El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en C. elegans Uso de las herramientas de código abierto

El objetivo general del uso de software de análisis de imágenes y biología del desarrollo es obtener datos cuantitativos para modelos mecanicistas de procesos biológicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología del desarrollo, como ¿cómo se pueden analizar cuantitativamente los fenotipos de fenotipos mutantes? La principal ventaja de esta metodología es que proporciona a los investigadores la capacidad de identificar alteraciones en los procesos biológicos y fenómenos del desarrollo de una manera imparcial.

Aunque este método se puede utilizar para proporcionar información sobre el desarrollo y la morfogénesis de la elegancia marina, también se puede aplicar a otros organismos modelo como la josepha, CINA Leman, estudiante de doctorado en mi laboratorio. Después de instalar el programa IM MOD, abra el shell del eunuco y escriba Im mod en la ventana del mod de IM. Seleccione el archivo con los datos brutos apropiados a partir de los cuales generar un modelo 3D y utilice la ventana de información para ubicar la parte inferior y superior de los objetos en la ventana de zap.

En la ventana de información, de nuevo, trace los contornos de las celdas creando el primer contorno en el plano superior de cada celda y teniendo cuidado de crear un nuevo objeto para cada celda. A continuación, desplácese hacia abajo en Z y cree un nuevo contorno para cada plano Z y, a continuación, cree un nuevo objeto para cada celda. Después de delinear tantas celdas como corresponda para el modelo, abra la ventana de vista del modelo para inspeccionar los objetos y sus contornos.

A continuación, en la barra de herramientas de la vista de modelo, elija Editar y objetos. Se abrirá la ventana de edición respectiva para modelar todas las celdas como objetos rellenos y cerrados. Elija Malla como tipo de datos de dibujo y Relleno como estilo de dibujo.

Haga clic en malla y marque la opción tapa. A continuación, compruebe tantos objetos como sea necesario y haga clic en malla. Todo el programa generará objetos sólidos a partir de las pilas de curvas de nivel.

Cambie la escala Z en la ventana de vista para ajustar el factor de muestreo Z según sea necesario. A continuación, en el menú de edición, seleccione la vista para rotar los objetos 3D, guardando instantáneas o vídeos de las celdas según corresponda para seguir los objetos de las grabaciones fluorescentes de lapso de tiempo. Usando NDR primero, convierta los datos sin procesar en un archivo TIFF.

A continuación, abra el archivo. En la caída final. Seleccione el icono del visor 2D y haga clic en el icono del rango de ajuste para ajustar el histograma en el menú de datos.

Seleccione el archivo, el nombre, la imagen, el conjunto, el canal y establezca la resolución X, Y, Z e introduzca los valores X, Y y Z. Para anotar los núcleos, desplácese al plano de interés y vuelva a seleccionar el visor 2D. A continuación, seleccione linaje en el menú desplegable y elija nuevo linaje.

Haga clic y arrastre sobre el núcleo de interés para comercializar. A continuación, haga clic con el botón derecho del ratón en el núcleo y elija cambiar el nombre de la partícula. En el menú desplegable, introduzca un nombre para la partícula y, a continuación, arrastre el icono de la flecha para cambiar el diámetro del círculo.

A continuación, haz clic en el icono de la derecha para marcar el plano central del núcleo. Luego, para continuar en el tiempo y el plano, elija las opciones de marco y Z en la barra de herramientas inferior y ajuste la posición o el tamaño del círculo que marca el núcleo en consecuencia hasta que la célula rastreada se divida. Cuando se observe una división celular, marque los núcleos hijos y haga clic en el icono de Windows para cambiar al linaje.

El visor marca los tres núcleos simultáneamente y selecciona asociar padre en la opción de linaje. Luego, cuando se hayan rastreado todas las celdas, haga clic en el nombre del archivo y cambie al canal. Marcando el remanente de división celular para analizar cuantitativamente el flujo cortical utilizando el software de simetría de velocidad de imagen de partículas.

Cargue los nuevos archivos de imagen en pif lab y seleccione el estilo de secuenciación. 1, 2, 2, 3. A continuación, navegue hasta el directorio que contiene la secuencia de imágenes deseadas.

Seleccione las imágenes y haga clic en agregar para importar las imágenes. A continuación, en Configuración de análisis, seleccione exclusiones. ROI y use el botón.

Dibuje máscaras para el fotograma actual para desactivar la parte no deseada de las imágenes en la configuración de análisis. De nuevo, seleccione la configuración de PIF y elija la deformación rápida de la ventana de transformación de Fourier como el algoritmo PIF deseado. Para el primer paso, introduzca un valor de área de interrogación de 64 píxeles con un paso de 32 paso dos.

Introduzca un valor de área de interrogación de 32 píxeles con un paso de 16. A continuación, seleccione lineal en el menú desplegable de deformación de la ventana y elija el método gaussiano de dos por tres puntos para la estimación del desplazamiento de subpíxeles. Ahora seleccione analizar en el menú de análisis y seleccione analizar todos los fotogramas en el posprocesamiento, seleccione validación vectorial en el menú de posprocesamiento y aplique un umbral de filtro de desviación estándar de siete a todos los fotogramas en el menú de trazado.

Seleccione los parámetros derivados. Modifique los datos seguidos de vectores, píxeles por fotograma y ajuste la suavidad de los vectores y el filtro de paso alto. Después de aplicar estos ajustes a todos los fotogramas, establezca los fotogramas usados en uno para finalizar.

Por último, haga clic en el botón calcular vectores medios para medir los vectores medios de todos los fotogramas, centrándose en el giro de la gónada de los adultos de elegancia tipo C salvaje que se muestra como se acaba de demostrar. A partir de los datos de microscopía se genera un modelo 3D de las células germinales, lo que permite analizar los cambios en el tamaño de las células que se producen mientras las células transitan desde el brazo distal al proximal del cus utilizando microscopía de lapso de tiempo de dos colores. Los modelos obtenidos por proteínas de fusión de histonas lineales y miosina no muscular en NDR ilustran el patrón estereotipado de la herencia remanente de división celular.

Además, a partir de los datos de línea, se pueden obtener en este experimento las pistas de cada célula L y remanente de división celular y la correlación con el tiempo de división celular. Se realizó microscopía de lapso de tiempo a corto plazo con alta resolución temporal de miosina cortical no muscular dos para evaluar las diferencias en la dinámica del flujo de polarización cortical entre embriones de tipo salvaje y agotados para la fila de proteína activadora de gtpa RGA tres, como se esperaba. El flujo en los embriones de tipo salvaje fue predominantemente a lo largo del eje largo del embrión.

Mientras que el flujo en el embrión de interferencia de tres ARN RGA era ortogonal a este eje, como se desprende fácilmente del análisis PIP. Una vez dominado, la segmentación manual de objetos complejos y el seguimiento de células durante el desarrollo embrionario se pueden realizar en unas pocas horas si se intenta realizar correctamente el seguimiento de células y objetos. Es importante recordar que hay que establecer una resolución temporal adecuada para no perder el objeto durante el análisis utilizando las tres herramientas que se describen aquí.

El análisis estadístico también se puede realizar para responder a las preguntas sobre la variabilidad o simplemente para comparar diferentes embriones. La implementación de software de análisis cuantitativo de imágenes nos permite a nosotros y a otros biólogos del desarrollo como nosotros explorar los mecanismos morfogenéticos del desarrollo a un nivel de detalle sin precedentes. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar un conjunto diverso de herramientas de software para realizar análisis cuantitativos de imágenes.