Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis

El objetivo general de este experimento es desarrollar un nuevo enfoque para analizar cuantitativamente las proteínas de membrana en las sinapsis de la cinta de la retina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología de la retina, como la ubicación precisa de las proteínas en las sinapsis dentro del circuito. La principal ventaja de la técnica es que puede estimar el número, la densidad y la rapidez de múltiples proteínas en las sinapsis de la cinta de la retina.

Para demostrar el procedimiento de congelación-sustitución y el corte ultrafino tenemos a los doctores Ron Petralia y Ya-Xian Wang del Centro de Imágenes Avanzadas del NIDCD. Para comenzar este procedimiento, diseccione un globo ocular bajo el microscopio. Para ello, primero retira la córnea.

A continuación, retire el cristalino y el vítreo de la superficie interretiniana con pinzas. Después, pela la esclerótica hasta que la retina quede aislada de la copa ocular. Corta la retina inmediatamente en tiras de 100 a 200 micrómetros de grosor con una navaja.

Posteriormente, mezclar las tiras de retina en paraformaldehído al 4% en PB 0,1 molar. Luego, en 4% de paraformaldehído más 0,01% de glutaraldehído a temperatura ambiente. Después de varios lavados en PB, con cloruro de calcio de 0,15 milimolares, crioproteger las tiras de retina con glicerol en PB 0,1 molar, antes de la sustitución por congelación. Antes de colocar el tejido congelado en los soportes de inclusión planos, corte un círculo delgado de una lámina de plástico transparente y colóquelo en la parte inferior de cada soporte para permitir una extracción más fácil de la caja de muestras polimerizadas cuando termine.

Ahora, configure la secuencia automática en el AFS. Llene el AFS con nitrógeno líquido y coloque los soportes de incrustación planos en el AFS. Llénelos con acetato de uranilo al 1,5% en metanol y enfríelos previamente.

Para congelar las tiras de retina en propano líquido a 184 grados centígrados, use un cepillo fino para colocar las muestras en pequeños trozos de cinta adhesiva doble adherida a los trozos de metal en el extremo de las varillas de inmersión. Después de eso, absorba el tampón adicional con el cepillo. Sumerja las varillas en el propano líquido durante unos cinco segundos.

Luego, transfiéralos al AFS usando una pequeña cámara de transporte que está llena de nitrógeno líquido. Después de colocar la muestra congelada y los instrumentos, fórceps y bisturí, en el AFS, enfríe los instrumentos en la cámara durante varios minutos antes de tocar el tejido. O bien, enfríelos colocando las puntas de los instrumentos durante unos segundos en la pequeña cámara de transporte llena de nitrógeno líquido.

Después de eso, retire la muestra y pegue el trozo con un bisturí fino. A continuación, coloque dos trozos de secciones congeladas en cada uno de los siete pocillos del soporte de aluminio de incrustación plana con acetato de uranilo al 1,5% en metanol. Manténgalos a 90 grados centígrados durante al menos 32 horas en el AFS.

Luego, aumente la temperatura de forma escalonada a 45 grados centígrados en la secuencia automática. Después de eso, lave las muestras tres veces en metanol preenfriado. A continuación, infiltre las muestras progresivamente con resinas de inclusión a baja temperatura como medio de inclusión.

Al día siguiente, vuelve a cambiar la resina y ajusta el nivel de resina para llegar al borde superior de los pocillos. Configure la luz UV en el AFS y polimerice las muestras con luz UV en el AFS hasta el final de la secuencia automática. A continuación, retire las muestras del AFS.

Por lo general, los bloques de muestra todavía muestran algo de color rosado y color. Coloque las muestras cerca de la luz fluorescente en la campana de gases químicos a temperatura ambiente durante la noche o hasta que parezcan completamente transparentes. En este paso, corte secciones ultrafinas de 70 nonómetros de grosor con un ultramicrótomo y recójalas en las rejillas de níquel recubiertas de carbono formvar.

Lave las rejillas en agua destilada una vez, seguida de tres lavados de TBS. A continuación, incubar las rejillas en 20 microlitros de 5%BSA en TBS durante 30 minutos, y luego en 20 microlitros de una mezcla que contenga anti-CTB de cabra y un anticuerpo contra una subunidad NMDAR durante la noche a temperatura ambiente. Después de eso, lave las rejillas tres veces con 20 microlitros de TBS cada vez a pH 7.6.

Posteriormente, lavar las rejillas una vez con TBS a ph 8,2 durante cinco minutos. Incubar las rejillas durante dos horas con 20 microlitros de una mezcla que contenga IGG anti-conejo de burro acoplado a partículas de oro de 10 nanómetros, y IGG anti-cabra de burro acoplado a partículas de oro de 18 nanómetros. Después de dos horas, lavar las rejillas en 20 microlitros de TBS, a pH 7,6 tres veces, seguido de un lavado en agua ultrapura y luego secar las rejillas al aire.

A continuación, contratiñir las rejillas con acetato de uranilo al 5% en agua destilada durante ocho minutos, seguido de citrato de plomo al 0,3% en agua destilada durante cinco minutos en la oscuridad. Para experimentos de triple etiquetado, incube las rejillas durante la noche a temperatura ambiente con 20 microlitros de una mezcla de CTB anti-cabra, anti-ratón PSD-95 y anti-conejo UN2A. Luego, incuba las rejillas durante dos horas con 20 microlitros de una mezcla de IGG acoplada a partículas de oro de 18, 10 y cinco nanómetros.

En esta sección, primero establezca la barra de escala. A continuación, mida la longitud de la PSD de las dendritas RGC individuales con el software ImageJ. Luego, cuente las partículas de oro dentro de los 10 nanómetros de la membrana en función de un grosor promedio de siete a nueve nanómetros para la membrana plasmática.

Calcule la densidad de partículas como el número de partículas de oro por micrómetro lineal. A continuación, mida la distancia entre el centro de cada partícula de oro y el centro de la PSD para la localización sináptica, o el borde de la PSD, para la localización extrasináptica. Esta imagen muestra el doble marcaje de inmunogold de GluA2/3 y CTB.

Esta es la cinta presináptica y las pequeñas partículas de oro se agrupan en el PSD de los procesos RGC. Esta imagen muestra el doble marcaje de inmunooro de GluN2B y CTB. Las pequeñas partículas de oro se encuentran en la membrana plasmática extrasináptica.

Y esta imagen muestra el doble marcaje de inmunooro de GluN2A y CTB. Al igual que en la GluA2/3, las partículas pequeñas se agrupan dentro de la PSD. Aquí se muestra el marcaje triple de inmunogold de GluN2A, PSD-95 y CTB.

Las partículas de oro GluN2A y las partículas de oro PSD-95 se colocalizan dentro de la PSD en dendritas RGC positivas para CTB individuales. Al intentar este procedimiento, es importante recordar fijar el tejido muy suavemente, porque la antigenicidad de algunas proteínas, como la de los receptores NMDA, disminuye notablemente con una fijación fuerte y prolongada. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo detectar y analizar proteínas de membrana con gran precisión en las sinapsis de cinta de la retina.