Aplicación de la microscopía de resolución súper alta velocidad velocidad en vivo cilio primario

El objetivo general de este experimento es identificar las rutas de transporte de proteínas en los cilios primarios. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los cilios, como las diferencias en las rutas de transporte de proteínas en cilios normales y disfuncionales. La principal ventaja de esta técnica es que tiene una resolución lo suficientemente alta como para ver las rutas de transporte de proteínas por subdifracción en células vivas.

Para empezar, descongele el stock congelado de células NIH-3T3 especialmente diseñadas a 37 grados centígrados, una semana y media antes del experimento. Transfiera las células descongeladas a un matraz de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados que contenga tres mililitros de medios precalentados. Mantenga las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%.

Cultive las células hasta que alcancen el 80% de confluencia y luego divida las células. Para dividir las células, tripsinícelas con tripsina al 0,25% durante dos minutos a 37 grados centígrados. Después de la breve incubación, aspire la tripsina y reemplácela con dos mililitros de medios de cultivo precalentados.

Pipetear el medio para romper los grupos de células, luego retire el 75% de las células del matraz y devuelva el volumen total del medio a tres mililitros. Divida las células al menos tres veces antes del experimento para garantizar la homogeneidad de su ciclo celular. Dos días antes del experimento, se dividieron las células y se colocaron en una placa con un 60-70% de confluencia en una placa de fondo de vidrio de 35 milímetros con 1,5 mililitros del mismo medio de cultivo.

Luego, un día antes del experimento, transfecte químicamente las células con el plásmido deseado. Mezcle 500-1000 nanogramos del plásmido en una proporción de uno a 2,5 con reactivo de transfección y 0,25 mililitros de medio sérico reducido sin antibióticos durante 30 minutos. Una vez que se haya formado el complejo de transfección, aspire el medio del plato con fondo de vidrio de 35 milímetros y reemplácelo con la mezcla de transfección de 0,25 milímetros y 1,25 milímetros adicionales de medio sérico reducido sin antibióticos y devuelva la placa a la incubadora.

En el caso de las células con construcción SSTR3 marcada externamente, retire el medio del plato con fondo de vidrio una hora antes del experimento. Lave las células cinco veces con un mililitro de PBS y agregue un mililitro de medio sérico reducido suplementado con un micromolar de estreptavidina conjugada Alexa 647. No más de 15 minutos antes del experimento, retire los medios del plato con fondo de vidrio y lave las células cinco veces con un mililitro de PBS.

A continuación, añada un mililitro del tampón de imagen en el plato con fondo de cristal. Fije la placa inferior de vidrio a la platina en el microscopio. Encuentre una celda exprés de GFP utilizando el conjunto de filtros GFP y localice una celda que exprese correctamente SSTR3-GFP en un cilio primario.

Una vez que se haya encontrado una celda adecuada, alinee el punto NPHP4-mCherry en la base de los cilios primarios con la ubicación en el plano de imagen que corresponde a la iluminación de un solo punto del láser. Con la función de ajuste, en la pestaña de la cámara de la ventana de controles de enfoque, capture una imagen de epifluorescencia de las proteínas NPHP4-mCherry y SSTR3 marcadas con proteína de fluorescencia verde. Una vez obtenidas las imágenes de referencia, se reduce localmente la concentración de moléculas individuales marcadas mediante fotoblanqueo de la zona de transición con una iluminación láser de un milivatio durante 20 segundos.

Para prepararse para el seguimiento de una sola molécula, reduzca la potencia de iluminación láser a 0,5 milivatios para las moléculas marcadas con Alexa 647. Ajuste la ganancia y la intensificación al máximo y la velocidad de fotogramas a dos milisegundos. A continuación, haga clic en el botón de transmisión en la pestaña de la cámara de la ventana de controles de enfoque y active el láser de iluminación adecuado.

Registre las moléculas individuales marcadas no fotoblanqueadas a medida que se transportan a través de la región fotoblanqueada de la zona de transición. Y recuerde no grabar más de dos minutos de video para evitar los efectos de la deriva ciliar. Después de capturar las moléculas individuales, procese los videos utilizando un algoritmo de ajuste gaussiano 2D como Glimpse del laboratorio de Gelles, que localiza con precisión el centroide del punto de excitación de cada molécula individual, la función de propagación y un área de interés abarcadora.

Finalmente, seleccione todas las ubicaciones de moléculas individuales con una precisión superior a 10 nanómetros y corrija el centro de los cilios en función de la distribución de ubicaciones de moléculas individuales equipadas con una función gaussiana 2D. Como se describe en este vídeo, la iluminación de un solo punto se puede utilizar para rastrear una molécula SSTR3 marcada con AF647 a través de la zona de transición marcada por NPHP4-mCherry. Antes del análisis de datos, la superposición del vídeo de una sola molécula en la iluminación de campo amplio es un paso de validación útil para asegurarse de que el láser está correctamente alineado y de que hay una relación señal-ruido adecuada.

Aquí se muestra una célula con un cilio primario identificado por la tinción. IFT20 es un componente del complejo de transporte intraflagelar que transporta la carga a lo largo de los microtúbulos dentro de los cilios primarios, marcados por Arl13b-mCherry. Una vez identificada, se utiliza la microscopía de velocidad para rastrear las proteínas IFT20-GFP individuales.

A continuación, se utiliza el algoritmo de transformación de 2D a 3D para producir la distribución de densidad de probabilidad espacial de la proteína dentro de los cilios primarios a lo largo de una sola dimensión. Es probable que esta región de alta densidad se colocalice con los microtúbulos axonémicos de acuerdo con la ubicación conocida de la ruta de transporte intraflagelar. Al intentar este procedimiento, es importante alinear con precisión la muestra con el láser para minimizar el error sistemático.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar el seguimiento de una sola molécula con microscopía de velocidad y sabrá cómo obtener una ruta de transporte de una sola molécula en cilios primarios.