Name: Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprende a analizar proteínas de membrana en sinapsis de cinta retiniana mediante inmunogold post-embedding. Esta técnica de alta resolución permite cuantificar receptores de glutamato y estudiar su localización subcelular con precisión.

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Este trabajo fue apoyado por los programas internos del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) y el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación (NIDCD), de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Agradecemos a la instalación NINDS EM y el núcleo NIDCD avanzada de imagen (código # ZIC DC 000081-03) para obtener ayuda.

El cuidado y manejo de los animales estaban en conformidad con el NIH Cuidado de Animales y directrices del Comité de Uso. el día postnatal (P) 15-21 ratas Sprague-Dawley, inyectados con 1-1,2% CTB bilateral a través del colículo superior, se mantuvieron en un 12: 12 horas de luz: oscuridad ciclo. 1. Fijación tejido de la retina <ol><li> Reúna los siguientes materiales y herramientas: un microscopio de disección, 2 fórceps con puntas muy finas, tijeras, papel de filtro de celulosa, pipeta de plástico y un portaobjetos de microscopio. </li><li> Anestesiar la rata en una cámara cerrada con 2,0 ml halotano (un anestésico por inhalación). Determinar la anestesia adecuada por estos métodos: la falta de retirada de la pata trasera después pizca dedo del pie, o la falta de reflejo de parpadeo. Entonces decapitar inmediatamente con una guillotina. Quitar los ojos con un par de tijeras de iris y colocar en un recipiente de vidrio que contenía paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M (PB) a pH 7,4. </li><li> Utilizando el microscopio de disección, retire el maízea cortando la parte frontal del globo ocular. Retire la lente y el vítreo de la superficie de la retina interna con fórceps. </li><li> Pelar la esclerótica con las dos pinzas hasta que la retina se aísla de la copa ocular. </li><li> Cortar la retina inmediatamente en 100 - 200 tiras micras de espesor con una navaja de afeitar, y sujeto a la fijación cambio de pH. </li><li> Fijar tiras retina en 4% de paraformaldehído en 0,1 M PB a pH 6,0 para 20 - 30 min y después en paraformaldehído al 4% más 0,01% de glutaraldehído a pH 10,5 para 10 a 20 min a TA. </li><li> Después de varios lavados en PB con 0,15 mM CaCl 2 (pH 7,4 a 4 ° C), cryoprotect las tiras de la retina con glicerol (60 min cada uno en 10%, 20%, 30%, a continuación, O / N en 30%) en 0,1 M PB antes de congelar sustitución. </li></ol> 2. Congelación de sustitución NOTA: Este método de congelación-sustitución es una modificación de un protocolo publicado anteriormente 19,20. Además, es fundamental que los instrumentos son muy fríos (use guantes); otherwise, el tejido puede descongelarse parcialmente cuando se toca con los instrumentos. Todos estos pasos se ejecutan dentro de la cámara de AFS y los instrumentos no se les permite moverse por encima del borde de la cámara. Del mismo modo, una refrigeración adecuada de todos los productos químicos utilizados en la AFS es necesario. <ol><li> Sumir a congelar las tiras en la retina de propano líquido a -184 ° C en un instrumento de EM criopreservación (CPC). Usando un pincel fino, colocar las muestras en pequeños trozos de cinta adhesiva de doble cara unidos a los trozos de metal que van en el extremo de las barras se hunden (absorbe y expulsa fuera de amortiguación adicional con el pincel). </li><li> Sumir las varillas en el propano líquido y mantenerlo allí durante aproximadamente 5 segundos, y luego transferir al instrumento de congelación-sustitución automática (AFS), utilizando una pequeña cámara de transporte que se llena con nitrógeno líquido ( &#39;LN 2 enfrió recipiente de transferencia crio&#39;). </li><li> Después de colocar la muestra congelada e instrumentos (fórceps y bisturí) en el AFS, enfriar los instrumentos en la cámara para SEminutos Veral antes de tocar el tejido, o enfriarlas mediante la colocación de las puntas de los instrumentos durante unos segundos en la cámara de transporte pequeño (lleno de nitrógeno líquido ( &#39;LN 2 enfrió recipiente de transferencia crio&#39;)). </li><li> Una vez en la AFS, retire la muestra y el precinto de la colilla utilizando un bisturí fino. Además, mantener el control de flujo de gas de nitrógeno, TF (TF se describe como un &quot;control regulador de LN 2 vaporizador &#39;) abierta durante estos procedimientos. </li><li> Antes de colocar el tejido congelado en los soportes-incrustación planas (es decir, antes de configurar el AFS), cortar un círculo delgada de una hoja de plástico transparente y colocarlo en la parte inferior del soporte de manera que se cubra el fondo de cada pocillo. Esto permite la eliminación relativamente fácil de los bloques de muestras polimerizadas cuando haya terminado. NOTA: Anteriormente, hemos utilizado un método alternativo a los titulares de incrustación planas, y el empleo de dobles cápsulas de gelatina + Reichert (véase Petralia y Wenthold, 1999) &lt;sup&gt; 20. </li><li> Utilice la siguiente secuencia automática en el AFS (usando la terminología de instrumentos): T1 = -90 ° C durante 32 h, S1 = aumento de la temperatura en un 4 ° C / h (11,3 horas), T2 = -45 ° C durante 50 h, S2 = aumento de la temperatura en 5 ° C / h (9 horas), T3 = 0 ° C durante 40 horas (total = 142,3 horas). Se puede tomar de 2 - 4 horas para colocar muestras en el AFS (a -90 ° C) antes de comenzar la secuencia cronometrada. </li><li> Sumergir las secciones congeladas en acetato de uranilo al 1,5% en metanol a -90 ° C durante&gt; 32 h en la AFS. Coloque dos piezas de tejidos (por lo general) en cada uno de los siete pozos en el soporte de aluminio-incrustación plana (tres encajar en el AFS). <ol><li> Coloque el tejido + cinta en la uranilo de etilo / metanol en los pocillos y se retire la cinta más tarde, justo antes de comienzo medio de inclusión (tales como Lowicryl HM20) infiltración, si es demasiado difícil de eliminar el tejido de la cinta. </li></ol></li><li> A continuación, aumentar la temperatura por etapas a -45 ° C (+ 4 ° C por hora; en la secuencia automática). </li><li> Lavar las muestras tres veces en metanol preenfriada, mediante el uso de una pipeta de plástico de punta fina para eliminar la solución de edad de cada soporte de la incrustación de plano, y a continuación, utilizando otra pipeta de plástico estándar de añadir el metanol fresco enfriado previamente. </li><li> Luego, utilizando el mismo método, infiltrarse en las muestras progresivamente con resinas incrustación de baja temperatura como medio de inclusión (HM20 / metanol a 1: 1 y 2: 1, cada uno por 2 hr, seguido de resina pura durante 2 horas y a continuación, cambiar las resinas y mantener O / N). </li><li> Cambie la resina de nuevo el día siguiente, el ajuste del nivel de la resina para alcanzar sólo para el borde superior de los pocillos. </li><li> Polimerizar las muestras (-45 ° C a 0 ° C en secuencia automática; + 5 ° C por hora) con luz UV durante 40 h. </li><li> A continuación, retire las muestras de la AFS. Normalmente, los bloques de muestras todavía muestran cierta coloración rosada en color. Colocar las muestras cercanas a la luz fluorescente en la campana de humos química, a TA S / N o más tiempo hasta que la aplicaciónoído del todo claro. </li></ol> 3. Postembedding EM Inmunoelectrónica La inmunocitoquímica NOTA: inmunocitoquímica Postembedding se lleva a cabo como se describe 23,24,25. <ol><li> Cortar 1 micras secciones con ultramicrotomo, secciones de la mancha con un 1% de toluidina-azul, y examinarlas para la orientación de la sección; orientar el bloque de tejido para alcanzar el plano transversal óptima de corte. </li><li> Cortar 70 cortes ultrafinos nm de grosor con ultramicrotomo y recogerlos en rejillas de ranura de níquel recubiertas de Formvar-carbono. </li><li> Lavar las rejillas una vez en H2O destilada seguido de una solución salina tamponada con Tris (TBS tres veces, tampón Tris 0,05 M, NaCl al 0,7%, pH 7,6) de lavado. </li><li> Incubar rejillas en 20 gotas mu l de BSA al 5% en TBS durante 30 min, y después en 20 gotas mu l de una mezcla que contiene de cabra anti-CTB (1: 3.000) y un anticuerpo para GluN2A una subunidad NMDAR (anti-conejo de 1:50 , GluN2B 1:30), o un anti-conejo GluA2 / 3 (1:30)en TBS-Triton (TBST, 0,01% de Triton X-100, pH 7,6) con 2% de BSA y 0,02 M NaN 3 O / N a TA. </li><li> rejillas de lavado en tres gotas separadas (20 l) de TBS (pH 7,6) para 10, 10, y 20 min, seguido de TBS (pH 8,2) durante 5 min. </li><li> Incubar rejillas durante 2 horas en gotas (20 l) de una mezcla que contiene IgG anti-conejo de burro (01:20) acoplado a 10 partículas nm de oro y IgG de burro anti-cabra (1:20) acoplados a partículas de oro 18 nm en TBST (pH 8,2) con 2% de BSA y 0,02 M NaN 3. </li><li> Lávese las rejillas en 20 gotas l de TBS (pH 7,6) durante 5, 5 y 10 minutos, a continuación, en agua ultrapura y luego secarlos. </li><li> Rejillas contratinción con acetato de uranilo al 5% y 0,3% de citrato de plomo en H 2 O destilada para 8 y 5 min en condiciones de oscuridad, respectivamente. </li><li> Para los experimentos de etiquetado triple, incubar las redes de O / N a TA con 20 gotas mu l de una mezcla de anti-cabra de CTB (1: 3.000), anti-ratón de PSD-95 (1: 100) y anti-conejo GluN2A (1 : 50). A continuación se incuban las redes durante 2 horas el 2 de0 gotas mu l de una mezcla de IgG acoplado a 18, 10, y 5 partículas de oro nm en TBST (pH 8,2) con 2% de BSA y 0,02 M NaN 3. Mantener los mismos procedimientos que el doble etiquetado para el lavado y tinción de contraste entre y después de la incubación del anticuerpo. </li><li> Los controles se realizaron en el que los anticuerpos secundarios se aplicaron solos. </li><li> Ver cuadrículas en una EM y digitalizar imágenes. Procesar cifras finales en Adobe Photoshop 6.0 ​​sólo por el brillo y el contraste si es necesario 24. </li></ol> 4. Cuantificación <ol><li> Seleccione manualmente las zonas de la capa plexiforme interna (IPL) y sin agujeros o grietas en la ampliación 8,000X, a continuación, el fotomontaje al azar en toda la profundidad del IPL con una ampliación 25,000X. </li><li> Identificar las dendritas de RGC en diadas cono bipolares cuando a) contienen la señal CTB retrógradamente transportado (partículas de oro de gran tamaño), b) las membranas exhiben bien definido, hendiduras, y las densidades postsinápticas, c) contienen al menos dos pequeña parte del oroicles dentro del PSD, o más de una partícula de oro a pequeña a lo largo de la membrana plasmática extrasináptico. </li><li> Recoger 45 - 55 dendritas de CGR, en base a criterios anteriores, para el análisis cuantitativo. </li><li> Medir las longitudes de la PSD y la membrana plasmática de las dendritas extrasynaptic RGC individuales con software ImageJ NIH. Contar partículas de oro dentro de 10 nm de la membrana como asociada a membrana, en base a un espesor promedio de 7-9 nm para la membrana de plasma 26. </li><li> Calcular la densidad de partícula como el número de partículas de oro por micrómetro lineal (oro / m). Medir la distancia entre el centro de cada partícula de oro y el centro de la PSD (para la localización sináptica) o el borde de la PSD (para la ubicación extrasynaptic). </li><li> Realizar análisis estadísticos mediante el software. Utilice dos colas pruebas t para comparar las medias. La conclusión de significación de p &lt;0,05. A menos que se indique lo contrario, los valores del informe como media ± SEM 18. </li></ol>

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<li>Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+organization+of+a+type+of+peripheral+glutamate+synapse%3A+the+afferent+synapses+of+hair+cells+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear.</a> Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).</li>
<li>Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21, 545-559 (1998).</li>
<li>Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+expression+of+AMPA+and+NMDA+receptors+in+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses.</a> Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).</li>
<li>Grimes, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+inhibitory+microcircuitry+regulates+retinal+signaling+near+visual+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold.</a> J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).</li>
<li>Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+ionotropic+glutamate+receptors+at+dendrodendritic+synapses+in+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen divulgaciones.

Hemos descrito cuatro técnicas para el éxito post incrustar inmunoelectrónica EM cuantitativa: 1) la fijación corta y débil, 2) congelación-sustitución, 3) 4) la cuantificación posterior a la incorporación de tinción inmunoelectrónica, y. EM inmunoelectrónica permite la detección de proteínas específicas en las secciones de tejido ultrafinas. Anticuerpos marcados con partículas de oro se pueden visualizar directamente mediante EM. Mientras potente en la detección de la localización subsinápt...

El glutamato es el principal neurotransmisor excitatorio en la retina 1. Las células ganglionares de la retina (CGR), que reciben la entrada sináptica glutamatérgica a partir de células bipolares 2, son las neuronas de salida de la retina que envían información visual al cerebro. Los estudios fisiológicos mostraron que la excitación sináptica de CGR está mediado por los receptores NMDA postsináptico (NMDAR) y los receptores de AMPA (AMPAR) 3,4,5. Aunque las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) en CGR están mediados por AMPAR y NMDAR EPSCs 3,5,6,7,8, miniatura espontáneas (mEPSCs) en CGR exhiben solamente un componente mediada por AMPAR 4,5,9. Sin embargo, la reducción de la captación de glutamato reveló un componente NMDAR EPSCs en 5 espontáneas, lo que sugiere que los NMDAR en las dendritas de CGR, pueden estar situados fuera de las sinapsis excitatorias. guanilato quinasas asociadas a la membrana (MAGUKs) como PSD-95 que los receptores de neurotransmisores clúster, incluidos los receptores de glutamato y del canal iónicos en los sitios sinápticos, también presentan distintos patrones de expresión subsináptica 10,11,12,13,14. En las últimas décadas, la inmunohistoquímica confocal y pre-incrustación de microscopio electrónico de inmunohistoquímica (EM) se han empleado para estudiar la expresión del receptor de membrana. Aunque inmunotinción confocal revela patrones amplios de la expresión del receptor, su resolución más baja hace que sea imposible utilizar para distinguir localización subcelular. EM estudios pre-incrustación en la retina de mamíferos indican que las subunidades NMDAR están presentes en elementos postsinápticos en el cono bipolares sinapsis cinta celular 15,16,17. Esto está en contraste con aparente evidencia fisiológica. Sin embargo, la difusión de producto de reacción es un artefacto bien conocido en el método de inmunoperoxidasa pre-incrustación. Por lo tanto, este enfoque no suele dar datos estadísticamente fiables y puede excluir distinción entre la localización en la membrana sináptica frente 18,19,20,21 membrana extrasynaptic. EnPor otro lado, los datos fisiológicos y anatómicos son consistentes con una localización sináptica de AMPARs en CGR 3,5,7,9,22. Por lo tanto, los receptores de glutamato y MAGUKs en sinapsis cinta de la retina se localizan no sólo a la postsináptica, pero también a los compartimentos de membrana perisynaptic o extrasinápticos. Sin embargo, aún es necesario un análisis cuantitativo de alta resolución de estas proteínas de membrana en una sinapsis cinta de la retina. Aquí, hemos desarrollado una técnica postembedding EM inmunoelectrónica para examinar la localización subsináptica de subunidades NMDAR, subunidades de AMPAR y PSD-95, seguido de la estimación del número, la densidad y la variabilidad de estas proteínas en las sinapsis Onto CGR de rata marcado utilizando la toxina del cólera subunidad B (CTB) métodos de rastreo retrógrado.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehído</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>EMS</td><td>16019</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-8106</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>JT Baker</td><td>V015-05</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Gibco BRL</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Lowicryl HM 20</td><td>Polysciences</td><td>15924-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>04997-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GluN2A</td><td>Millipore</td><td>AB1555P</td><td>Dilución 1/50</td></tr><tr><td>Anti-GluN2B</td><td>Millipore</td><td></td><td>AB1557P Dilución 1/30</td></tr><tr><td>Anti-GluA2/3</td><td>Millipore</td><td>AB1506</td><td>Dilución 1/30</td></tr><tr><td>Anti-PSD-95</td><td>Millipore</td><td>MA1&ndash; 046</td><td>Dilución 1/100</td></tr><tr><td>Burro anti-conejo IgG-10 nm partículas</td><td>de oro EMS</td><td>25704</td><td>Dilución 1/20</td></tr><tr><td>Burro anti-ratón IgG-10 nm partículas de oro</td><td>EMS</td><td>25814</td><td>Dilución 1/20</td></tr><tr><td>Burro anti-ratón IgG-5 nm partículas</td><td>de oro EMS</td><td>25812</td><td>Dilución 1/20</td></tr><tr><td>Burro anti-cabra IgG-18 nm partículas de oro</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-215-147</td><td>Dilución 1/20</td></tr><tr><td>Rejillas de ranura de níquel recubiertas de Formvar-Carbon.</td><td>EMS</td><td>FCF2010-Ni Acetato</td><td></td>de</tr><tr><td>uranilo</td><td>EMS</td><td>22400-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>EMS</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de plomo</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM AFS</td><td>Leica Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EM CPC</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotomo</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JEOL 1200 EM</td><td>Nitrógeno líquido JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Roberts Oxygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propano</td><td>Roberts Oxygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTB</td><td>Lista Laboratorios Biológicos</td><td>104</td><td>1 - 1.2%</td></tr><tr><td>Lista Anti-CTB</td><td>Laboratorios Biológicos</td><td>703</td><td>Dilución 1/4,000</td></tr></tbody></table>

resolución de alta análisis cuantitativo inmunoelectrónica de receptores de membrana en la retina cinta sinapsis

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Las células ganglionares de la retina (RGCs) reciben información glutamatérgica excitatoria de las células bipolares. La excitación sináptica de las CGR está mediada postsinápticamente por los receptores NMDA (NMDAR) y los receptores AMPA (AMPAR). Los datos fisiológicos han indicado que los receptores de glutamato en las CGR se expresan no solo en los compartimentos de membrana postsináptica sino también en los perisinápticos o extrasinápticos. Sin embargo, no se han determinado ubicaciones anatómicas precisas para los receptores de glutamato en las sinapsis de RGC. Aunque se emplea ampliamente un análisis cuantitativo de alta resolución de los receptores de glutamato en las sinapsis centrales, este enfoque solo ha tenido un éxito limitado en la retina. Desarrollamos un método de inmunogold post-incrustación para el análisis de receptores de membrana, lo que permite estimar el número, la densidad y la variabilidad de estos receptores en las sinapsis de la cinta de la retina. Aquí describimos las herramientas, los reactivos y los pasos prácticos que se necesitan para: 1) la preparación exitosa de la fijación de la retina, 2) la sustitución por congelación, 3) la inmunocitoquímica del microscopio electrónico (EM) posterior a la incorporación de immunogold y, 4) la visualización cuantitativa de los receptores de glutamato en las sinapsis de cinta.

Los resultados presentados aquí demuestran sorprendentemente diferentes patrones de localización subsináptica de GluA 2/3 y NMDARs en dendritas de CGR en retina de rata, como se describe previamente 24,25. 77% de GluA 2/3 partículas de inmunomarcaje en los perfiles dendríticas RGC se encuentra dentro de la PSD (Figura 1A), similar a la mayoría de las sinapsis centrales. Sin embargo, NMDARs estaban ubicadas sinápticamente o extrasynaptically. 83% de las partícu...

El método de inmunogold postincrustado es una de las formas más efectivas de proporcionar análisis de alta resolución de la localización subcelular de moléculas específicas. En este trabajo describimos un protocolo para analizar cuantitativamente los receptores de glutamato en las sinapsis de la cinta retiniana.

Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

El objetivo general de este experimento es desarrollar un nuevo enfoque para analizar cuantitativamente las proteínas de membrana en las sinapsis en cinta retinianas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología retiniana, como la ubicación precisa de proteínas en las sinapsis dentro del circuito. La principal ventaja de la técnica es que puede estimar el número, la densidad y la rapidez de múltiples proteínas en las sinapsis en cinta retinianas.Para demostrar el procedimiento de sustitución por congelación y el corte ultradelgado, contamos con la colaboración de Ron Petralia y Ya-Xian Wang del Núcleo de Imagen Avanzada del NIDCD. Para comenzar este procedimiento, diseque un ojo bajo el microscopio. Para ello, primero retire la córnea.Luego, retire con pinzas la lente y el vítreo de la superficie inter-retiniana. Posteriormente, desprenda la esclerótica hasta que la retina quede aislada del copa ocular. Corte inmediatamente la retina en tiras de 100 a 200 micrómetros de grosor con una cuchilla.Posteriormente, mezcle las tiras de retina en paraformaldehído al 4 % en tampón fosfato 0,1 molar. Luego, en paraformaldehído al 4 % más glutaraldehído al 0,01 % a temperatura ambiente. Después de varios lavados en tampón fosfato con cloruro de calcio 0,15 milimolar, crioproteja las tiras de retina con glicerol en tampón fosfato 0,1 molar, antes de la sustitución por congelación. Antes de colocar el tejido congelado en los soportes de inclusión planos, corte un círculo delgado de una lámina de plástico transparente y colóquelo en la parte inferior de cada soporte para facilitar la extracción de la caja del espécimen polimerizado al finalizar.Ahora, configure la secuencia automática en el AFS. Llene el AFS con nitrógeno líquido y coloque los portamuestras planos para inclusión en el AFS. Llénelos con acetato de uranilo al 1,5 % en metanol y enfríe previamente.Para congelar rápidamente las tiras de retina en propano líquido a 184 grados Celsius, utilice un pincel fino para colocar las muestras sobre pequeños trozos de cinta adhesiva de doble cara unidos a los soportes metálicos en los extremos de las varillas de inmersión. A continuación, elimine el exceso de tampón utilizando el pincel. Sumerja las varillas en el propano líquido durante aproximadamente cinco segundos.Luego, transfiéralos al SFA utilizando una pequeña cámara de transporte llena de nitrógeno líquido. Después de colocar la muestra congelada y los instrumentos, pinzas y bisturí, en el SFA, enfríe los instrumentos en la cámara durante varios minutos antes de tocar el tejido. O bien, enfríelos colocando las puntas de los instrumentos durante unos segundos en la pequeña cámara de transporte llena de nitrógeno líquido.A continuación, retire la muestra y la cinta del soporte utilizando un escalpelo fino. Luego, coloque dos piezas de secciones congeladas en cada uno de los siete pozos del portamuestras de aluminio para inclusión plana que contiene acetato de uranilo al 1,5 % en metanol. Manténgalas a 90 grados Celsius durante al menos 32 horas en el AFS.A continuación, aumente la temperatura paso a paso hasta 45 grados Celsius en la secuencia automática. Después de eso, lave las muestras tres veces con metanol preenfriado. A continuación, infiltre las muestras progresivamente con resinas de inclusión a baja temperatura como medio de inclusión.Al día siguiente, cambie nuevamente la resina y ajuste el nivel de resina para alcanzar el borde superior de los pocillos. Configure la luz UV en el AFS y polimerice las muestras con luz UV en el AFS hasta el final de la secuencia automática. Luego, retire las muestras del AFS.Típicamente, los bloques de muestra aún presentan cierto tono rosado y color. Coloque las muestras cerca de la luz fluorescente en la campana extractora química a temperatura ambiente durante la noche, o hasta que aparezcan completamente transparentes. En este paso, corte secciones ultradelgadas de 70 nanómetros de grosor con un ultramicrotomo y recójalas sobre rejillas de níquel recubiertas con carbono y formvar.Lave las rejillas una vez con agua destilada, seguido de tres lavados con TBS. A continuación, incube las rejillas en 20 microlitros de BSA al 5 % en TBS durante 30 minutos, y luego en 20 microlitros de una mezcla que contiene anticuerpo anti-CTB de cabra y un anticuerpo contra una subunidad de NMDAR, durante la noche a temperatura ambiente. Después de esto, lave las rejillas tres veces con 20 microlitros de TBS cada vez, a pH 7,6.Posteriormente, lave las rejillas una vez con TBS a pH 8,2 durante cinco minutos. Incube las rejillas durante dos horas con 20 microlitros de una mezcla que contiene IGG de asno anti-conejo acoplada a partículas de oro de 10 nanómetros y IGG de asno anti-cabra acoplada a partículas de oro de 18 nanómetros. Después de dos horas, lave las rejillas con 20 microlitros de TBS a pH 7,6 tres veces, seguido de un lavado con agua ultra-pura y luego seque las rejillas al aire.Posteriormente, contratiña las rejillas con acetato de uranilo al 5 % en agua destilada durante ocho minutos, seguido de citrato de plomo al 0,3 % en agua destilada durante cinco minutos en la oscuridad. Para experimentos de triple marcado, incube las rejillas durante la noche a temperatura ambiente con 20 microlitros de una mezcla de CTB anti-cabra, PSD-95 anti-ratón y UN2A anti-conejo. Luego, incube las rejillas durante dos horas con 20 microlitros de una mezcla de inmunoglobulinas G acopladas a partículas de oro de 18, 10 y cinco nanómetros.En esta sección, primero establezca la barra de escala. Luego, mida la longitud de la PSD de las dendritas individuales de las CRR utilizando el software ImageJ. A continuación, cuente las partículas de oro situadas dentro de 10 nanómetros de la membrana, basándose en un grosor promedio de siete a nueve nanómetros para la membrana plasmática.Calcule la densidad de partículas como el número de partículas de oro por micrómetro lineal. Luego, mida la distancia entre el centro de cada partícula de oro y el centro del PSD para la localización sináptica, o el borde del PSD, para la localización extrasináptica. Esta imagen muestra la marcación doble con inmunogold de GluA2/3 y CTB.Esta es la cinta pre-sináptica y las pequeñas partículas de oro están agrupadas en la PSD de los procesos de las CRR. Esta imagen muestra la doble marcación inmunológica con oro de GluN2B y CTB. Las pequeñas partículas de oro se encuentran en la membrana plasmática extrasináptica.Y esta imagen muestra la doble marcación inmunocoloidal de GluN2A y CTB. De forma similar a GluA2/3, las partículas pequeñas se agrupan dentro de la PSD. Aquí se muestra la triple marcación inmunocoloidal de GluN2A, PSD-95 y CTB.Las partículas de oro de GluN2A y las partículas de oro de PSD-95 están co-localizadas dentro de la PSD en dendritas individuales de RGC positivas para CTB. Al realizar este procedimiento, es importante recordar fijar el tejido muy suavemente, ya que la antigenicidad de algunas proteínas, como la de los receptores de NMDA, disminuye notablemente con una fijación prolongada e intensa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar y analizar proteínas de membrana con gran precisión en las sinapsis con ribete retinianas.

high-resolution-quantitative-immunogold-analysis-membrane-receptors

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este video, que muestra cómo la etiqueta y visualizar solo exocitosis de vesículas sinápticas y el tráfico en las células de la retina con peces de colores bipolar total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía.

Imágenes de exocitosis en las células bipolares de retina con microscopía TIRF

Este protocolo detalla la forma de cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores.

Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

Fuente: Schönherr, S., et. al. Inmunomarcaje combinado optogenético y réplica de fractura por congelación para examinar la disposición específica de entrada de los receptores de glutamato en la amígdala de ratón. J. vis. exp. (2016)Este vídeo muestra el inmunomarcaje de réplicas fracturadas por congelación de tejido cerebral de ratón para microscopía electrónica. Las réplicas fracturadas y recubiertas se digieren para exponer los receptores. Se añaden anticuerpos primarios y secundarios...

Inmunomarcaje de proteínas de membrana neuronal en un espécimen de tejido cerebral de ratón fracturado por congelación

Fuente: Zhang, J., et al. Análisis cuantitativo de inmunogold de alta resolución de receptores de membrana en sinapsis de cinta de retina. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra una técnica de microscopía electrónica para visualizar la localización del receptor de neurotransmisores en las sinapsis de la retina. Las secciones de la retina contienen células ganglionares de la retina que exhiben receptores de neurotransmisores unidos a la membrana y están marcadas con la subunidad B de la toxina...

Imágenes de alta resolución de los receptores de neurotransmisores en las sinapsis de la retina

El protocolo descrito aquí es para la evaluación estructural de una preparación de retina de montaje completo. Esto incluye descripciones de la disección de tejidos, el montaje en un inserto de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) hidrofilizado, la carga en bolo con marcadores fluorescentes y una comparación de la fijación con carbodiimida y paraformaldehído para el análisis inmunohistoquímico de componentes celulares y sinápticos.

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

Protocolos de inmunohistoquímica se utilizan para estudiar la localización de una proteína específica en la retina. Se emplean técnicas de imagen de calcio para estudiar la dinámica del calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.

Inmunohistoquímicos y métodos de imagen de calcio en Wholemount Rata Retina

Este artículo ilustra cómo se puede cuantificar la expresión de receptores de neurotransmisores y analizar el patrón en sinapsis con elementos pre y postsinápticos identificados utilizando una combinación de transducción viral de herramientas optogenéticas y la técnica de inmunomarcaje de réplica de congelación-fractura.

Combinados Optogenética y congelación-fractura Réplica Immunolabeling para Analizar Arreglo-entrada específica de glutamato receptores en el ratón amígdala

Aquí presentamos un protocolo para adaptar el método de la CLARIDAD de los tejidos cerebrales para las retinas del entero-montaje para mejorar la calidad de la coloración immunohistochemical estándar y de la proyección de imagen de alta resolución de neuronas retinianas y de sus estructuras subcelulares.

Inmunostaining De Retinas De Montaje Completo Con El Método De Claro De Tejido CLARITY

Este protocolo describe los pasos detallados de la microscopía inmunoelectrónica previa a la incorporación, con un enfoque en la exploración de los circuitos sinápticos y la localización de proteínas en la retina.

Investigación de circuitos retinianos y localización molecular mediante microscopía inmunoelectrónica previa a la inclusión

Este protocolo proporciona un procedimiento de preparación optimizado y elaborado para muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión. Es adecuado para aplicaciones que involucran el análisis de sinapsis en organoides retinianos maduros.

Preparación de muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión

La retina exhibe una organización espacial compleja a través de su estructura laminar. La transcriptómica espacial moderna y las técnicas de secuenciación requieren secciones de tejido &lt; 20 μm de grosor, lo que limita su aplicabilidad en la investigación de la retina. Este método de criosección recién congelada produce secciones delgadas en la cara de la retina del ratón al tiempo que preserva las relaciones espaciales planas, lo que permite un mapeo molecular completo a través de las...

En la cara Crioseccionamiento de retina de ratón para análisis molecular espacial de alta dimensión

Aprende a analizar proteínas de membrana en sinapsis de cinta retiniana mediante inmunogold post-embedding. Esta técnica de alta resolución permite cuantificar receptores de glutamato y estudiar su localización subcelular con precisión.

Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis

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