Un método de alto rendimiento para la medición de la tasa de filtración glomerular en ratones conscientes
10 de mayo de 2013
La medición de la tasa de filtración glomerular (TFG) es el estándar de oro para la evaluación de la función renal. Aquí se describe un método de alto rendimiento que permite la determinación de la tasa de filtración glomerular en ratones conscientes mediante el uso de una sola inyección en bolo, la determinación de isotiocianato de fluoresceína (FITC) de la inulina en plasma y el cálculo de la TFG por un modelo de decaimiento exponencial de dos fases.
El objetivo general de este procedimiento es mostrar a otros investigadores cómo determinar la función renal en ratones despiertos. Esto se logra dializando primero el isotiocianato de fluoresceína o la inulina FSE durante 24 horas y determinando su concentración para la inyección. El segundo paso es pesar el ratón, preparar volúmenes precisos de inulina fitzy para la inyección retrobulbar y anestesiar el ratón.
A continuación, se realiza la inyección de inulina Fitzy retrobulbar y se toman ocho muestras de sangre durante un período de 75 minutos. El paso final es medir Fitz Nulin utilizando un espectrómetro de fluorescencia de micro volumen y calcular la función renal empleando un modelo de decaimiento exponencial de dos fases. En última instancia, la combinación de la sensibilidad del método de inyección de bolo único de Fiti Nulin con la capacidad de microvolumen del espectrómetro de flúor permite detectar diferencias en la función renal causadas por modificaciones genéticas en ratones, cambios en la dieta o aplicaciones de medicamentos.
Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes como la infusión continua y las condiciones anestesiadas, la implantación de mini bombas osmóticas que utilizan inulina radiactiva son que no es necesaria cirugía. No es un experimento terminal. No es necesario recoger orina y es posible medir hasta 24 M por día.
Voy a demostrar este procedimiento junto con Maria Azimo, una investigadora asociada de mi laboratorio para preparar la solución inyectable de Fitzy Nulin. Pese suficiente inulina ZI para dos mililitros de una solución al 5%, disuelva la inulina marcada en una solución de cloruro de sodio al 0,85% calentándola a 90 grados centígrados hasta que se disuelva por completo. Coloque un trozo de membrana de diálisis de 20 centímetros en agua destilada doble durante 30 minutos para eliminar el ácido de sodio residual de la membrana, enjuague la membrana varias veces después, llene la membrana de diálisis con inulina fitzy disuelta, selle correctamente con cierres y luego pese toda la membrana.
Deje que la inulina fitzy disuelta se dialice en un litro de solución de cloruro de sodio al 0,85% y agite lentamente protegido de la luz durante 24 horas a temperatura ambiente después de la diálisis, vuelva a pesar toda la membrana de diálisis y calcule la nueva concentración. El agua se moverá osmóticamente hacia la membrana y el FSI no unido saldrá de la membrana. Por lo tanto, la concentración de inulina FSI disminuirá sustancialmente.
Calcule la nueva concentración de inulina fit e utilizando esta fórmula, donde C es la nueva concentración. N es la cantidad inicial de inulina E fit y V es el nuevo volumen, que es la diferencia de peso del tubo de diálisis antes y después de la diálisis, más el volumen de la solución inicial de inulina fitzy. A continuación, esterilice la solución dializada por filtración a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras.
Recuerde mantener siempre la inulina fitzy protegida de la luz para evitar el fotoblanqueo antes del experimento. Tome el peso corporal de los ratones después de anestesiar brevemente a los ratones con cuatro a 5% de flúor ISO. Verifique la profundidad de la anestesia aspirando dos microlitros por gramo de peso corporal de Nulin Fitzy dializado con una jeringa Hamilton de 100 microlitros con una aguja de calibre 26 de media pulgada de largo para eliminar las burbujas de aire, luego cambie a una aguja de calibre 30 de media pulgada de largo para la inyección.
Proceda a inyectar la inulina fitzy dializada en el plexo retroorbitario. Permita que los ratones se recuperen espontáneamente en su jaula doméstica. Cubra un milímetro de cola de ratón con tijeras una vez y recoja sangre en múltiples puntos de tiempo después de la inyección en mini capilares de heparina de sodio.
Selle los mini capilares después de la extracción de sangre con cha seal y mantenga las muestras protegidas de la luz. Coloque los mini capilares sellados dentro de los capilares del hematocrito y centrifugue durante cinco minutos después de la centrifugación. Rompa los mini capilares con un cortador de diamante y transfiera todo el plasma mediante pipeteo a un tubo de 0,2 mililitros.
Haga una dilución de uno a 10 usando dos microlitros de plasma y 18 microlitros de pilas de 0,5 moles por litro en un nuevo tubo de 0,2 mililitros. A continuación, mida dos microlitros de la muestra diluida con el NanoDrop 3, 300 en duplicados para un alto rendimiento de seis ratones. Siga el protocolo de diagrama de flujo proporcionado en el protocolo de texto para medir la TFG de riñón completo mediante el método de inyección en bolo único: se deben recolectar ocho muestras de sangre a las 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 y 75 minutos después de la inyección de FSE nulin.
En este diagrama de flujo, los números indican puntos de tiempo de recolección, mientras que los números entre paréntesis indican puntos de tiempo de número de muestra a la izquierda de la línea roja vertical que indican puntos de tiempo de inyección. Cada ratón está marcado con un color diferente. Para obtener recolecciones de sangre secuenciales, siga las flechas.
Los recuadros grises indican cuándo se debe preparar el próximo ratón para la anestesia con flúor antes de la inyección utilizando este protocolo. El tiempo mínimo entre dos recolecciones de sangre de diferentes ratones es de un minuto de solución inyectable diluida de fitzy nulin con plasma de ratón diluido para obtener las diluciones estándar enumeradas en el protocolo de texto. La concentración de los patrones dependerá de la diálisis y siempre será diferente para cada preparación de FSI nulina.
Por lo tanto, es necesario ingresar la concentración para la curva estándar cada vez. Analice los datos para calcular la tasa de filtración glomerular o TFG con el software adecuado mediante el uso de una función de decaimiento exponencial de dos fases, como se describe en detalle en el protocolo de texto para medir la TFG en ratones conscientes. La cinética plasmática de la inulina ZI después de una inyección intravenosa de dosis única se utiliza para el cálculo de GFRA, el modelo de dos compartimentos se emplea en el modelo de dos compartimentos.
La fase inicial de decaimiento rápido representa la redistribución de la inulina fitzy desde el compartimento intravascular al líquido extracelular. La fase posterior, con un decaimiento más lento en la concentración de inulina fitzy, refleja predominantemente el aclaramiento sistémico del plasma. La diabetes mellitus tipo uno fue inducida por la aplicación intraperitoneal de estreptozotocina.
Se determinó la TFG antes y cinco semanas después de la inducción de la diabetes, los animales diabéticos tipo uno muestran claramente hiperfiltración glomerular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la TFG en ratones grandes mediante el uso de una técnica de inyección de bolo único y el empleo de un modelo DK exponencial de dos fases.
Resumen
Este artículo presenta un método de alto rendimiento para medir la tasa de filtración glomerular (GFR) en ratones conscientes. La técnica utiliza una inyección única en bolo de inulina marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC-inulin) y emplea un modelo de decaimiento exponencial de dos fases para el cálculo de la GFR.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Nefrología
- Fisiología
- Modelos animales
Antecedentes
- El TFG es un indicador fundamental de la función renal.
- Los métodos tradicionales a menudo requieren procedimientos invasivos.
- Este estudio tiene como objetivo mejorar las técnicas de medición del TFG.
- La inulina marcada con FITC es un trazador confiable para la evaluación de la función renal.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método no invasivo para la medición del FGR en ratones despiertos.
- Evaluar el impacto de modificaciones genéticas y tratamientos sobre la función renal.
- Proporcionar un protocolo que mejore el rendimiento y reduzca el estrés en los animales.
Métodos Utilizados
- Preparación de la inulina marcada con FITC mediante diálisis.
- Inyección retrobulbar del marcador en ratones.
- Recolección de muestras de sangre en puntos de tiempo específicos.
- Análisis de muestras de plasma mediante un fluoroespectrómetro de volumen reducido.
Resultados principales
- El método permite la determinación precisa del FGR sin cirugía.
- Permite la detección de cambios en la función renal debidos a diversos factores.
- Los resultados demuestran la viabilidad de la medición de alto rendimiento del FGR.
- Los datos respaldan el uso de un modelo de decaimiento exponencial bifásico para el análisis.
Conclusiones
- Esta técnica representa un avance significativo en la evaluación de la función renal.
- Ofrece un enfoque no terminal que beneficia al bienestar animal.
- El protocolo puede adaptarse para diversas aplicaciones de investigación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La medición cuantitativa de alto rendimiento de la tasa de filtración glomerular (GFR) en ratones conscientes aborda un cuello de botella crítico en la nefrología preclínica y la evaluación de la seguridad renal. Este método permite una evaluación sensible y longitudinal de la función renal en modelos de enfermedad y bajo intervención farmacológica, lo que fortalece la confianza predictiva y la continuidad traslacional en las líneas de descubrimiento de fármacos. Su protocolo no terminal y mínimamente invasivo mejora la toma de decisiones en carteras al permitir mediciones repetidas y una desvinculación mecanicista robusta.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la validación funcional de dianas renales mediante la cuantificación de cambios en la TFG en respuesta a perturbaciones genéticas o farmacológicas.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al distinguir los efectos renales reales de variables de confusión en animales conscientes y no restringidos.
- Facilita la confianza predictiva en estudios tempranos de seguridad y eficacia renal.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona un ensayo estandarizado y reproducible para la selección de alto rendimiento de compuestos que afectan la función renal.
- Ofrece lecturas cuantitativas basadas en plasma adecuadas para comparaciones entre estudios y entre compuestos.
- Permite diseños experimentales emparejados y escalables para estudios de intervención dietética o farmacológica.
Investigación Translacional y Preclínica
- Alinea la evaluación preclínica de la función renal con puntos finales clínicos mediante el uso del FGR como biomarcador traslacional.
- Permite estudios longitudinales, facilitando el seguimiento intra-animal de la progresión de la enfermedad o la respuesta terapéutica.
- Reduce el uso de animales y mejora la continuidad de los datos a través de las fases de investigación preclínica.
Integración de la tubería y del flujo de trabajo
Este protocolo de medición del FGR se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, permitiendo la detección funcional temprana, estudios mecanicistas y la validación traslacional de biomarcadores en la investigación renal.
- Biología del Descubrimiento: La medición cuantitativa del FGR respalda la formulación de hipótesis y la reducción de riesgos biológicos en estudios de dianas renales.
- Tamizaje: Un flujo de trabajo de alto rendimiento y reproducible permite la evaluación eficiente de compuestos para efectos renales.
- Análisis: La cuantificación de fluorescencia en plasma y el modelado de dos compartimentos proporcionan resultados robustos y comparativos.
- Investigación Translacional: El muestreo longitudinal no terminal se alinea con los diseños de estudios clínicos y las estrategias de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: El protocolo es adaptable a diversos modelos renales y estudios de intervención, lo que respalda una amplia utilidad en I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de función renal.
- Valor operativo: Optimiza el flujo de trabajo con manipulación mínima de animales, sin cirugía y con alta capacidad de procesamiento de muestras.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones sólidas de avance o interrupción y reduce el riesgo biológico en fases avanzadas en carteras de proyectos renales.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de candidatos a fármacos renales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de animales pequeños y en técnicas de inyección retrobulbar.
- Necesita acceso a espectrometría de fluorescencia de microvolumen y software de modelado analítico.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos en los tiempos de muestreo y en el análisis de datos.
- Es adaptable a diferentes modelos de ratón, pero puede requerir optimización para otras especies o contextos de enfermedad.
- La fotodegradación de la inulina marcada con FITC y el momento preciso de la recolección de sangre son fundamentales para la integridad de los datos.
