al lugar de inyección de la vacuna, inyecte 100 microlitros de anticuerpo anti-CD4D. Aplique cuidadosamente 50 miligramos por ratón de crema de imiquimod en los sitios de vacunación. Frote la crema en la superficie hasta que la crema ya no sea visible y se absorba por completo.

A continuación, inyecte 100 microlitros de 100.000 UI por mililitro de proteína rhIL-2 humana recombinante por vía intraperitoneal, en la región abdominal inferior. Después de aislar los esplenocitos de los ratones y lisar los glóbulos rojos, de acuerdo con el protocolo de texto, lleve a cabo la pulsación de péptidos resuspendiendo primero las células a 10 a la sexta células por mililitro en medio completo. Divida las células en dos tubos cónicos de 15 mililitros y etiquételos como pulsados o no pulsados.

Para OVA 257 a 264 pulsantes, agregue un microgramo por mililitro de péptido al tubo marcado como pulsado. A continuación, incubar células pulsadas y no pulsadas a 37 grados centígrados durante una hora. Agregue 10 mililitros de medio completo a los tubos pulsados y no pulsados para lavar las células objetivo.

A continuación, centrifugar las células restantes a 475 x g y a temperatura ambiente, durante cinco minutos, antes de aspirar el supernatante. Prepare un medio de alto etiquetado de CSFE agregando 1 microlitro por mililitro de CSFE a RPMI 1640 con 2% FBS, para una concentración final de cinco micromolares por milímetro. A continuación, prepare el medio de marcado bajo de CSFE añadiendo un microlitro por mililitro de CSFE a RPMI 1640 con 2% de FBS, para una concentración final de 0,5 micromolar por mililitro.

Para marcar los esplenolitos objetivo, vuelva a suspender de 10 a la sexta célula por mililitro de células pulsadas con medio de alto marcaje de CSFE preparado, y de 10 a la sexta célula por mililitro de células no pulsadas con medio de marcado bajo de CSFE. Mezcle las suspensiones celulares mediante una inversión suave o un remolino. A continuación, incubar las células a 37 grados centígrados durante 15 minutos, volviendo a mezclar las células cada cinco minutos.

A continuación, agregue 10 mililitros de medio completo a cada suspensión celular y centrifugue las celdas a 475 x g y temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, aspire el sobrenadante y utilice 10 mililitros de PBS frío para resuspender las células. Gire las celdas a 475 x g y 4 grados centígrados durante cinco minutos, antes de repetir el lavado con PBS.

Cuente las células y mezcle las células de CSFE altamente marcadas con CSFE pulsadas con células no pulsadas de CSFE de baja marca en una proporción de 1:1 para inyectarlas en ratones receptores. Mantenga una alícuota de uno por 10 hasta la sexta celda mezclada para usarla en una evaluación de citometría de flujo de referencia. Después de inyectar y reaislar las células diana, de acuerdo con el protocolo de texto, realice la evaluación de la actividad de CTL utilizando un protocolo de citometría de flujo estándar, adquiriendo células utilizando el canal FITC con un láser de 488 nanómetros para la excitación.

Antes de la inyección de las células objetivo marcadas con CSFE, la mezcla de células 1:1 se ejecutó en un citómetro de flujo para determinar las frecuencias de referencia de las células objetivo de CSFE alto y CSFE bajo. Aquí se muestra la estrategia de compuerta para detectar cambios en las poblaciones de CSFE. Se realizó una puerta inicial utilizando los parámetros FSC y SSC.

A continuación, se subgó el total de células positivas para CSFE, antes de evaluar los cambios en la frecuencia, ya que esta población es relativamente pequeña en comparación con los espenlocitos endógenos no marcados. Aquí se muestra un ejemplo de la frecuencia relativa de las poblaciones de CSFE antes de la inyección y debe ser cercana a uno a uno. La necesidad del cebado de covex se observa en este panel, donde no se observó la muerte de las células de alto objetivo CSFE pulsadas por antígeno a las 24 horas posteriores a la inyección.

Esta figura demuestra la eliminación efectiva de las células diana de CSFE con alta marca pulsada por antígeno, ya que el pico que se observó antes de la inyección casi no se detectó, y la proporción cambió drásticamente del 50% al 1% de detección. Por último, la figura también muestra la cinética de la destrucción de células diana de alta etiqueta de CSFE pulsada por antígeno mediante la evaluación de la pérdida de esta población tanto a las 6 como a las 24 horas después de la inyección. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos o tres días, dependiendo de la función del antígeno y las células T.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el etiquetado de CSFE debe ser uniforme y se debe evaluar la cinética de la respuesta de CTL antes de realizar el ensayo. Después de este procedimiento, también se pueden realizar otros métodos como ELISA, ELISPOT y la tinción con citometría de flujo intracelular para evaluar los cambios en la función efectora y responder a otras preguntas adicionales. Después de ver este vídeo, debería ser capaz de tener una buena comprensión de cómo evaluar la función de CTL in vivo en ausencia de una infección o tumor.