Evaluación de la función renal en modelos de ratón de la enfermedad Glomerular

Este protocolo describe un work-up de riñón completo que debe ser llevado a cabo en modelos de ratón de la enfermedad glomerular. Los métodos permiten análisis funcional, estructural y mecánico de la función glomerular, que puede ser aplicado a todos los modelos de ratón de la enfermedad glomerular.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la enfermedad glomerular con respecto al fenotipo funcional y estructural del glomérulo y permite el análisis mecanicista de la patología renal. La principal ventaja de esta técnica es que es adaptable a todos los modelos de enfermedad glomerular. Para evaluar la proporción de creatinina albúmina en orina, coloque un ratón macho de seis a ocho semanas en una jaula metabólica para ratones que contenga agua y alimentos dietéticos de enriquecimiento en una habitación tranquila.

Después de seis horas, regrese el ratón a su alojamiento habitual y recoja un mínimo de 50 microlitros de la muestra de orina de referencia de cada jaula, repitiendo la recolección de orina de una vez por semana a una vez al mes. En el punto final experimental, extraiga los riñones del abdomen de cada animal y lave los órganos en PBS helado. Para examinar los glomérulos corticales, retire y corte en dados un polo de la corteza renal en pedazos de un milímetro cúbico.

Para examinar los glomérulos yuxtamedulares profundos, retire y corte en dados una pequeña sección de la médula en trozos de un milímetro cúbico. A continuación, coloque los fragmentos de cada sección de tejido en viales individuales de microscopía electrónica que contengan cinco mililitros de solución de glutaraldehído al 2,5% y almacene las muestras a cuatro grados centígrados. Para la histología de los glomérulos corticales y yuxtamedulares, extraer y fijar el tercio superior del riñón en cinco mililitros de paraformaldehído al 4% a cuatro grados centígrados durante 24 horas.

Luego, transfiera el tejido fijado a cinco mililitros de etanol al 70% durante 24 horas antes de incrustarlo en parafina. Para el análisis inmunofluoroquímico de los glomérulos corticales y medulares, coloque un tercio del riñón en un molde de tejido y sumerja el tejido en un compuesto a temperatura de corte óptima. Luego, coloque el molde sobre hielo seco hasta que el compuesto se congele y almacene las muestras a 80 grados centígrados hasta que se seccionen.

Para el análisis de proteínas, coloque trozos de corteza renal de tres por dos milímetros cúbicos en tubos de plástico de 0,5 mililitros y congele las muestras en nitrógeno líquido para almacenarlas a 80 grados centígrados. Para el almacenamiento de tejido a largo plazo para el análisis de ARN, después de la congelación instantánea de piezas de riñón de tres por dos milímetros cúbicos como se acaba de demostrar, agregue cinco volúmenes de solución de estabilización de ARNasa para el almacenamiento a 80 grados Celsius. Para el aislamiento de los glomérulos, corte el tejido renal restante y coloque los trozos de tejido en cinco mililitros de solución de ringer de mamíferos suplementada con albúmina sérica bovina al 1%, o BSA, en hielo para un tamizado inmediato.

Para aislar los glomérulos, apile los tamices con tamaños de poro de micras ascendentes en un vaso de precipitados de vidrio y coloque las rodajas de riñón en el tamiz superior de 425 micras de tamaño de poro. A continuación, utilice un émbolo de jeringa y una solución fresca helada de zumbidos de mamíferos suplementada con 1% de BSA para triturar el tejido renal a través del primer tamiz. A medida que se empujan los trozos de riñón, retire el tamiz superior y continúe empujando los fragmentos de riñón a través de cada tamiz por turno.

Cuando solo queden los tamices de 100 y 70 micras, transfiera la cosecha glomerular retenida por los dos últimos tamices a un tubo cónico de 50 mililitros con 10 mililitros de solución fresca de ringer de mamífero suplementada con 1% de BSA en hielo. Divida tres mililitros de la suspensión de glomérulos entre dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros y granule los glomérulos por centrifugación. Después de eliminar el sobrenadante, congele los glomérulos en nitrógeno líquido para un almacenamiento de 80 grados centígrados para la posterior extracción de proteínas y ARN.

A continuación, coloque la solución de glomérulos restante en un baño de agua a 37 grados centígrados para inyectarla en un equipo de permeabilidad al agua glomerular en una platina de microscopio óptico. Tras la captura de un glomérulo individual intacto, libere una cápsula de Bowman y fragmentos tubulares con una micropipeta, comience a grabar y perfunda el glomérulo con una solución de timbre fresca suplementada con BSA al 1%. Después de 30 segundos, cambie la perfusión a una solución concentrada de timbre BSA al 8%.

Después de 10 segundos de perfusión, vuelva a cambiar la perfusión a la solución del timbre BSA al 1% y detenga la grabación. Para una visualización detallada de las células glomerulares y la matriz residual, seque las muestras fijas de corteza renal incluidas en parafina a 37 grados Celsius durante una hora, seguido de desparafinación con xileno consecutivo e inmersiones descendentes en etanol. Rehidratar las muestras en agua destilada durante cinco minutos e incubar los portaobjetos en una solución de ácido peryódico en una cabina de gases.

Después de cinco minutos, enjuague los portaobjetos con tres lavados de cinco minutos en 100 mililitros de agua destilada, seguidos de una incubación de 15 minutos en el reactivo de Schiff. Al final de la incubación, lave los portaobjetos con agua corriente del grifo durante cinco minutos y contrarreste la mancha con hematoxilina durante tres segundos antes de enjuagar bien con agua corriente del grifo durante otros 15 minutos. Luego, deshidrate los portaobjetos con inmersiones ascendentes de etanol y dos inmersiones consecutivas de xileno de tres minutos.

Después del secado al aire, los portaobjetos se pueden montar con un medio de montaje a base de xileno para evaluar su estructura glomerular en un microscopio óptico con un aumento de 400x. Los ratones knockout con factor de crecimiento endotelial vascular, o VEGF-A, desarrollan albuminuria progresiva a las 10 semanas, en comparación con los controles de camada de tipo salvaje, mientras que los animales knockout con sobreexpresión de VEGF165b están protegidos de esta afección. Los ratones knockout de VEGF-A tienen una permeabilidad glomerular al agua significativamente mayor en comparación con los controles de tipo salvaje, que es parcialmente rescatada por la sobreexpresión de VEGF-A165b.

La tinción de Schiff con ácido peryódico de secciones de la corteza renal en ratones knockout de VEGF-A no revela ninguna anomalía estructural glomerular mediante análisis de microscopía óptica. Sin embargo, en el análisis de microscopía electrónica, los ratones knockout muestran un aumento en el ancho de la membrana basal glomerular, una disminución en el número de fenestras endoteliales, una disminución en la cobertura del espacio de los subpodocitos y un aumento en el ancho promedio de las hendiduras del podocito, mientras que el número promedio de rendijas permaneció sin cambios. La sobreexpresión de VEGF165b en los animales knockout de VEGF-A rescata los cambios en la membrana basal glomerular y el ancho de la hendidura.

Sin embargo, la sobreexpresión de VEGF165b no afecta a los números de fenestras alterados ni a la cobertura del espacio de los subpodocitos. El ARN extraído de glomérulos tamizados confirma la expresión del ARNm de VEGF165b humano en los ratones knockout con sobreexpresión de VEGF165b, correlacionándose con una disminución de la expresión de VEGFR2 en los ratones knockout de VEGF-A que es rescatada por la sobreexpresión de VEGF165b en el knock en animales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo completar un estudio renal completo para la evaluación de un modelo murino de enfermedad glomerular, incluida una evaluación de la permeabilidad glomerular tanto a la albúmina como al agua.