Name: En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprende a detectar la citólisis mediada por células T específicas de antígeno en un modelo murino in vivo. Este método permite evaluar rápidamente el potencial citolítico sin depender del crecimiento tumoral.

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Este trabajo es apoyado por la investigación de NIH (A1R03AI120027 (RN) y 1R21AI20012 (RN)), beca de investigación institucional (RN), puesta en marcha conceder (RN), y semilla de MD Anderson CIC concede (RN).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center.
1. preparación de péptidos para la vacuna
<ol><li>Disolver el péptido liofilizado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la concentración adecuada y el vortex durante 30 s. Nota: Para hgp10025–33, la concentración final es de 1 mg/mL y para OVA257–264, la concentración final es de 0,5 mg/mL. Reconstituir el péptido antes de la inyección. No guarde después de la reconstitución.</li>
</ol>2. aislamiento de esplenocitos de ratón transgénico
Nota: Aislamiento de células desde el bazo debe realizarse de forma estéril.
<ol><li>
Eutanasia el ratón transgénico de OT-1 utilizando el método de asfixia aprobado de CO2 y extirpar el bazo. Nota: Ratón transgénico apropiado se utiliza en este paso específico para el péptido de elección.<ol>
<li>Coloque el ratón sobre su lado derecho. Rocíe el lado izquierdo del ratón con 70% de etanol (EtOH). Tire de la piel con unas pinzas y cortar la piel con tijeras quirúrgicas; el bazo será visible dentro de la cavidad peritoneal. Con cuidado corte la cavidad peritoneal para acceder al bazo. Extirpar el bazo con unas pinzas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Separar el bazo colocando un filtro μm 70 en una placa Petri con medio de 2 mL A (PBS con 1% de suero bovino fetal (FBS)) y rotura del bazo con el extremo de un émbolo.
	<ol>
<li>Recoger los esplenocitos de la placa de Petri y el lugar en un tubo cónico de 50 mL. Lave la placa de Petri con 5 mL de medio A dos veces a recoger todas las células. Añada medio un up a 25 mL y centrifugar las células durante 5 minutos a temperatura ambiente a 475 x g.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirar las células y resuspender en 1 mL / por tampón de lisis de glóbulos rojos (gr) de bazo. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos agregar 10 mL de medio A centrifugar a temperatura ambiente a x 475 g. Resuspender el precipitado en 10 mL de medio A y eliminar los desechos por la suspensión de células a través de un filtro de 70 μm en un limpio cónico de 50 mL de filtrado.</li>
	<li>
Contar celdas con azul de tripán y un hemocitómetro. Resuspender las células en PBS a una concentración final de 106 - 1006 células/mL. Para OVA257–264 específico matar, suspender 106 células/ml y para hgp10025–33 específico matar, resuspender en 1006 células/mL.
	<ol>
<li>Vuelta las células restantes a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x g. aspiración el sobrenadante y resuspender en 15 mL PBS frío para lavar las células. Repetir una vez más la etapa de lavado. Vuelta las células a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x g. aspiración el sobrenadante y resuspender en PBS frío según volumen final determinado en el paso 2.4.</li>
		<li>Transferir la suspensión unicelular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y no en hielo hasta su inyección en el receptor del ratón C57/BL6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. inyección de esplenocitos de ratones transgénicos
<ol><li>Coloque el ratón C57/BL6 destinatario en un limitador con el lado dorsal hacia arriba. Rocíe el área base de la cola de inyección con alcohol isopropílico al 70%. Administrar por vía intravenosa 100 μl de suspensión de célula (sección 2) en la vena de la cola utilizando una aguja de 27 G con el bisel hacia arriba.</li>
</ol>4. Covax administración
Nota: Si las células se inyectan en la tarde, covax debe administrarse dentro de las 18 h de la inyección de células a la mañana siguiente.
<ol><li>Coloque el ratón en una caja claro la anestesia con isoflurano 1-3%. Después de ratones son completamente anestesiados, transferir los ratones a los conos de nariz conectados al colector de la cámara de anestesia. Mantener los ratones restringidos con el lado dorsal hacia arriba. Nota: Anestesia es confirmada por una pizca de breve del dedo del pie para comprobar que una respuesta de retirada no se produce. La ley federal restringe el uso de isoflurano del orden de un veterinario con licencia.</li>
	<li>Rocíe el área base de la cola de inyección con alcohol isopropílico al 70%. Inyectar 100 μl de solución de péptidos (de la sección 1) por vía subcutánea con una aguja de 27 G con la jeringa penetra 4-5 mm en la región base de la cola, la aguja bisel hacia arriba. Nota: Los ratones son vacunados en un costado con la inyección subcutánea en la base de la cola10.</li>
	<li>Inyectar 100 lateral de μl anti-CD40 anticuerpo (valores de 0,5 mg/mL) para el sitio de la inyección de la vacuna.</li>
	<li>Aplique cuidadosamente el imiquimod crema 50 mg/ratón en los sitios de vacunación. Frote la crema de imiquimod sobre la superficie hasta que la crema ya no es visible y es absorbida completamente.</li>
	<li>Inyectar 100 μl de proteína de rhIL-2 de 100,000 UI/mL por vía intraperitoneal (i.p.) en la región abdominal inferior. Observar los ratones durante 5 minutos después de recuperarse totalmente de la anestesia. Nota: El experimento se pausa en este punto durante 3 días.</li>
</ol>5. aislamiento de esplenocitos de destino para el etiquetado con CFSE
Nota: Aislamiento de células desde el bazo debe realizarse de forma estéril.
<ol><li>Eutanasia a los ratones C57BL/6 según el método de asfixia aprobado de CO2 . Retire el spleen(s) como en el paso 2.1.1. Desagregación del bazo y lavar esplenocitos como en los pasos 2.2.1 - 2.2.3. Lyse células de sangre rojas como en los pasos 2,3 - 2.3.2.</li>
	<li>Extraer células para contar utilizando un hemocitómetro y calcular para una concentración final de células a 106 células/mL en solución de etiquetado CFSE (descrito en el paso 7). Células restantes a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x aspirar sobrenadante de g. de la vuelta.</li>
</ol>6. péptido pulsación de esplenocitos de destino
Nota: Péptido pulsación debe realizarse de forma estéril.
<ol><li>Resuspender las células en 106 células/mL en medios de información (medios RPMI 1640 con 10% FBS, 1% L-glutamina (L-Gln), 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep)). Las células se dividen en 2 tubos (etiquetadores de 15 mL). Etiquetar cada tubo de pulsado o unpulsed.</li>
	<li>
Añadir péptido al tubo etiquetado pulsada. Para OVA257–264 pulsación, añadir 1 μg/mL y hgp10025–33 pulsación, añadir 2 μg/mL. Nota: Las células unpulsed se someten a la misma incubación como las células pulsadas sólo sin la adición del péptido.<ol>
<li>Incube las células + péptido a 37 ° C durante 1 hora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 10 mL de medio completo (medios RPMI 1640 con 10% FBS, 1% L-glutamina (L-Gln), 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep)) a cada tubo para lavar tanto pulsada y unpulsed las células diana. Células restantes a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x aspirar sobrenadante de g. de la vuelta.</li>
</ol>7. preparación de la CFSE para el etiquetado de esplenocitos de destino
<ol><li>
Preparar la solución de etiquetado CFSE durante la célula en paso 6.3; las células pulsadas serán marcadas como CFSEHola y el unpulsed como CFSElo. Preparar 1 mL de solución de etiquetado CFSE 106 células. Nota: CFSE es sensible a la luz y debe protegerse de la luz en todo momento.<ol>
<li>Preparar CFSEHola -etiquetado de los medios de comunicación mediante la adición de 1 uL/mL CFSE (solución stock de 5 mM) para una concentración final de 5 μm/mL en Medio RPMI 1640 con un 2% FBS.</li>
		<li>Preparar CFSElo -etiquetado de los medios de comunicación mediante la adición de 1 uL/mL CFSE (solución 0.5m m) para una concentración final de 0,5 media de μm/mL RPMI 1640 con un 2% FBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. etiquetado de esplenocitos de destino con CFSE
Nota: CFSE etiquetado debe realizarse de forma estéril.
<ol><li>Resuspender las células de la blanco pulsada y unpulsed (de paso 6.3) a 106 células/mL etiquetado CFSE medios de comunicación. Resuspender las células pulsadas con preparados CFSEHola-etiquetado de los medios de comunicación y las células unpulsed con preparados CFSElo-etiquetado de los medios de comunicación.</li>
	<li>Mezcle las células y medios etiquetado CFSE por inversión suave o remolinos. No mezclar con un vórtex. Incube las células y medios etiquetado CFSE a 37 ° C durante 15 minutos Remix las células cada 5 min.</li>
	<li>Añadir 10 mL de medio completo a cada células de suspensión y giro de celular a temperatura ambiente durante 5 min a x 475 g.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mL de PBS frío. Girar las células a 4 ° C por 5 min a x 475 g.</li>
	<li>Repetir el punto 8.4.</li>
	<li>Contar las células y la mezcla de péptidos-pulsada, CFSEHola-etiquetado con unpulsed, CFSElo-etiqueta las células en una proporción de 1:1 para su inyección en ratones receptores. Mantener una alícuota de 1 x 106 mezclado las células a utilizar para una evaluación inicial de citometría de flujo (sección 11). Nota: El volumen de inyección final es 100 μl por ratón. El recuento final de la célula es 10e6 células. Pérdida de volumen en la jeringa y la aguja debe ser tomado en cuenta y debe ser estimada en 500 μl.</li>
</ol>9. inyección de las células diana
Nota: Mantenga las células marcado con CFSE protegidas de la luz antes y durante la inyección lo más posible.
<ol><li>Coloque el receptoras ratones C57BL/6 en un limitador con el lado dorsal hacia arriba. Rocíe el área base de la cola de inyección con alcohol isopropílico al 70%. 100 μl de suspensión celular solo administrar por vía intravenosa en la vena de la cola con el bisel hacia arriba.</li>
</ol>10. su aislamiento de las células diana
Nota: El momento de este paso es crítico y depende de la fuerza del antígeno para la estimulación y la citotoxicidad CTL. Para la evaluación de matar a un objetivo pulsado OVA257–264 , las células necesitan ser cosechado 4-6 h después de la inyección. Ya que células marcado con CFSE bazos sensibles, proceso luz en la oscuridad.
<ol><li>Eutanasia el receptoras ratones C57BL/6 según el método de asfixia aprobado de CO2 .</li>
	<li>Retire el spleen(s) como en el paso 2.1.1. Desagregación del bazo y lavar esplenocitos como en los pasos 2.2.1 - 2.2.3. Lyse células de sangre rojas como en los pasos 2,3 - 2.3.2.</li>
	<li>Resuspender las células en células de fluorescencia activada 1 mL buffer (FACs) (1% BSA + PBS) de clasificación para la evaluación por citometría de flujo.</li>
</ol>11. compuerta lógica para determinar la actividad CTL por citometría de flujo
<ol><li>
Realizar evaluación de la actividad CTL utilizando un protocolo de citometría de flujo estándar. Adquirir las células mediante el canal FITC en un citómetro de flujo con láser 488 nm para la excitación11.
	<ol>
<li>Puerta en linfocitos vivo usando los parámetros de dispersión (SSC) lado de forward scatter (FSC) vs. Subgate dentro de la puerta en linfocitos de la población total de CFSE-positivo. Nota: Las células inyectadas CFSE-labeled formarán un pequeño subconjunto de los linfocitos totales presentes en el bazo. Las células positivas de CSFE deben aparecer como dos poblaciones distintas en la escala log.</li>
		<li>Utilice un formato de histograma para determinar el porcentaje de la unpulsed (izquierda pico, CFSElo) y pulsada (razón pico, CFSEHola) poblaciones. Pérdida de las células CFSEHola indica actividad CTL antígeno-específica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li>
<li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li>
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<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li>
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<li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li>
<li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8%28%2B%29+T+cell+sequestration%2C+dysfunction+and+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li>
<li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li>
<li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li>
<li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Si bien este protocolo es sencillo, hay algunos pasos críticos que deben realizarse con cuidado. El cebado covax después de la inyección de la célula de T específicas de antígeno sometido a prueba es necesario ver todo asesinato de objetivos pulsados. Aunque es posible que la vacunación a base de agua covax crea una condición inflamatoria aguda, para la fase inflamatoria crónica, cambiar la formulación a base de agua de breve duración con un enfoque de base de aceite de liberación lenta del antígeno puede producir un mej...

Existen múltiples protocolos para evaluar el citolíticos (CTL) potencial de un CD8+ o CD4+ T-cell. Esta evaluación puede hacerse fácilmente en vitro en condiciones controladas1,2,3. Además, modelos de enfermedades infecciosas, tales como LCMV, clásicamente han examinado la función CTL a través diferencialmente CFSE (-(and 6) 5-Carboxyfluorescein diacetato succinimidyl éster) etiquetado como células diana donde la CFSEhi-las células marcadas están pulsada con un péptido y CFSElo-destino etiquetado células quedan unpulsed. Las células son inyectadas en una proporción 1:1 y evaluó la pérdida de la CFSEHola-etiquetado objetivos pulsadas por citometría de flujo4. Vacuna y rechazo de modelos también han utilizado estrategias similares para la evaluación de en vivo de la matanza por ambos CD8+ y CD4+ T las células así como NK células5,6. Esto es un ensayo potente, pero requiere el uso de agentes infecciosos y que prime el sistema inmunológico antes de la inyección de destino.
Este protocolo, por el contrario, requiere una infección previa del huésped y en su lugar utiliza una estrategia de vacunación para cebar el sistema inmunológico antes de la inyección de destino. Esta vacuna se compone de una formulación a base de agua de vacuna peptídica que requiere la provisión de un inmunoestimulador cóctel llamado covax7, que consiste en un peaje-como el receptor 7 (TLR7) agonista (imiquimod crema), un anti-CD40 agonística anticuerpo y la interleucina-2 (IL-2) a la combinación sinérgica de los agentes inmunoestimulantes para la obtención de péptidos específicos cebado y respuesta inmune robusta. Como tal, este ensayo proporciona una lectura rápida de la función CTL como la vacuna se administra junto con las células para la evaluación de la función de sólo tres días antes de la inyección de las células diana. Además, el cebado covax es lo suficientemente fuerte como para que la capacidad de matanza de la célula de T específicas de antígeno preparada puede verse entre 4 y 24 h después de la inyección.
La limitación principal de este protocolo es identificar la línea de tiempo en vivo para la detección de la matanza de destino apropiado para el antígeno y la hipótesis ensayada. Cuidadosa evaluación debe realizarse, como variaciones en la fuerza de antígeno así como alteraciones genéticas siendo probado en las células T podría resultar en función diferencial de CTL que requiera una detección de diferentes tiempos de asesinato de destino. Además, si bien la concentración adecuada de péptido de vacunación ha sido optimizada para el antígeno de melanoma humano glicopéptido 100 (hgp10025-33) y ovoalbúmina257-264 (OVA257-264)8,9 , uso de otro modelo de antígeno que puede ser más apropiado para un determinado estudio requiere mayor validación. Debido a diferencias esperadas en la capacidad de los antígenos de un objetivo para estimular la función efectora CTL en combinación con el covax como coadyuvante, optimización de la frecuencia de dosis y concentración de dosis IL-2 puede ser esencial para lograr el objetivo deseado. En general, este protocolo permite una evaluación rápida de la función en vivo y puede ser adaptado a cualquier antígeno determinado.

<table><tbody><tr><td>Ratones hembra C57BL/6 de 6 a 12 semanas de edad&nbsp;</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>C57 Negro 6 ratones</td></tr><tr><td>OT-1 Ratones hembra de 6-12 semanas de edad&nbsp;</td><td>Jackson Labs</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>hgp10025&ndash; 33&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>834139</td><td>KVPRNQDWL</td></tr><tr><td>OVA 257&ndash; 264&nbsp;</td><td>CPCScientífico</td><td>MISC-012</td><td>SIINFEKL</td></tr><tr><td>Imiquimod crema 5%&nbsp;</td><td>Fougera</td><td>51672-4145-6</td><td>Aldara Cream</td></tr><tr><td>CD40-specific mAb&nbsp;</td><td>BioXcell</td><td>BE0016-2</td><td>clon FGK4.5</td></tr><tr><td>proteína rhIL-2&nbsp;</td><td>Hoffman LaRoche Inc</td><td>136</td><td>Proteína IL-2 humana recombinante</td></tr><tr><td>70% alcohol isopropílico Prep&nbsp;</td><td>Kendall</td><td>S-17474</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>Solución salina tamponada con fosfato</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td>suero fetal bovino</td></tr><tr><td>tampón de lisis RBC&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>tampón de lisis de glóbulos rojos</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Pluma/Estreptococo</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>penicilina/estreptomicina</td></tr><tr><td>CFSE Life</td><td>Technologies</td><td>C34554</td><td>5-(y 6)-carboxifluoresceína diacetato éster succinimidilo</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL MCT graduado natural&nbsp;</td><td>Tubo de microcentrífuga</td> <td>Fisher</td><td>05-408-129</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Fisher</td><td>BP8201500</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Solución azul de tripano, 0,4%&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 27</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

en vivo ensayo para la detección de la función citolítica de células t específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Las metodologías actuales para la matanza de específica de antígeno son limitadas para uso in vitro o utilizadas en modelos de enfermedades infecciosas. Sin embargo, existe no un protocolo diseñado específicamente para medir el antígeno específico homicidio sin una infección. Este protocolo está diseñado y se describen métodos para superar estas limitaciones por lo que permite la detección de antígeno específico matando de una célula diana por CD8 células+ T en vivo. Esto se logra por la fusión de un modelo de vacunación con el objetivo marcado con CFSE tradicional matando a ensayo. Esta combinación permite al investigador evaluar el potencial CTL específica de antígeno directamente y rápidamente como el ensayo no es dependiente sobre el crecimiento del tumor o infección. Además, la lectura se basa en citometría de flujo y por lo tanto debe ser accesible a la mayoría de los investigadores. La principal limitación del estudio es identificar la línea de tiempo en vivo que sea apropiada a la hipótesis de ser probada. Variaciones en fuerza de antígeno y mutaciones en las células de T que pueden producir la función citolítica diferencial deben ser evaluados cuidadosamente para determinar el momento óptimo para la cosecha celular y la evaluación. La concentración adecuada de péptidos para la vacunación ha sido optimizada para hgp10025-33 y OVA257-264, pero además se necesitarían validación de otros péptidos que pueden ser más apropiados para un determinado estudio. En general, este protocolo permite una evaluación rápida de la función en vivo y puede ser adaptado a cualquier antígeno determinado.

Antes de la inyección de las células diana marcada con CFSE, corre a la mezcla 1:1 células en un citómetro de flujo para determinar las frecuencias de línea de base del CFSEHola y CFSElo las células diana. Figura 1 A muestra la estrategia bloquea para detectar cambios en las poblaciones de la CFSE, una puerta inicial está hecha usando parámetros de FSC y SSC. Las células positivas de CFSE total entonces se subgated antes...

El objetivo de este protocolo es permitir la detección de en vivo matando de una célula de la blanco en un modelo murino de específica de antígeno.

En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

El objetivo general de este experimento es permitir la detección in vivo de la eliminación específica de antígenos de una célula diana en un modelo murino. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la inmunología, como la suficiencia y detección de la eliminación citolítica específica de antígenos de células diana en un sistema inmunitario atacado, y cómo esto podría modificarse mediante la manipulación de las células T para mejorar su función in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que permite al investigador evaluar directa y rápidamente el potencial citolítico específico de antígenos, ya que el ensayo no depende del crecimiento tumoral ni de una infección.Presentará este procedimiento Cara Haymaker, y Yared Hailemichael nos guiará desde el Departamento de Oncología Médica de Melanoma. Después de anestesiar los ratones, según el protocolo descrito, utilice alcohol isopropílico al 70 % para rociar la zona basal de la cola destinada a la inyección. Utilizando una aguja de 27 gauge conectada a una jeringa, con la bisel hacia arriba, introduzca cuatro a cinco milímetros en la región basal de la cola e inyecte 100 microlitros de la solución de péptido previamente preparada.Luego, lateral al sitio de inyección de la vacuna, inyecte 100 microlitros de anticuerpo anti-CD4D. Aplique cuidadosamente 50 miligramos por ratón de crema de imiquimod sobre los sitios de vacunación. Frote la crema sobre la superficie hasta que ya no sea visible y se absorba completamente.Luego inyecte 100 microlitros de 100.000 UI por mililitro de proteína recombinante humana rhIL-2 por vía intraperitoneal, en la región abdominal inferior. Después de aislar los esplenocitos de ratones y lisis de los glóbulos rojos, según el protocolo descrito en el texto, realice la estimulación con péptidos suspendiendo primero las células a 10⁶ células por mililitro en medio completo. Divida las células en dos tubos cónicos de 15 mililitros y rotúlelos como estimuladas o no estimuladas.Para la pulsación con OVA 257 a 264, añada un microgramo por mililitro de péptido al tubo etiquetado como pulsado. Luego, incube las células pulsadas y no pulsadas a 37 grados Celsius durante una hora. Añada 10 mililitros de medio completo a ambos tubos, pulsado y no pulsado, para lavar las células diana.Luego, centrifugue las células restantes a 475 x g y temperatura ambiente durante cinco minutos, antes de aspirar el sobrenadante. Prepare un medio de marcado con CSFE de alta concentración añadiendo 1 microlitro por mililitro de CSFE al RPMI 1640 con 2% de FBS, para obtener una concentración final de cinco micromoles por mililitro. A continuación, prepare el medio de marcado con CSFE de baja concentración añadiendo un microlitro por mililitro de CSFE al RPMI 1640 con 2% de FBS, para una concentración final de 0,5 micromoles por mililitro.Para marcar los esplenocitos diana, re suspenda 10 elevado a seis células por mililitro de células estimuladas con medio de etiquetado alto de CSFE preparado, y 10 elevado a seis células por mililitro de células no estimuladas con medio de etiquetado bajo de CSFE. Mezcle las suspensiones celulares mediante inversión suave o agitación circular. A continuación, incube las células a 37 grados Celsius durante 15 minutos, remezclando las células cada cinco minutos.A continuación, agregue 10 mililitros de medio completo a cada suspensión celular y centrifugue las células a 475 × g y temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego aspire el sobrenadante y utilice 10 mililitros de PBS frío para resuspender las células. Centrifugue las células a 475 × g y 4 grados Celsius durante cinco minutos, antes de repetir el lavado con PBS.Contar las células y mezclar las células marcadas con CSFE alto, pulsadas con péptido, con las células marcadas con CSFE bajo, no pulsadas, en una proporción de 1:1 para la inyección en ratones receptores. Guardar una alícuota de una vez 10 a la sexta de células mezcladas para utilizar como evaluación inicial por citometría de flujo. Después de inyectar y reaislar las células diana, según el protocolo descrito en el texto, realizar la evaluación de la actividad CTL utilizando un protocolo estándar de citometría de flujo, adquiriendo las células mediante el canal FITC con un láser de 488 nanómetros para la excitación.Antes de la inyección de células diana marcadas con CSFE, la mezcla de células en proporción 1:1 se analizó en un citómetro de flujo para determinar las frecuencias basales de las células diana CSFE alta y CSFE baja. Aquí se muestra la estrategia de selección para detectar cambios en las poblaciones de CSFE. Se realizó una puerta inicial utilizando los parámetros de FSC y SSC.Las células positivas totales para CSFE se subanalizaron posteriormente, antes de evaluar los cambios en frecuencia, ya que esta población es relativamente pequeña en comparación con los esplenocitos endógenos no marcados. Aquí se muestra un ejemplo de la frecuencia relativa de las poblaciones CSFE antes de la inyección, la cual debe ser cercana a uno a uno. La necesidad del cebado con covex se observa en este panel, donde no se detectó eliminación de las células diana CSFE altas pulsadas con antígeno a las 24 horas posteriores a la inyección.Esta figura demuestra la eliminación eficaz de las células diana marcadas con CSFE alto y pulsadas con antígeno, ya que el pico observado antes de la inyección fue casi indetectable, y la proporción cambió drásticamente de una detección del 50% a una del 1%. Finalmente, la figura también muestra la cinética de la eliminación de las células diana marcadas con CSFE alto y pulsadas con antígeno al evaluar la pérdida de esta población a las 6 y 24 horas posteriores a la inyección. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos o tres días, dependiendo de la función del antígeno y de las células T.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la marcación con CSFE debe ser uniforme y que la cinética de la respuesta de los linfocitos T citotóxicos debe evaluarse antes de realizar el ensayo. Tras seguir este procedimiento, también se pueden realizar otros métodos como ELISA, ELISPOT y tinción citométrica intracelular para evaluar cambios en la función efectora y responder otras preguntas adicionales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la función de los linfocitos T citotóxicos in vivo en ausencia de una infección o tumor.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Muchas infecciones provocan una respuesta CTL fuerte, pero de vez en cuando, la cantidad de células de respuesta no se correlaciona con el control del...

Antígeno Específico de la En Vivo Matar ensayo utilizando CFSE células diana marcadas

Este video muestra un ensayo basado en MoDC de células dendríticas derivadas de monocitos para medir la inmunogenicidad de las vacunas disponibles comercialmente. Los ensayos de MoDC investigan las respuestas de las células dendríticas a antígenos, patógenos o tratamientos y pueden proporcionar información sobre las respuestas inmunitarias, el desarrollo de vacunas y la investigación en inmunoterapia.

Un ensayo in vitro basado en células dendríticas pulsadas por vacuna para inducir la proliferación de linfocitos

El video muestra un método inmunológico para monitorear in vivo la producción de linfocitos T citotóxicos o CTL inducidos por adyuvantes. A un ratón se le inyectan previamente linfocitos T CD8+ de donantes modificados genéticamente, teñidos con colorante proliferativo. La inyección subcutánea de ovoalbúmina con adyuvantes genera linfocitos T CD8+ citotóxicos que se identifican después de la cosecha mediante inmunotinción y citometría de flujo.

Una técnica inmunológica para monitorizar la generación de linfocitos T citotóxicos mediados por adyuvantes

Hemos desarrollado un ensayo in vitro para investigar el papel de las vías inmunorreguladoras en la regulación de la secreción de citoquinas por las células-T CD4 específicas del VIH.

Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

La capacidad de controlar las respuestas de células T en detalle en vivo es importante para el desarrollo de nuestra comprensión de la respuesta inmune. Aquí se describe el uso de conjuntos de blancos fluorescentes (TLC) en un ensayo in vivo de células T en el que evalúa&gt; 250 parámetros simultáneamente por citometría de flujo.

El uso de fluorescentes Arrays objetivo para la evaluación de las respuestas de células T<em&gt; En vivo</em

Describimos técnicas basadas en imágenes de animales enteros y citometría de flujo para monitorear la expansión de las células T CD8+ específicas de antígeno en respuesta a la inmunización con nanopartículas en un modelo murino de vacunación.

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

Aquí presentamos una aplicación de una técnica inmunológica estándar (CFSE manchado OT-I proliferación) pretende monitorear rápidamente mediada por el adyuvante de linfocitos T citotóxicos (CTL) generación en vivo. Esta estimación rápida de la capacidad CTL es útil para el desarrollo de vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares así como vacunas contra el cáncer terapéutico.

Rápida In Vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos T citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna

Aquí, presentamos un protocolo para el ex vivo cualitativamente específica de antígeno CD8+ T las células. Análisis es posible con suspensiones de la célula de órganos o de pequeñas cantidades de sangre. Una amplia gama de estudios requieren el análisis de las respuestas de la célula de T citotóxica (vacunación y estudios de inmunoterapia del cáncer).

Cuantificación simultánea de CD8 anti-vector y Anti-transgénicos-específico+ T células vía MHC Tetramer tinción después de la vacunación con un Vector Viral

Describimos aquí un ensayo de matanza in vivo basado en citometría de flujo que permite el examen de inmunodominancia en las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) a un antígeno tumoral modelo. Proporcionamos ejemplos de cómo este ensayo elegante se puede emplear para estudios mecaniísticos y para pruebas de eficacia de fármacos.

Confección de ensayos de citotoxicidad in vivo para estudiar inmunodominancia en respuestas de células T CD8+ específicas de tumores

Este protocolo describe la generación quirúrgica de tumores pancreáticos ortotópicos y la rápida digestión de tumores pancreáticos murinos recién aislados. Después de la digestión, las poblaciones viables de células inmunitarias se pueden utilizar para análisis posteriores, incluida la estimulación ex vivo de las células T para la detección de citoquinas intracelulares por citometría de flujo.

Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores

Este manuscrito describe cómo evaluar la inmunogenicidad in vivo de las vesículas extracelulares (EV) derivadas de células tumorales utilizando citometría de flujo. Los EV derivados de tumores sometidos a muerte celular inmunogénica inducida por el tratamiento parecen particularmente relevantes en la inmunovigilancia tumoral. Este protocolo ejemplifica la evaluación de los EV tumorales inmunoestimulantes inducidos por oxaliplatino, pero se puede adaptar a diversos entornos.

In vivo Detección de inmunogenicidad de vesículas extracelulares derivadas de tumores mediante citometría de flujo de células T esplénicas

Aprende a detectar la citólisis mediada por células T específicas de antígeno en un modelo murino in vivo. Este método permite evaluar rápidamente el potencial citolítico sin depender del crecimiento tumoral.

En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación (Video) | JoVE Journal

En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

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