El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en

El objetivo general de utilizar software de análisis de imágenes y biología del desarrollo es obtener datos cuantitativos para modelos mecanicistas de procesos biológicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología del desarrollo, como ¿cómo se pueden analizar cuantitativamente los fenotipos de mutantes? La principal ventaja de esta metodología es que proporciona a los investigadores la capacidad de identificar alteraciones en procesos biológicos y fenómenos del desarrollo de manera imparcial.

Aunque este método puede utilizarse para obtener información sobre el desarrollo y la morfogénesis de *sea elegance*, también puede aplicarse a otros organismos modelo como *josepha*. CINA Leman, una estudiante de doctorado en mi laboratorio, demostrará la reconstrucción de la forma celular con IOD. Después de instalar el programa IM MOD, abra la consola eunuch e introduzca Im mod en la ventana IM mod. Seleccione el archivo con los datos en bruto adecuados a partir de los cuales generar un modelo 3D y utilice la ventana de información para localizar la parte inferior y superior de los objetos en la ventana zap.

En la ventana de información, nuevamente, siga los contornos celulares creando el primer contorno en el plano superior de cada célula y teniendo cuidado de crear un nuevo objeto para cada célula. Luego desplácese hacia abajo en Z y cree un nuevo contorno para cada plano Z, y posteriormente cree un nuevo objeto para cada célula. Después de delimitar tantas células como sean apropiadas para el modelo, abra la ventana de vista del modelo para inspeccionar los objetos y sus contornos.

Luego, en la barra de herramientas de la vista del modelo, seleccione editar y objetos. Se abrirá la ventana de edición respectiva para modelar todas las células como objetos cerrados y rellenos. Elija malla como tipo de datos de dibujo y relleno como estilo de dibujo.

Haga clic en malla y marque la opción tapa. Luego, seleccione tantos objetos como sean necesarios y haga clic en malla. El programa generará objetos sólidos a partir de las pilas de contornos.

Cambie la escala Z en la ventana de visualización para ajustar el factor de muestreo Z según sea necesario. Luego, en el menú editar, seleccione la vista para rotar los objetos 3D, guardando instantáneas o películas de las células según corresponda para rastrear objetos a partir de grabaciones fluorescentes con intervalos de tiempo. Utilizando primero NDR, convierta los datos sin procesar en un archivo TIFF.

Luego abra el archivo. En final de gota, seleccione el icono del visor 2D y haga clic en el icono de ajuste de rango para ajustar el histograma en el menú de datos.

Seleccione el archivo, nombre, imagen, conjunto, canal, y configure la resolución X, Y, Z e ingrese los valores de X, Y y Z. Para anotar los núcleos, vaya al plano de interés y seleccione nuevamente el visor 2D. Luego, seleccione linaje en el menú desplegable y elija nuevo linaje.

Haga clic y arrastre sobre el núcleo de interés para marcarlo. Luego, haga clic derecho sobre el núcleo y elija renombrar partícula. En el menú desplegable, ingrese un nombre para la partícula y luego arrastre el icono de flecha para cambiar el diámetro del círculo.

A continuación, haga clic en el icono derecho para marcar el plano central del núcleo. Luego, para avanzar en el tiempo y en el plano, seleccione las opciones de fotograma y Z en la barra de herramientas inferior y ajuste la posición o el tamaño del círculo que marca el núcleo según corresponda hasta que la célula rastreada se divida. Cuando se observe una división celular, marque los núcleos hijas y haga clic en el icono de ventanas para cambiar a la línea celular.

El observador marca simultáneamente los tres núcleos y selecciona el progenitor asociado en la opción de linaje. Luego, cuando se haya rastreado todas las células, haga clic en el nombre del archivo y cambie al canal. Marque el remanente de la división celular para analizar cuantitativamente el flujo cortical mediante software de simetría de velocidad de imagen de partículas.

Cargue los nuevos archivos de imagen en pif lab y seleccione el estilo de secuenciación. 1, 2, 2, 3. A continuación, navegue al directorio que contiene la secuencia de imágenes deseadas.

Seleccione las imágenes y haga clic en agregar para importarlas. Luego, en la configuración de análisis, seleccione exclusiones. Máscara de ROI y use el botón.

Dibuje máscaras para el fotograma actual para inactivar la parte no deseada de las imágenes bajo la configuración de análisis. Nuevamente, seleccione la configuración de PIF y elija la deformación de la ventana de transformada rápida de Fourier como el algoritmo de PIF deseado. Para el pase uno, ingrese un valor de área de interrogación de 64 píxeles con un paso de 32 en el pase dos.

Introduzca un valor de área de interrogación de 32 píxeles con un paso de 16. Luego seleccione lineal en el menú desplegable de deformación de ventana y elija el método gaussiano de dos por tres puntos para la estimación del desplazamiento subpíxel. A continuación, seleccione analizar en el menú de análisis y seleccione analizar todos los fotogramas en el posprocesamiento; seleccione validación de vectores en el menú de posprocesamiento y aplique un umbral de filtro de desviación estándar de siete a todos los fotogramas desde el menú de gráficos.

Seleccione los parámetros derivados. Modifique los datos seguidos por los vectores, píxeles por cuadro y ajuste la suavidad de los vectores y el filtro de paso alto. Después de aplicar estos ajustes a todos los cuadros, establezca los cuadros utilizados en uno para finalizar.

Finalmente, haga clic en el botón para calcular los vectores medios y medir los vectores medios de todos los fotogramas, centrándose en el giro de la gonada de adultos de tipo salvaje de C. elegans, tal como se acaba de demostrar. Se genera un modelo 3D de las células germinales a partir de los datos de microscopía, lo que permite analizar los cambios en el tamaño celular que ocurren mientras las células pasan desde el brazo distal hasta el brazo proximal del conducto seminal utilizando microscopía de dos colores con intervalos de tiempo. Los modelos obtenidos mediante proteínas de fusión de histona de línea y miosina no muscular en NDR ilustran el patrón estereotipado de herencia de los restos de división celular.

Además, a partir de los datos de las líneas, en este experimento se pueden obtener las trayectorias de cada célula L y de los restos de división celular, así como su correlación con el momento de la división celular. Se realizó microscopía de lapso de tiempo corto con alta resolución temporal de la miosina no muscular cortical dos para evaluar las diferencias en la dinámica del flujo cortical polarizante entre embriones de tipo salvaje y embriones agotados para la proteína activadora de GTPasa RGA tres, tal como se esperaba. El flujo en los embriones de tipo salvaje fue predominantemente a lo largo del eje largo del embrión.

Aunque el flujo en el embrión de interferencia de ARN de RGA tres era ortogonal a este eje, como es claramente evidente a partir del análisis de PIP. Una vez dominado, el segmentado manual de objetos complejos y el seguimiento celular durante el desarrollo embrionario pueden realizarse en unas pocas horas si se hace adecuadamente, al intentar realizar el seguimiento de células y objetos. Es importante recordar configurar una resolución temporal adecuada para no perder el objeto durante el análisis utilizando las tres herramientas descritas aquí.

El análisis estadístico también se puede realizar para responder preguntas sobre la variabilidad o simplemente para comparar diferentes embriones. La implementación de software de análisis de imágenes cuantitativo nos permite a nosotros y a otros biólogos del desarrollo como nosotros explorar los mecanismos morfogenéticos del desarrollo a un nivel de detalle sin precedentes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar un conjunto diverso de herramientas de software para realizar análisis de imágenes cuantitativo.