Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

El objetivo general de este procedimiento es dirigirse con precisión a los microdominios en un mapa funcional para estudiar la estructura y la función de las neuronas a alta resolución. Esto se logra realizando primero imágenes de señales intrínsecas sobre un área grande de la corteza para obtener un mapa de la característica del estímulo de interés. El segundo paso es determinar la ubicación precisa en el mapa a la que se va a apuntar para obtener imágenes de alta resolución a fotones.

A continuación, después de colocar cuidadosamente la pipeta cargada con colorante fluorescente, las neuronas se marcan con el marcador fluorescente. Por último, se recogen imágenes de alta resolución a fotones de las respuestas o estructuras neuronales. En última instancia, un mapa de características de señal intrínseca se puede utilizar para encontrar una región de interés, como una singularidad de molinete de orientación que luego se puede estudiar con una resolución de una sola neurona.

La principal ventaja de este protocolo es que se pueden obtener imágenes de la corteza a diferentes escalas espaciales utilizando la misma configuración de microscopio con solo unos pocos ajustes rápidos en el sistema. Esto permite combinar estas técnicas para utilizar el mapa de señal intrínseca de resolución del curso como guía para elegir una región de neuronas para etiquetarla con sondas fluorescentes para obtener imágenes de alta resolución. El animal ha sido anestesiado de acuerdo con un protocolo aprobado por el comité institucional de cuidado animal, y el cráneo ha sido expuesto y limpiado.

La mezcla de cemento dental se ha utilizado para unir una placa de cabeza de acero inoxidable con una abertura rectangular en el centro al cráneo. Una cámara de metal en la parte superior de la placa del cabezal sirve como depósito para obtener imágenes con la lente del objetivo de inmersión en agua. La placa de la cabeza se ha asegurado en una plataforma XY mediante postes metálicos.

Use un taladro dental para adelgazar un área grande de hueso dentro de la abertura rectangular de la placa de la cabeza. La aplicación de ceras óseas necesarias para detener el sangrado ocasional. El área delgada debe extenderse más allá de los límites de la craneotomía planificada.

A continuación, perfore un contorno cuadrado de dos por dos milímetros en el hueso para la craneotomía. Enjuague la cámara periódicamente con líquido cefalorraquídeo artificial fresco para eliminar los fragmentos óseos y minimizar la disipación de calor a la corteza subyacente. Ahora, levanta el hueso con unas pinzas número tres.

Use una pinza número cinco y unas tijeras de resorte Vana para quitar las capas superiores de la duramadre, dejando intacta la capa inferior. La capa final de la duramadre es transparente y los vasos de la cáscara deben ser claramente visibles a través de ella. Aplique una gota de 2%aeros tibio disuelto en un líquido cefalorraquídeo y coloque inmediatamente un cubreobjetos sobre la craneotomía.

Primero, una espuma de gel empapada con LCR A alrededor del exterior del cubreobjetos para evitar que los agros se sequen durante la toma de imágenes de señal intrínseca. A continuación, conecte la cámara CCG de imagen de señal intrínseca al puerto de montura C estándar en la parte superior del fotomicroscopio dos y coloque una fuente de luz iluminadora en la mesa de aire cerca de la posición de la etapa XY y asegure la guía de luz sobre la craneotomía. Retraiga el dicroico primario y el espejo debajo del puerto del monte submarino para que la luz roja reflejada necesaria para las señales intrínsecas pase directamente de la craneotomía a la cámara CCD.

Inserte un filtro infrarrojo en la trayectoria de la luz para evitar que la corteza se caliente. A continuación, coloque un filtro que pase luz verde y registre una imagen digital de referencia de los vasos sanguíneos de la superficie cortical. A continuación, mueva el foco Z a 500 micras por debajo de la superficie cortical.

Reemplace el filtro verde por un filtro rojo para iluminar la corteza y medir las señales intrínsecas. Asegúrese de que la corteza esté iluminada uniformemente. Proteger la craneotomía de la luz producida por la pantalla de estímulos visuales y presentar una secuencia de estímulos visuales y registrar imágenes de datos de reflectancia para generar un mapa de orientación En 10 minutos, recopile los datos correspondientes a cuatro repeticiones de una secuencia de ocho estímulos con cuatro orientaciones y dos direcciones para cada orientación.

Ahora analice los datos de la señal intrínseca para generar un mapa de color de orientación falsa como se ve aquí. A continuación, seleccione las posibles regiones objetivo para el marcaje de dos fotones de las neuronas. Por ejemplo, las singularidades del molinete de orientación puntos en el mapa donde convergen todas las orientaciones preferidas.

A continuación, superponga el mapa de orientación y la imagen de la vasculatura de la superficie cortical y utilice el diseño de los dominios funcionales y la ubicación de los vasos de superficie grandes para seleccionar un objetivo, evitando las ubicaciones con vasos sanguíneos y arterias grandes. Prepare las soluciones fluorescentes D y extraiga una pipeta de cono largo de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito. Cargue cinco microlitros de la mezcla de colorante en la pipeta.

A continuación, retire la capa final de duramadre para facilitar la inserción de la pipeta y obtener imágenes de dos fotones de la más alta calidad, como se ilustra en este diagrama. La pipeta debe introducirse en la corteza en un ángulo de 30 grados para que pase entre la cámara y el objetivo. Por lo tanto, la ubicación de la superficie cortical de la posición de entrada de la pipeta no estará directamente sobre la región de interés objetivo.

Por ejemplo, para etiquetar una región objetivo a 200 micras por debajo de la superficie cortical, la posición de entrada de la pipeta en la superficie cortical será de aproximadamente 350 micras laterales a la posición objetivo. Mueva la etapa XY para centrar la posición de entrada de la superficie cortical bajo el objetivo de 20 x o 40 x. Una vez que la posición de entrada esté centrada debajo del objetivo, eleve la posición Z del objetivo en dos milímetros.

A continuación, encienda la luz verde de epifluorescencia y visualice el tinte rojo Alexa en la pipeta y mueva la pipeta hasta que la punta esté por encima de la posición de entrada de la superficie cortical. Mientras observa la punta de la pipeta a través de los oculares del microscopio con iluminación de campo claro, baje la pipeta hasta que la punta alcance la posición de entrada deseada en la superficie cortical. A continuación, retire el objetivo y utilice lanzas de absorción sin pelusa para absorber el exceso de líquido cefalorraquídeo de la craneotomía y secar el hueso adyacente.

A continuación, aplique una gota de 3%arose tibia, disuelta en un líquido cefalorraquídeo para estabilizar la corteza. Una vez que el aros se haya solidificado, inserte un objetivo de 40 x y vuelva a llenar la cámara con un líquido cefalorraquídeo. A continuación, utilice el eje diagonal del micromanipulador para mover la pipeta hasta que la punta alcance la profundidad deseada en la corteza.

Las inhalaciones ocasionales de eyección de presión de la mezcla de DI reducirán la probabilidad de que la punta de la pipeta se obstruya cuando la pipeta alcance la capa dos, tres pequeñas bocanadas de la mezcla de DI iluminarán el espacio celular adicional y revelarán un denso conjunto de cuerpos celulares circulares como sombras oscuras para cargar cuerpos neuronales en una esfera de corteza de 300 a 600 micras de diámetro. Inyecte la mezcla de Dix en el espacio extracelular usando de 30 a 90 pulsos. Cada pulso es de un segundo, de dos a 10 PSI.

Una vez finalizada la inyección, espere unos minutos y, a continuación, retire la pipeta y el objetivo. El indicador fluorescente de calcio será completamente absorbido por las neuronas en una hora. Por último, retire los aros utilizados para la descarga y enjuague la cámara de grabación.

Coloque una pequeña gota de dos a 3% en la superficie y coloque rápidamente un cubreobjetos sobre la craneotomía. Inserte un objetivo de NA 20 x alto en el soporte del objetivo y vuelva a centrar la región cortical marcada debajo del objetivo. El uso de la etapa XY protege la craneotomía de fuentes de luz extrañas y recopila imágenes de alta resolución de las neuronas marcadas in vivo.

Alternativamente, la electroporación de una sola célula se puede utilizar para estudiar la morfología dendrítica o la obtención de imágenes funcionales de las dendritas. En esta metodología, los DI se preparan de acuerdo con el protocolo escrito. Luego, en el punto apropiado del procedimiento, la punta de la pipeta se coloca adyacente a la membrana del cuerpo de una célula neuronal y se usa un axo para aplicar de uno a tres pulsos.

El llenado inmediato de la neurona con tinte se visualiza fácilmente con microscopía de dos fotones. Esta imagen muestra un área de dos fotones que muestra cuerpos celulares marcados con el indicador de calcio fluorescente OGB 1:00 AM en la capa dos tres de la corteza visual, la barra de escala representa 100 micras. Esta imagen muestra la preferencia de orientación de los cuerpos de células neuronales individuales del mismo sitio que se muestra en la imagen anterior.

Se ve un mapa organizado de la orientación preferida del estímulo alrededor de la singularidad del molinete que se centró en la región de la imagen. Aquí vemos el mapa de orientación obtenido con imágenes de señal intrínseca. El cuadrado negro corresponde a la región mostrada en las dos imágenes de fotones anteriores.

Esta imagen muestra las dendritas y el cuerpo celular de una sola neurona superpuesta con el mapa de orientación. La neurona fue electroporada con Alexa floor 5 94 bajo la guía de dos fotones. Como la pila Z se recolectó in vivo y los procesos dendríticos se rastrearon fuera de línea utilizando neuro lucid como software.

El mapa de orientación se obtuvo utilizando imágenes de señal intrínseca antes de la electroporación de una sola célula. La barra de escala representa 100 micras. Esta proyección Z de 10 micras de la capa cortical uno muestra dendritas apicales.

Las flechas rojas muestran espinas a lo largo de las dendritas, mientras que estas proyecciones Z de 10 micras de la capa cortical dos tres muestran dendritas basales con espinas indicadas por flechas rojas y axones indicados por flechas blancas. Este método es útil para estudiar mapas funcionales en la corteza a diferentes escalas espaciales y para apuntar con precisión a las neuronas en un dominio específico de interés. Dentro del mapa, hemos demostrado la aplicación del método para examinar mapas selectivos de orientación, pero puede extenderse a otros mapas de características visuales como la retina, la toppy, la dominancia ocular y la dirección, o a otras modalidades sensoriales que tienen mapas funcionalmente organizados, como los que codifican la sensación de somato o la audición.