Un método de alto rendimiento para la medición de la tasa de filtración glomerular en ratones conscientes

El objetivo general de este procedimiento es mostrar a otros investigadores cómo determinar la función renal en ratones despiertos. Esto se logra dializando primero el isotiocianato de fluoresceína o la inulina FSE durante 24 horas y determinando su concentración para la inyección. El segundo paso es pesar el ratón, preparar volúmenes precisos de inulina fitzy para la inyección retrobulbar y anestesiar el ratón.

A continuación, se realiza la inyección de inulina Fitzy retrobulbar y se toman ocho muestras de sangre durante un período de 75 minutos. El paso final es medir Fitz Nulin utilizando un espectrómetro de fluorescencia de micro volumen y calcular la función renal empleando un modelo de decaimiento exponencial de dos fases. En última instancia, la combinación de la sensibilidad del método de inyección de bolo único de Fiti Nulin con la capacidad de microvolumen del espectrómetro de flúor permite detectar diferencias en la función renal causadas por modificaciones genéticas en ratones, cambios en la dieta o aplicaciones de medicamentos.

Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes como la infusión continua y las condiciones anestesiadas, la implantación de mini bombas osmóticas que utilizan inulina radiactiva son que no es necesaria cirugía. No es un experimento terminal. No es necesario recoger orina y es posible medir hasta 24 M por día.

Voy a demostrar este procedimiento junto con Maria Azimo, una investigadora asociada de mi laboratorio para preparar la solución inyectable de Fitzy Nulin. Pese suficiente inulina ZI para dos mililitros de una solución al 5%, disuelva la inulina marcada en una solución de cloruro de sodio al 0,85% calentándola a 90 grados centígrados hasta que se disuelva por completo. Coloque un trozo de membrana de diálisis de 20 centímetros en agua destilada doble durante 30 minutos para eliminar el ácido de sodio residual de la membrana, enjuague la membrana varias veces después, llene la membrana de diálisis con inulina fitzy disuelta, selle correctamente con cierres y luego pese toda la membrana.

Deje que la inulina fitzy disuelta se dialice en un litro de solución de cloruro de sodio al 0,85% y agite lentamente protegido de la luz durante 24 horas a temperatura ambiente después de la diálisis, vuelva a pesar toda la membrana de diálisis y calcule la nueva concentración. El agua se moverá osmóticamente hacia la membrana y el FSI no unido saldrá de la membrana. Por lo tanto, la concentración de inulina FSI disminuirá sustancialmente.

Calcule la nueva concentración de inulina fit e utilizando esta fórmula, donde C es la nueva concentración. N es la cantidad inicial de inulina E fit y V es el nuevo volumen, que es la diferencia de peso del tubo de diálisis antes y después de la diálisis, más el volumen de la solución inicial de inulina fitzy. A continuación, esterilice la solución dializada por filtración a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras.

Recuerde mantener siempre la inulina fitzy protegida de la luz para evitar el fotoblanqueo antes del experimento. Tome el peso corporal de los ratones después de anestesiar brevemente a los ratones con cuatro a 5% de flúor ISO. Verifique la profundidad de la anestesia aspirando dos microlitros por gramo de peso corporal de Nulin Fitzy dializado con una jeringa Hamilton de 100 microlitros con una aguja de calibre 26 de media pulgada de largo para eliminar las burbujas de aire, luego cambie a una aguja de calibre 30 de media pulgada de largo para la inyección.

Proceda a inyectar la inulina fitzy dializada en el plexo retroorbitario. Permita que los ratones se recuperen espontáneamente en su jaula doméstica. Cubra un milímetro de cola de ratón con tijeras una vez y recoja sangre en múltiples puntos de tiempo después de la inyección en mini capilares de heparina de sodio.

Selle los mini capilares después de la extracción de sangre con cha seal y mantenga las muestras protegidas de la luz. Coloque los mini capilares sellados dentro de los capilares del hematocrito y centrifugue durante cinco minutos después de la centrifugación. Rompa los mini capilares con un cortador de diamante y transfiera todo el plasma mediante pipeteo a un tubo de 0,2 mililitros.

Haga una dilución de uno a 10 usando dos microlitros de plasma y 18 microlitros de pilas de 0,5 moles por litro en un nuevo tubo de 0,2 mililitros. A continuación, mida dos microlitros de la muestra diluida con el NanoDrop 3, 300 en duplicados para un alto rendimiento de seis ratones. Siga el protocolo de diagrama de flujo proporcionado en el protocolo de texto para medir la TFG de riñón completo mediante el método de inyección en bolo único: se deben recolectar ocho muestras de sangre a las 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 y 75 minutos después de la inyección de FSE nulin.

En este diagrama de flujo, los números indican puntos de tiempo de recolección, mientras que los números entre paréntesis indican puntos de tiempo de número de muestra a la izquierda de la línea roja vertical que indican puntos de tiempo de inyección. Cada ratón está marcado con un color diferente. Para obtener recolecciones de sangre secuenciales, siga las flechas.

Los recuadros grises indican cuándo se debe preparar el próximo ratón para la anestesia con flúor antes de la inyección utilizando este protocolo. El tiempo mínimo entre dos recolecciones de sangre de diferentes ratones es de un minuto de solución inyectable diluida de fitzy nulin con plasma de ratón diluido para obtener las diluciones estándar enumeradas en el protocolo de texto. La concentración de los patrones dependerá de la diálisis y siempre será diferente para cada preparación de FSI nulina.

Por lo tanto, es necesario ingresar la concentración para la curva estándar cada vez. Analice los datos para calcular la tasa de filtración glomerular o TFG con el software adecuado mediante el uso de una función de decaimiento exponencial de dos fases, como se describe en detalle en el protocolo de texto para medir la TFG en ratones conscientes. La cinética plasmática de la inulina ZI después de una inyección intravenosa de dosis única se utiliza para el cálculo de GFRA, el modelo de dos compartimentos se emplea en el modelo de dos compartimentos.

La fase inicial de decaimiento rápido representa la redistribución de la inulina fitzy desde el compartimento intravascular al líquido extracelular. La fase posterior, con un decaimiento más lento en la concentración de inulina fitzy, refleja predominantemente el aclaramiento sistémico del plasma. La diabetes mellitus tipo uno fue inducida por la aplicación intraperitoneal de estreptozotocina.

Se determinó la TFG antes y cinco semanas después de la inducción de la diabetes, los animales diabéticos tipo uno muestran claramente hiperfiltración glomerular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la TFG en ratones grandes mediante el uso de una técnica de inyección de bolo único y el empleo de un modelo DK exponencial de dos fases.