Post-Etiquetado Inmunoelectrónica incorporación de proteínas sinápticas en cultivos de cortes de hipocampo

La localización y distribución de proteínas proporcionan información importante para entender sus funciones celulares. La resolución espacial superior de la microscopía electrónica (EM) se puede utilizar para determinar la localización subcelular de un antígeno dado después de inmunohistoquímica. Para los tejidos del sistema nervioso central (SNC), la preservación de la integridad estructural, mientras que el mantenimiento de la antigenicidad ha sido especialmente difícil en los estudios de EM. Aquí, se adopta un procedimiento que ha sido utilizado para preservar las estructuras y los antígenos en el SNC para estudiar y caracterizar proteínas sinápticas del hipocampo de rata en las neuronas piramidales CA1.

El objetivo general de este procedimiento es realizar el marcaje de ImmunoGold para determinar la localización ultraestructural de las proteínas sinápticas en neuronas parametálicas CA one del hipocampo de rata. Esto se logra eliminando primero la CA de una región de la rebanada organotípica, recortando la esquina superior para recordar la orientación correcta e incubándola en un fijador libre de osmio en hielo. El segundo paso es deshidratar el tejido fijo y dejar que se endurezca infiltrándolo con resina.

A continuación, se cortan secciones ultrafinas de tejidos incrustados en resina y se colocan en rejillas de níquel. El paso final es realizar inmunohistoquímica en los tejidos de la sección. En última instancia, la inmunomicroscopía electrónica se utiliza para determinar la localización de proteínas en la sinapsis. Bien.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la plasticidad sináptica, como cómo las localizaciones de las proteínas dentro de las espinas dendríticas pueden ayudar a comprender su papel en la función sináptica. Aunque este método está optimizado para cortes organotípicos del hipocampo, también puede ser tremendamente valioso para otras preparaciones neuronales, incluidos los cortes agudos de cerebro y los cultivos neuronales primarios. Comience este procedimiento colocando la rebanada organotípica del hipocampo en una placa de Petri de poliestireno que contenga tampón de fosfato de Sorensen frío y hielo fresco.

Agregue uno o dos mililitros adicionales de tampón helado directamente encima de las rodajas. Con el fin de aislar el subcampo de CA uno de la rebanada, use un bisturí desechable para cortar suavemente a través de la rebanada junto al giro dentado, que es paralelo a la capa de CA de una celda. A continuación, corte el segmento restante verticalmente para eliminar el subcampo CA tres y el sulu.

A continuación, corte una esquina del CA en rodaja para ayudar a identificar la superficie superior del tejido y retire con cuidado el tejido de la membrana con la parte posterior del bisturí. Transfiera suavemente el tejido a una placa de 12 pocillos que contenga tampón de Sorensen helado. Retirar el tampón y añadir de 0,5 a un mililitro de fijador helado a pH 7,3 diluido en el tampón de Sorensen para que cubra adecuadamente la muestra.

Luego incubar durante dos horas a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, retire el fijador del pocillo y lave las muestras tres veces durante 20 minutos en tampón de Sorensen helado. A continuación, incubar la muestra en 1%Ácido tánico en peso por volumen en tampón de malato 0,1 molar a un pH de 6,0.

Después de 40 minutos, enjuague el ácido tánico lavando la muestra dos veces durante 20 minutos en el tampón de malato. A continuación, incubar la muestra durante 40 minutos en acetato de urinario al 1%En tampón de malato, el acetato de urinario es sensible a la luz y es radiactivo. Por lo tanto, manéjela con cuidado y coloque la muestra en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante la incubación.

Después de la incubación, enjuague las muestras dos veces durante 20 minutos cada una en tampón de malato helado, luego incube durante 20 minutos en cloruro de platino al 0,5% en tampón de recluso. Finalmente, enjuague cualquier residuo de cloruro de platino lavando dos veces durante 20 minutos. Cada tampón de reclusos almacena las muestras en un tampón de malato a cuatro grados centígrados hasta que estén listas para su posterior procesamiento.

Para comenzar la inmunohistoquímica, primero se incrusta y corta la resina deshidratada de las regiones CA una fija para obtener secciones ultradelgadas de 60 nanómetros en rejillas de níquel, como se describe en el protocolo de texto de este video. A continuación, coloque una gota de tampón de fosfato al 1%tween 20 a pH 7,5 sobre un trozo de paraforma limpia. A continuación, recoja suavemente la rejilla con pinzas limpias y hágala flotar sobre el tampón con la sección hacia abajo, incube así durante 10 minutos a temperatura ambiente después de la incubación, drene el exceso de líquido de la rejilla colocando la sección con el lado hacia arriba sobre el papel de filtro.

Además, retire cualquier solución atrapada entre los brazos de las pinzas EM absorbiendo suavemente con una astilla de papel de filtro mientras se asegura de que las secciones no se sequen por completo. A continuación, coloque una gota de 50 milimolares de glicina sobre la película para y haga flotar la sección de la rejilla con el lado hacia abajo sobre la solución de glicina a temperatura ambiente. Mientras la muestra se incuba durante 15 minutos, se añade un 2,5% de suero del animal del anticuerpo secundario a una solución de BSA al 2,5% y se coloca una gota de esta mezcla en la película para.

Después de la incubación de 15 minutos, seque la rejilla con papel de filtro y flote sobre la solución de bloqueo durante 30 minutos. A temperatura ambiente, prepare la cámara de incubación colocando toallitas Kim enrolladas a lo largo del interior de una placa de Petri de plástico limpia. Coloque un trozo de parámetro limpio en el centro de la placa de Petri y luego agregue agua filtrada a las toallitas Kim.

A continuación, coloque una gota de la solución de anticuerpo primario en la paraforma y haga flotar la muestra sobre ella a temperatura ambiente o durante la noche A cuatro grados centígrados, es necesario determinar experimentalmente el momento y la temperatura óptimos de incubación, así como la concentración de anticuerpos. Después de la incubación con el anticuerpo primario, lave la rejilla tres veces durante dos minutos cada una con tampón de fosfato al 1% entre 20. A continuación, incubar con un anticuerpo secundario utilizando de uno a 20 anti conejo o anti-US, acoplado a 10 nanómetros de oro después de una hora.

A temperatura ambiente, lavar tres veces durante dos minutos cada una con tampón de fosfato al 1% entre 20. A continuación, fije la muestra en glutaraldehído tamponado al 2% durante cinco minutos. Elimine el exceso de aldehído gluar enjuagando tres veces con tampón de fosfato al 1% y 20 y luego tres veces con agua filtrada enjuagando durante dos minutos cada vez.

Una vez enjuagado, incubar la rejilla en acetato de urinario al 2% durante 10 minutos. Durante la incubación, prepare una cámara libre de CO2 colocando un trozo de paraform en el centro de una placa de Petri de vidrio. Luego coloque de 10 a 15 gránulos de hidróxido de sodio en el plato alrededor de la paraforma para absorber el CO2 en el aire.

Mantenga la parte superior cerrada durante unos minutos. A continuación, utilice una pipeta de pasto y transfiera rápidamente un pequeño volumen de solución de citrato de plomo Reynolds recién preparada a la paraforma. Abra la parte superior lo suficiente para insertar la pipeta de pasto y minimizar la reintroducción de CO2 en la cámara.

En tres vasos de precipitados pequeños, prepare agua desionizada tibia recién hervida, lave el acetato del urinario sumergiendo la rejilla en el primer pico y gírela suavemente durante 30 segundos. Repita este paso en los otros dos vasos de precipitados. Una vez enjuagado, abra la parte superior de la placa de Petri de vidrio lo suficiente como para colocar la rejilla sobre la gota de solución de citrato de plomo Reynolds.

Si es posible, use una mascarilla mientras hace esto para evitar respirar citrato de plomo y para prevenir la formación de un precipitado. Después de 10 minutos, abra ligeramente la parte superior y retire la rejilla. Lávelo tres veces sumergiéndolo secuencialmente en tres vasos de precipitados frescos con agua destilada tibia.

A continuación, deja que la rejilla se seque en un trozo de papel de filtro. La muestra ya está lista para ser visualizada con el microscopio electrónico: secciones de tejido ultrafino de la región del hipocampo que se muestran aquí como una micrografía electrónica de transmisión, contienen dendritas y espinas de neuronas parametálicas fácilmente distinguibles. La identificación de sinapsis asimétricas entre la terminal axonal designada con una T y las espinas dendríticas designadas con una S se ve facilitada por la presencia de densidad postsináptica y una membrana plasmática bien definida.

La distribución de neuro Grandin en las espinas dendríticas se puede ver con la ayuda del marcaje EM de ImmunoGold y se enfatiza en estas imágenes TEM mediante las flechas. La distancia radial de neuro grandin desde el centro de la columna vertebral hasta la membrana plasmática de la columna vertebral se puede medir como la distancia radial normalizada. Una distancia de cero corresponde a una partícula que se encuentra en la membrana, y un valor de distancia de uno representa una partícula en el centro de la columna vertebral.

A continuación, se puede mostrar gráficamente la distancia de la neuro grandina a la espina dendrítica. Aquí, su distribución como una distancia radial normalizada se muestra en azul, y en comparación con una distribución aleatoria que se muestra en rosa, este gráfico muestra que neuro Grandin se encuentra cerca de la membrana plasmática. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores que estudian el sistema nervioso exploraran la localización y distribución de receptores de proteínas que interactúan con receptores, transportadores y canales iónicos, y muchos otros en diferentes tejidos cerebrales, como la corteza, el tálamo, el bulbo olfatorio y el cerebelo.

No olvide que trabajar con fijadores puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y una bata de laboratorio y el manejo de los fijadores en la cubierta de película mientras se realiza este procedimiento.