Análisis Transcriptomic de especímenes quirúrgicos retina humana usando Diario
14 de agosto de 2013
Utilizamos muestras de la retina de retinectomía para un análisis transcriptomic de desprendimiento de retina. Hemos desarrollado un procedimiento que permite la conservación de RNA entre los bloques quirúrgicos y el laboratorio. Se estandarizó un protocolo para purificar el ARN mediante ultracentrifugación en cloruro de cesio para asegurar que los ARN purificados son adecuados para el análisis de microarrays.
El objetivo general de este procedimiento es purificar ARN a partir de especímenes quirúrgicos humanos de retina para el análisis del transcriptoma en el desprendimiento de retina. Para ello, se preparan en el laboratorio los reactivos y materiales necesarios para la recolección del espécimen quirúrgico, los cuales se envían al hospital. Durante el procedimiento quirúrgico, se recolecta el espécimen y se devuelve al laboratorio.
El ARN se purifica entonces mediante un procedimiento estandarizado de gradiente de cloruro de cesio y se evalúa la calidad del ARN purificado. En última instancia, el análisis de la expresión de ARNm muestra que tanto la inflamación como la degeneración de los fotorreceptores están implicadas en el desprendimiento de retina, indicado por cambios en la expresión de genes clave. En estos procesos identificados mediante análisis transcriptómico, la principal ventaja del método frente a las técnicas existentes de purificación de ARN, como GTIN clor a partir de extracción, también conocida como ole, es que el ARN resultante no está contaminado con ADN.
La aplicación de esta técnica se extiende hacia las terapias del desprendimiento de retina porque proporciona medios técnicos para desarrollar nuevas terapias adyuvantes. Para cada muestra que se recoja, utilice una pipeta libre de RNAsis para llenar un tubo estéril de polietileno de fondo redondo de cinco mililitros con 2,4 mililitros de una solución de cloruro de guanidinio seis molar libre de RNAsis. Use gas argón para llenar la parte superior de los tubos.
Luego, coloque rápidamente la tapa presionando firmemente para asegurar que quede sellada. Esto evitará la oxidación del cloruro de guanidina durante varios años de almacenamiento en el gabinete quirúrgico. A continuación, coloque cada uno de los tubos de cinco mililitros en un tubo estéril de polipropileno de 50 mililitros con fondo cónico.
Después de agregar el tejido y atornillar la tapa, coloque los tubos de 50 mililitros en una gradilla de poliestireno. Luego coloque la gradilla y los sobres preparados junto con los formularios de envío preparados en una caja de cartón en el hospital. Lleve la caja de cartón desde el armario quirúrgico hasta la sala de operaciones.
Durante la cirugía, coloque la muestra retiniana en un tubo lleno de solución de cantidad y cloruro. Cierre el tubo firmemente. Mezcle el tubo brevemente.
Luego, coloque el tubo en el agitador para tubos de sangre durante 10 minutos. Complete el formulario de muestra adjunto con la identificación del paciente, la fecha de la cirugía y cualquier observación adicional. A continuación, escriba el número de identificación en el tubo correspondiente de 50 mililitros numerado.
Luego, coloque el tubo de cinco mililitros con el espécimen quirúrgico dentro del tubo de 50 mililitros. Reemplace el papel absorbente y coloque la tapa del tubo. A continuación, coloque el tubo de 50 mililitros y el formulario de recepción de la muestra en el sobre acolchado correspondiente y séllelo.
Una vez que la muestra llegue al laboratorio, homogenice el espécimen en su tubo de cinco mililitros con un homogenizador Poly tron TM al máximo por un minuto mientras mueve el tubo hacia arriba y hacia abajo. Una vez homogenizada la muestra, para extraer los polisacáridos, añada 270 microlitros de acetato de potasio dos molar y coloque el tubo en un agitador en posición horizontal. Agite vigorosamente durante 10 minutos, luego centrifugue durante 10 minutos a 6 500 G a 20 grados Celsius.
Tras la centrifugación, utilice una pipeta para aspirar cuidadosamente la fracción soluble sin perturbar el precipitado. Transfiera el sobrenadante a un tubo estéril de 14 mililitros libre de RNAsas. Al lado del sobrenadante, añada 5,3 mililitros de Lauril Sarcosina al 1 % en Tris 100 milimolar y 3,2 gramos de cloruro de cesio.
La sarcosina solubilizará la membrana y el cloruro de cesio se utiliza para generar un gradiente. Mezcle el tubo mediante vortex durante un minuto. Añada 1,8 mililitros de cloruro de cesio EDTA a un tubo de centrífuga estéril de 11 mililitros de polímero.
Luego, con una pipeta Pasteur estéril de 10 mililitros, aplique la solución de ARN sobre la solución de cloruro de cesio con EDTA dejando que escurra por la superficie interna del tubo. Coloque los tubos en una centrífuga. Utilice un segundo tubo que contenga los tampones sin retina como contrapeso si es necesario, y centrifugue durante 24 horas a 225 000 ×g a 20 grados Celsius.
Al día siguiente. Tras la centrifugación, se habrá formado una capa lipídica en la parte superior del tubo. El ADN se encontrará en la parte media y el ARN estará sedimentado en el fondo del tubo.
Utilice una pipeta de Pasteur estéril para retirar cuidadosamente la capa lipídica superior con una segunda pipeta de Pasteur estéril y desecharla. Retire gradualmente la solución hasta que el ADN viscoso sea aspirado. Deseche la solución y el ADN.
Luego, utilizando una tercera pipeta Pasteur estéril, retire y deseche la solución restante, teniendo cuidado de no perturbar el pellet de ARN. Ahora, utilizando un escalpelo esterilizado con llama, corte el tubo como se muestra aquí y deseche la porción superior.
Coloque la parte restante boca abajo sobre gasa estéril. Invierta el tubo y use una pipeta para enjuagarla delicadamente con 160 microlitros de cloruro de guinea. Deje secar el precipitado durante 10 minutos.
Una vez que el precipitado esté seco, resuspéndalo en 150 microlitros de tris, E-D-T-A-S-D-S. A continuación, agregue 150 microlitros de tris, EDTA y 30 microlitros de acetato de sodio tres molar, y luego vortexee para precipitar el ARN. Añada 900 microlitros de etanol al 100 %, frío con hielo.
Vortex la tubo y colóquelo en hielo fundente durante 30 minutos. Luego centrifugue el tubo durante 30 minutos a 18.000 G a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, puede que sea visible o no un pequeño precipitado blanco.
Independientemente de si el precipitado es visible o no, aspire con cuidado el sobrenadante y deséchelo. Luego, para eliminar el exceso de sal, agregue 500 microlitros de etanol al 70 % a temperatura ambiente y mezcle mediante vortexeo; centrifugue el tubo durante 20 minutos a 18 000 ×g y 4 °C. Después de repetir la lavada con etanol al 70 % y la centrifugación, utilice una pipeta P200 para eliminar cualquier resto de etanol.
Deje secar el pellet al aire durante 10 minutos. Re suspenda el pellet en 50 microlitros de mezcla de agua tratada con dey agitando vigorosamente en vórtex durante dos minutos. Luego, coloque la muestra en un baño de agua a 45 grados Celsius durante 15 minutos.
Para resuspender completamente el ARN. Finalmente, determinar la concentración de ARN mediante absorbancia a 260 nanómetros y analizar el ARN mediante electroforesis en gel según el protocolo. En el documento adjunto, para examinar el transcriptoma del desprendimiento de retina, se utilizó el procedimiento de la revista para recuperar y analizar ARN retiniano de 18 pacientes con desprendimiento de retina y 18 controles emparejados por edad, preparados utilizando retinas post mortem.
El ARN se purificó posteriormente y se analizó mediante electroforesis en gel y base rettino como se describe en este informe. Aquí se muestran gráficos de radar que representan la expresión del gen quimiotáctico de monocitos MCP-1, CCL2. La parte derecha de la figura, etiquetada como RD, corresponde a ARN de pacientes con desprendimiento de retina, mientras que la parte izquierda, etiquetada como N, corresponde a ARN de los controles, como puede observarse aquí. El desprendimiento de retina provoca la sobreexpresión de CCL2, indicada por los altos valores de C en la mayoría de las muestras de RD a la derecha en comparación con las de los controles a la izquierda.
Este aumento indica inflamación en los pacientes con desprendimiento de retina, como se puede observar aquí. La expresión del gen transducina de los fotorreceptores en bastones GNAT1 se redujo, a diferencia de CCL2; los valores son bajos para las muestras de DR a la derecha, al igual que la expresión de la opsina de conos de onda corta OPN1SW, y también se observó una disminución en la expresión del gen homeo CRX, lo que sugiere una degeneración de los fotorreceptores, tanto de bastones como de conos, en pacientes con desprendimiento de retina. Este método puede proporcionar información sobre los cambios en la expresión génica tras el desprendimiento de retina. Asimismo, puede aplicarse a otras patologías retinianas en modelos animales, como las degeneraciones retinianas hereditarias.
Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque requiere conocimientos sobre ácidos nucleicos. Una demostración visual de este método es fundamental como repaso, ya que el manejo del ARN tras la certificación es complicado.
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Descripción general
Este estudio se centra en la purificación de ARN a partir de especímenes quirúrgicos humanos de retina para analizar el transcriptoma en casos de desprendimiento de retina. Se utiliza un procedimiento estandarizado con gradiente de cloruro de cesio para garantizar la calidad del ARN destinado a análisis posteriores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología retiniana
- Transcriptómica
Antecedentes
- El desprendimiento de retina puede provocar una pérdida significativa de la visión.
- Comprender los cambios en la expresión génica es fundamental para desarrollar estrategias terapéuticas.
- La calidad del ARN es esencial para un análisis transcriptómico preciso.
- Los métodos existentes de purificación de ARN pueden provocar contaminación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para la purificación de ARN a partir de muestras de retina.
- Analizar la expresión de ARNm relacionada con el desprendimiento de retina.
- Evaluar la participación de la inflamación y la degeneración de los fotorreceptores.
Métodos Utilizados
- Recolección de muestras de retina durante la retinectomía.
- Preparación de reactivos y materiales para la extracción de ARN.
- Procedimiento estandarizado de gradiente de cloruro de cesio para la purificación de ARN.
- Evaluación de la calidad del ARN para análisis con microarreglos.
Resultados principales
- Identificación de cambios clave en la expresión génica asociados con el desprendimiento de retina.
- Evidencia de inflamación y degeneración de fotorreceptores en el análisis transcriptómico.
- Demuestra que el nuevo método evita la contaminación con ADN.
- Calidad mejorada del ARN, adecuada para análisis mediante microarreglos.
Conclusiones
- El método de purificación de ARN desarrollado es efectivo para muestras de retina.
- El análisis transcriptómico proporciona información sobre los mecanismos del desprendimiento de retina.
- Estudios futuros pueden aprovechar este método para investigaciones adicionales sobre enfermedades de la retina.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El desprendimiento de retina desencadena una inflamación concurrente y la degeneración de los fotorreceptores, creando un entorno fisiopatológico complejo que complica el desarrollo de terapias. El método jouRNAl permite un perfilado transcriptómico de alta fidelidad de muestras de retina humana descartadas quirúrgicamente, proporcionando una fuente escalable de tejido relevante para la enfermedad, útil para la validación de dianas terapéuticas. Este enfoque facilita la reducción del riesgo mecanicista al vincular firmas moleculares con fenotipos clínicos, orientando las decisiones de avance o interrupción en las líneas de desarrollo oftalmológico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la detección simultánea de vías inflamatorias y degenerativas en tejido retiniano humano.
- Valor operativo: Convierte especímenes quirúrgicos descartados en sistemas biológicos validados, reduciendo la dependencia de modelos animales para la evaluación temprana de objetivos terapéuticos.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al proporcionar datos de expresión derivados de humanos sobre CCL2, GNAT1, OPN1SW y CRX como biomarcadores de la progresión de la degeneración retiniana (RD).
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona ARN libre de ADN adecuado para microarreglos y RT-PCR, asegurando la especificidad del ensayo en las mediciones de expresión génica.
- Valor operativo: El protocolo estandarizado de gradiente de cloruro de cesio garantiza la reproducibilidad entre lotes y sitios, permitiendo campañas de cribado escalables.
- Preparación para ensayos: La calidad del ARN purificado se valida mediante electroforesis en gel y absorbancia, lo que permite una evaluación confiable de compuestos en cribados fenotípicos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Une el descubrimiento y el trabajo preclínico mediante el uso de especímenes retinianos humanos para validar hallazgos en modelos animales de degeneración retiniana hereditaria.
- Alineación de Biomarcadores: Identifica la sobreexpresión de CCL2 y la subexpresión de genes de fotorreceptores como firmas trasladables para el monitoreo terapéutico.
- Avance Ajustado al Riesgo: Proporciona una comprensión mecanicista de la progresión de la degeneración retiniana, orientando el diseño de ensayos clínicos estratificados por biomarcadores.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método jouRNAl se integra en el continuo de descubrimiento desde la identificación temprana de objetivos hasta la validación preclínica, permitiendo la reducción de riesgos basada en tejido humano antes de la optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre vías de inflamación y degeneración mediante análisis transcriptómico de muestras retinianas humanas.
- Tamizaje: Proporciona salidas de ARN cuantitativas y estandarizadas adecuadas para perfiles de expresión génica de alto rendimiento.
- Análisis: Genera lecturas cuantificables (por ejemplo, regulación positiva de CCL2, regulación negativa de GNAT1) que permiten comparaciones entre diferentes condiciones y la priorización de objetivos.
- Investigación Traducional: Conecta los datos de muestras humanas con la continuidad preclínica al permitir análisis comparativos en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la extracción de ARN a partir de tejidos quirúrgicos, aplicable a diversas patologías retinianas y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la transcriptómica directa de tejidos humanos.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y reproducibilidad mediante la purificación con cloruro de cesio, minimizando la variabilidad entre lotes en estudios multisitio.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar evidencia molecular derivada de humanos, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas de los programas de oftalmología.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas terapéuticas basada en firmas concurrentes de inflamación y degeneración en muestras derivadas de pacientes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de ácidos nucleicos y en técnicas de ultracentrifugación en gradiente.
- Depende del acceso a cloruro de cesio, ultracentrífugas e infraestructura de laboratorio libre de RNasas.
- Necesita una estandarización entre equipos quirúrgicos, de patología y de biología molecular para el seguimiento de las muestras.
- La adaptación a otros tipos de tejido puede requerir la optimización de los pasos de homogenización y lisis.
- Limitación práctica: el rendimiento de ARN depende de la transferencia oportuna de las muestras y de evitar la exposición a RNasas durante la recogida quirúrgica.
