Cuantificación de la permeabilidad glomerular de macromoléculas fluorescentes mediante microscopía 2-Photon en Munich Ratas Wistar

El objetivo general de este procedimiento es visualizar con éxito la unidad de filtración de la nefrona y cuantificar la filtración de macromoléculas fluorescentes a través de la barrera de filtración hacia el espacio urinario in vivo. Esto se logra preparando primero la etapa del microscopio para el animal vivo. A continuación, se expone el riñón y se coloca la rata en el escenario.

A continuación, se identifican y mapean los glomérulos individuales y se adquieren imágenes 3D de fondo. Por último, se infunde albúmina fluorescente. Se adquieren volúmenes 3D de glomérulos individuales y se cuantifica la permeabilidad.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el coeficiente de filtración de macromoléculas a través de los glomérulos en el riñón mediante el uso de microscopía intravial de dos fotones. La principal ventaja de la microscopía de dos fotones es que permite la cuantificación simultánea tanto de la filtración glomerular como de la reabsorción tubular proximal y la transcitosis en el animal. Al mismo tiempo, las implicaciones de la técnica se extienden más allá de lo mecanicista hacia el diagnóstico y la terapéutica, ya que la importancia de comprender tanto el papel de la filtración glomerular como el tubular proximal.

La reabsorción de la albúmina es fundamental para determinar la orientación del tratamiento. Después de anestesiar a la rata, inserta una vía de acceso venoso permanente a través de la vena yugular o femoral y afeita el flanco izquierdo desde justo debajo de la caja torácica hasta justo por encima del muslo izquierdo. Esta es una cirugía que no es de supervivencia.

Coloca a la rata plana sobre su lado derecho de modo que el lado izquierdo afeitado quede hacia arriba. Asegúrese de que esté plano en el banco con su postura alargada y no agachada con las patas delanteras tocándose entre sí y las patas traseras tocándose muy suavemente. Palpa para palpar el riñón y determinar dónde se encuentra naturalmente dentro del retroperitoneo, y usa un rotulador para dibujar una línea recta paralela al cuerpo con un par de pinzas dentales.

Levante la piel y use un par de hemostáticos para pellizcar la piel a lo largo de la línea dibujada para triturar el tejido y evitar el sangrado con un par de tijeras quirúrgicas. Corte a lo largo de la incisión. Use el mismo procedimiento para cortar la capa muscular externa, que es delgada según sea necesario.

Use hemostáticos para prevenir el sangrado de la incisión en la capa muscular interna, que expondrá el peritoneo. Vuelva a palpar el riñón para estimar el tamaño. Pellizque una línea de incisión más pequeña que el riñón, asegurándose de que la incisión esté justo sobre el riñón.

Es mejor hacer esta incisión demasiado pequeña y hacerla más grande si es necesario. Ubique el riñón y use fórceps para agarrar la grasa circundante trabajando hacia el polo inferior del riñón con la mano sobre la mano. Una vez que se alcanza el polo inferior del riñón, tire suavemente del riñón a través de la incisión mientras aprieta muy suavemente por debajo del riñón para exteriorizarlo.

Si la incisión es demasiado pequeña, aplaste la capa muscular y corte para ensancharla. Repita el procedimiento para exteriorizar el riñón después de exteriorizar el riñón de la rata y colocar la rata en la platina del microscopio para la toma de imágenes. Si su microscopio está equipado con una platina motorizada capaz de marcar ubicaciones, utilizando una varilla de fluoresceína de doble paso, un filtro dominé y un objetivo de baja potencia, encuentre y centre glomérulos individuales, que aparecerán como estructuras circulares vacías rodeadas de túbulos proximales.

Con una autofluorescencia naranja amarilla inherente marca cada ubicación, cambie la torreta a un objetivo de inmersión en agua de mayor potencia y tome conjuntos de datos 3D de cada glomérulo. Asegurándose de que los bucles capilares y el espacio Bowman sean claramente visibles. El uso de una pseudo paleta de colores ayudará a visualizar estas estructuras.

A continuación, centrándose en un vaso sanguíneo superficial que infunde lentamente albúmina fluorescente, asegurándose de que se da tiempo para permitir la distribución sistémica de moléculas con un coeficiente de cing glomerular bajo o GSC, es esencial maximizar los valores de intensidad en el plasma, pero no alcanzar niveles que saturen los fotodetectores en el microscopio. Esto aumenta la detectabilidad de las moléculas filtradas Después de esperar aproximadamente 10 minutos para permitir que se eliminen los posibles fragmentos de peso molecular pequeño, adquiera volúmenes 3D a intervalos de una micra para utilizarlos en el cálculo de albúminas utilizando el software de procesamiento de imágenes metamórfica. Cargue los conjuntos de datos 3D junto con las imágenes de fondo de cada glomérulo en el volumen que contiene la albúmina fluorescente.

Localiza un bucle capilar superficial con suficiente espacio vacío entre sus márgenes definidos y el borde de la cápsula de Bowman. En el volumen de fondo. Localice el mismo plano focal, que debe contener todas las señales visuales de la imagen que contiene albúmina.

Seleccione una región dentro del bucle capilar de interés y anote la lectura de intensidad media. A continuación, seleccione una región dentro del espacio de Bowman y anote la lectura de intensidad media. Estos se utilizarán como valores de fondo para la cuantificación.

Seleccione la región similar dentro del espacio de Bowman en la imagen que contiene la albúmina. Haga esto para al menos otras dos regiones para adquirir un valor para la intensidad promedio dentro del espacio de Bowman. Seleccione el bucle capilar con la intensidad de plasma más brillante y dibuje una región a su alrededor.

A continuación, utilizando la función de umbral, resalte los valores brillantes dentro del plasma circulante, evitando las rayas oscuras que son los glóbulos rojos circulantes. Anote los valores de intensidad promedio del espacio de plasma seleccionado. Es importante seleccionar preferentemente las áreas brillantes del plasma porque los factores dentro de la sangre solo servirán para causar una subestimación de los niveles de fluorescencia plasmática.

Introduzca los valores en una hoja de cálculo de Excel para calcular el GSC, donde el GSC es igual a la diferencia del espacio bruto del arquero. Intensidad menos la intensidad del espacio de Bowman de fondo dividida por la diferencia entre la intensidad del bucle capilar bruto menos la intensidad del bucle capilar de fondo. La captación de albúmina fluorescente filtrada ocurre predominantemente en el segmento temprano de los túbulos proximales.

El S uno, este panel muestra una sección transversal de un glomérulo y un segmento S uno tomado de una rata apuntadora Munich Wistar, aproximadamente 20 minutos después de la infusión de un bolo RSA rojo Texas inicial. La apertura del espacio de Bowman y la ávida absorción de la albúmina en rojo se muestra en el segmento S uno. Este panel muestra una proyección 3D poco profunda de 20 micras del mismo conjunto de datos, y aquí se muestra una proyección de menor potencia tomada aproximadamente 60 minutos después de la infusión.

Estas imágenes demuestran que la microscopía intravital puede permitir la visualización del destino del material infundido después de la filtración, corroborando hasta cierto punto, que el coeficiente de filtración observado que se muestra aquí son imágenes tomadas desde el glomérulo superficial. Este panel es una imagen de fondo y esta imagen fue tomada unos 12 minutos después de la infusión de albúmina sérica de rata roja de Texas. Estos dos paneles están dibujados en pseudo color.

Se utilizan tres pequeñas regiones de interés dibujadas en el espacio de Bowman para calcular la intensidad media de la albúmina fluorescente que se ha movido a través de la barrera de filtración. Los valores de intensidad promedio para las regiones individuales se informaron en el área resaltada dentro del cuadro de diálogo mostrar estadísticas de región. El valor de GSC para la albúmina de 0,0111 derivado para este glomérulo individual se encuentra dentro de la escena de rango en esta cepa de ratas estrella de Munich cuando se alimentan.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis cuantitativo y cualitativo, sobre otras estructuras renales para responder a preguntas adicionales como el eventual tráfico de la macromolécula después de la filtración en el espacio urinario después de su desarrollo. Esta técnica permitió a los investigadores en fisiología renal explorar los procesos fisiológicos y fisiopatológicos dinámicos, no solo una vez, sino longitudinalmente. Con el tiempo, lo fue.