El análisis de la función génica y visualización de los cilios-generó un flujo de líquido en la vesícula Kupffer

El objetivo de este procedimiento es modular la función de los genes en la vesícula Kavas o el KV en el embrión de pez cebra que es responsable del patrón izquierda-derecha y analizar el flujo de fluido asimétrico generado por la camarilla motil mediante la entrega de perlas fluorescentes en el kv. Esto se logra inyectando primero oligonucleótidos morfo fluorescentes que reprimen la expresión de un gen específico de interés en la célula vitelino de un embrión en etapa de Dilla de blash medio, de modo que se carguen en las células precursoras dorsales que dan lugar al kv. A continuación, se seleccionan los embriones inyectados que tienen morfos fluorescentes solo en la célula vitelino y el kv para su posterior análisis.

A continuación, los embriones se montan en portaobjetos de depresión y se inyectan perlas fluorescentes en la luz de la vesícula llena de líquido del kv. Por último, la microscopía de vídeo se utiliza para registrar las perlas que fluyen dentro del kv. En última instancia, se pueden obtener resultados que determinen si el agotamiento específico del tejido de un gen candidato en el KV altera el flujo de fluido asimétrico a través del análisis cuantitativo de los movimientos de las cuentas.

La demostración viral de este semestre es crítica, ya que las inyecciones de molino específicas de la etapa y las inyecciones de perlas de fluorescencia son difíciles de aprender porque ambas dependen de la proposición del embrión y del momento de desarrollo del experimento. Para realizar inyecciones de morfología global o MO, recoja los embriones inmediatamente después de la fertilización y cárguelos en una placa de inyección. Utilice un fuego pulido más allá de nuestra pipeta para colocar los embriones en la placa de inyección para inmovilizar los embriones.

Rompa la punta de una aguja de inyección y ajuste la configuración de inyección para crear una gota de inyección que tenga un volumen de un nanolitro. Usando un microscopio de disección, inyecte un nanolitro de MO en el yugo de al menos 50 embriones entre las etapas de una y cuatro células. En el caso de la inyección de M mo dirigida a DFC, recoja los embriones inmediatamente después de la fecundación e incube a 28,5 grados centígrados.

Cuando los embriones alcancen la etapa de 256 células, cárguelos rápidamente en una placa de inyección e inyecte un nanolitro de MO fluorescente en la yema. Inyectar al menos 100 embriones entre las etapas de 256 y 1000 células para realizar la inyección dirigida a la yema. Después de incubar los huevos fertilizados en la etapa de cúpula, inyecte un nanolitro de MO fluorescente en el yugo de al menos 100 embriones entre las etapas de cúpula y el 30% de las capas.

Cuando M mo inyectados, los embriones alcanzan el 75% de la etapa de plo. Extraiga embriones no fertilizados y muertos bajo un microscopio de disección para inyecciones globales de MO. Elija embriones vivos para la fluorescencia distribuidos uniformemente en todas las células.

En el caso de las inyecciones de M mo dirigidas a DFC, seleccione embriones con fluorescencia difundida por toda la yema y concentrada en el margen dérmico dorsal. Para inyecciones de MO dirigidas a la yema. Elija embriones en los que la fluorescencia se distribuya uniformemente por toda la yema y no se observe en ninguna célula embrionaria entre las dos y las cuatro.

Así que las etapas de los ácaros. Seleccione embriones dirigidos a DFC que exhiban fluorescencia solo en las células KV y la yema, y deseche el resto para inyecciones dirigidas a la yema. Los embriones seleccionados con fluorescencia exclusivamente en la yema para analizar el flujo asimétrico en el KV de los embriones inyectados de MO comienzan utilizando pinzas afiladas para recubrir cuidadosamente alrededor de 20 embriones entre los cuatro y los seis.

Lo mismo ocurre con las etapas de transferencia de un embrión a un portaobjetos de depresión de vidrio y eliminar la mayor cantidad de agua posible. Inmovilice el embrión agregando suficiente aerodinámica tibia de bajo punto de fusión al 1% para cubrirlo a medida que la aerodinámica se solidifica. Use fórceps para colocarlo de manera que el KV quede hacia arriba, monte 10 embriones, trabajando rápidamente para asegurarse de que todas las inyecciones se completen para los 10.

Así que la etapa de ácaros. Después de diluir micro perlas fluorescentes de 0,5 micras de diámetro a una a 50 en agua estéril. Mezcle bien las perlas y cargue tres microlitros en una aguja capilar utilizando el mismo microinyector que se utiliza para las inyecciones de MO.

Use pinzas para romper la punta de la aguja y ajuste la configuración de la inyección para generar la inyección más pequeña posible. Soltar. A continuación, bajo un microscopio de disección, alinee la aguja con la luz KV del primer embrión montado. A continuación, inserte la aguja en el lumen e inyecte menos de 0,5 nanolitros de perlas.

Agregue una gota de agua estéril sobre el aros para evitar que el embrión se seque bajo un microscopio fluorescente vertical. Utilizando un objetivo de 20 veces, cribé los embriones inyectados para la entrega exitosa de perlas para cada embrión seleccionado con perlas dentro del KV con una gota de agua estéril para cubrir los aros. A continuación, observe utilizando un microscopio compuesto fluorescente con un objetivo de inmersión en agua de 63 veces.

Usando una cámara de alta velocidad montada en el microscopio, grabe una película de diez segundos. Utilice el canal fluorescente para grabar las perlas a aproximadamente 70 fotogramas por segundo y el contraste de interferencia diferencial o de campo claro para grabar el lumen KV. Importe las películas en la imagen J.Cree proyecciones máximas y utilice el software para seguir los movimientos de las cuentas individuales.

Esta figura muestra la distribución de MO fluorescente en embriones vivos inyectados en estadios específicos de éxito. Aquí se muestra una inyección fallida de MO en la que la solución permanece agregada en la celda de yema. El flujo de líquido en embriones inyectados con éxito se puede medir cualitativa o cuantitativamente en un embrión de control con perlas de flujo normal.

Siga las trayectorias en sentido contrario a las agujas del reloj que se pueden visualizar haciendo una proyección máxima de las posiciones de las cuentas fluorescentes a lo largo del tiempo o rastreando las cuentas individuales a lo largo del tiempo. Para demostrar la pérdida de flujo coordinado, se inyectaron embriones con MO para descomponer la quinasa de la fila dos B o la roca dos B, lo que interrumpe el flujo y, como resultado, las perlas se mueven aleatoriamente en kv, la velocidad promedio de cinco perlas de control y roca de dos embriones B mo se muestra aquí después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo exploraran los genes y los mecanismos para establecer el acceso al cuerpo izquierdo derecho en el pez cebra.