Análisis Transcriptomic de especímenes quirúrgicos retina humana usando Diario

El objetivo general de este procedimiento es purificar el ARN de muestras quirúrgicas de retina humana para el análisis del transcriptoma en el desprendimiento de retina. Para ello, los reactivos y materiales necesarios para la recogida de la muestra quirúrgica se preparan en el laboratorio y se envían al hospital. Durante el procedimiento quirúrgico, se recolecta la muestra y se devuelve al laboratorio.

A continuación, el ARN se purifica mediante un procedimiento estandarizado de gradiente de cloruro de cesio y se evalúa la calidad del ARN purificado. Finalmente. El análisis de la expresión de ARNm muestra que tanto la inflamación como la degeneración de los fotorreceptores están implicadas en el desprendimiento de retina indicado por cambios en la expresión de genes clave. En estos procesos identificados por análisis transcriptómico, la principal ventaja del journal sobre la purificación de orna existente como el cloro GTIN de extracción, también conocido como ole, es el resultado de que los orna no están contaminados con ADN.

La aplicación de esta técnica se extiende hacia las terapias del desprendimiento de retina debido a que proporciona medios técnicos para desarrollar nuevas terapias adyuvantes. Para cada muestra que se vaya a recoger, utilice una pipeta libre de ARN para llenar un tubo de fondo redondo de polietileno estéril estéril de cinco mililitros con 2,4 mililitros de una solución de cloruro de guina libre de ARN de seis molares. Use gas argón para llenar la parte superior de los tubos.

A continuación, coloque rápidamente la tapa presionando firmemente para asegurarse de que está sellada. Esto evitará la oxidación del cloruro de guine durante varios años de almacenamiento en el gabinete quirúrgico. A continuación, coloque cada uno de los tubos de cinco mililitros en un tubo de fondo cónico de polipropileno estéril de 50 mililitros.

Después de agregar un pañuelo y enroscar la tapa, coloque los tubos de 50 mililitros en una rejilla de poliestireno. Luego, coloque el estante y los sobres preparados, junto con los formularios de envío preparados, en una caja de cartón en el hospital. Lleve la caja de cartón del gabinete quirúrgico al quirófano.

Durante la cirugía, coloque la muestra de retina en un tubo lleno de cantidad y solución de cloruro. Cierre el tubo herméticamente. Mezcle el tubo brevemente.

A continuación, coloque el tubo en el balancín del tubo sanguíneo durante 10 minutos. Rellene el formulario de muestra adjunto con la identificación del paciente, la fecha de la cirugía y cualquier observación adicional. A continuación, escriba el número de identificación en el tubo de 50 mililitros numerado correspondiente.

Luego coloque el tubo de cinco mililitros con la muestra quirúrgica en el tubo de 50 mililitros. Reemplace el pañuelo de papel y tape el tubo. A continuación, coloque el tubo de 50 mililitros y el formulario de admisión de muestras en el sobre acolchado adecuado y séllelo.

Una vez recibida la muestra en el laboratorio, homogeneice la muestra en su tubo de cinco mililitros con un homogeneizador poly tron TM al máximo durante un minuto mientras mueve el tubo hacia arriba y hacia abajo. Una vez homogeneizada la muestra, para extraer los polisacáridos, añadir 270 microlitros de acetato potásico de dos molares y colocar el tubo en un agitador en posición horizontal. Agitar enérgicamente durante 10 minutos, luego centrifugar durante 10 minutos a 6, 500 G a 20 grados centígrados.

Después del centrifugado, utilice una pipeta para aspirar cuidadosamente la fracción soluble sin alterar el pellet. Transfiera el sobrenadante a un tubo libre de ARN estéril de 14 mililitros. Junto al sobrenadante, añadir 5,3 mililitros de 1% y Laurel Sarcosine en 100, milimolares tri, y 3,2 gramos de cloruro de cesio.

La sarcosina solubilizará la membrana y el cloruro de cesio se utiliza para generar un gradiente. Mezcle el tubo en vórtice durante un minuto. Agregue 1,8 mililitros de cloruro de cesio EDTA a un tubo de centrífuga de polímero estéril de 11 mililitros.

Luego, con una pipeta pastora estéril de 10 mililitros, coloque la solución de ARN en capas sobre la solución de cloruro de cesio EDTA dejando que corra por la superficie interior del tubo. Coloque los tubos en una centrífuga. Utilice un segundo tubo que contenga los tampones sin retina como equilibrio si es necesario, y centrifugue durante 24 horas a 225.000 G a 20 grados centígrados.

Al día siguiente. Después del centrifugado, se habrá formado una capa lipídica en la parte superior del tubo. El ADN estará en el medio y el ARN se granulará en la parte inferior del tubo.

Utilice una pipeta de pegadora estéril para retirar y desechar cuidadosamente la capa lipídica superior con una segunda pipeta de pasta estéril. Retire gradualmente la solución hasta que se aspire el ADN viscoso. Deseche la solución y el ADN.

A continuación, con una tercera pipeta de pastor estéril, retire y deseche la solución restante. Tenga cuidado de no alterar la bolita de ARN. Ahora, usando un bisturí esterilizado con llama, corte el tubo como se muestra aquí y deseche la parte superior.

Coloque la parte restante boca abajo sobre una gasa estéril. Invierta el tubo y use una pipeta para enjuagarlo delicadamente con 160 microlitros de cloruro de guine. Deje que el pellet se seque durante 10 minutos.

Una vez seco el pellet, se resuspende en 150 microlitros de tris, E-D-T-A-S-D-S. A continuación, agregue 150 microlitros de tris, EDTA y 30 microlitros de acetato de sodio de tres molares, y luego vórtice para precipitar el ARN. Agregue 900 microlitros de etanol 100% helado.

Agite el tubo y colóquelo sobre hielo derretido durante 30 minutos. A continuación, centrifugar el tubo durante 30 minutos a 18.000 G a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, una pequeña bolita blanca puede o no ser visible.

Ya sea que se pueda ver el pellet o no, aspire delicadamente el sobrenadante y deséchelo. Luego, para eliminar el exceso de sal, agregue 500 microlitros de temperatura ambiente, 70%etanol y vórtice, la centrífuga de tubo, el tubo durante 20 minutos a 18, 000 G a cuatro grados centígrados. Después de repetir el lavado y centrifugado con etanol al 70%, utilice una pipeta P 200 para eliminar cualquier resto de etanol.

Deje que el pellet se seque al aire durante 10 minutos. Vuelva a suspender el pellet en 50 microlitros de agua tratada, mezcle vigorosamente mediante vórtice durante dos minutos. A continuación, coloque la muestra en un baño de agua a 45 grados centígrados durante 15 minutos.

Para resuspender completamente el ARN. Finalmente determinar la concentración de ARN por absorbancia a 260 nanómetros y analizar el ARN por electroforesis en gel según el protocolo. En el documento adjunto, Para examinar el transcriptoma del desprendimiento de retina, se utilizó el procedimiento de la revista para recuperar y analizar el ARN de la retina de 18 pacientes con desprendimiento de retina y 18 controles de la misma edad preparados con retinas post-mortem.

Posteriormente, el ARN se purificó y analizó mediante electroforesis en gel y base de rettino, como se describe en este informe, aquí se muestran gráficos de radar que representan la expresión del gen quimiotáctico de monocitos M CP, un gen, CCL, dos. La parte derecha de la figura etiquetada RD corresponde al ARN de los pacientes con desprendimiento de retina, mientras que la parte izquierda etiquetada como N es ARN de los controles como se puede ver aquí. El desprendimiento de retina da lugar a la regulación positiva de CCL dos, como lo indican los altos valores de C en la mayoría de los especímenes de RD de la derecha en comparación con los de los controles de la izquierda.

Este aumento indica inflamación en los pacientes con desprendimiento de retina, como se puede ver aquí. La expresión del gen transductor del fotorreceptor GNAT uno disminuyó en comparación con CCL dos, los valores son bajos para los especímenes RD de la derecha, una disminución en la expresión del cono de onda corta opsina O PN un SW, y también se observó el gen homeo CRX, lo que sugiere la degeneración de los fotorreceptores tanto de los bastones como de los conos en pacientes con desprendimiento de retina. También se puede aplicar a otras patologías de la retina en modelos animales como las degeneraciones hereditarias de la retina.

Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque requiere conocimiento del ácido nucleico. Cy.Una demostración visual de este método es fundamental como una reacondicionamiento, que ARN después de la certificación es complicado.