Técnicas de Procesamiento de ojos implantados con una prótesis de retina para el análisis histopatológico localizada

El objetivo general de este procedimiento es mejorar la evaluación de la seguridad de las prótesis de retina. Esto se logra marcando primero la superficie de un ojo enucleado fijado de manera óptima con tintes tisulares para indicar la posición de un electrodo implantado. En el segundo paso, se retira la guía de electrodos y el tejido ocular se disecciona en tiras.

A continuación, las tiras se estabilizan en agar y luego se incrustan en parafina. En el paso final, las áreas de interés marcadas se seccionan y se recogen en portaobjetos para su tinción. En última instancia, la salud de las áreas implantadas adyacentes a cada electrodo se puede evaluar mediante microscopía de campo claro e inmunofluorescencia.

La principal ventaja de esta técnica es que el artefacto relacionado con la fijación y la delaminación se pueden minimizar, mientras que las regiones de tejido adyacentes al electrodo se pueden rastrear con precisión en muestras grandes. También se puede utilizar para evaluar la seguridad de nuevos implantes para otras enfermedades oculares. Por lo general, las personas nuevas en este método lo encontrarán desafiante porque una retina es propensa a la delaminación y se requiere un alto nivel de destreza para manejar las muestras.

La demostración visual de este método es importante porque el marcado y la manipulación del tejido frágil son difíciles de aprender. Antes de este estudio, después de la implantación con una guía de electrodos supracoroideos, los ojos se procesaron previamente utilizando una técnica no óptima según lo indicado por la estrella. Esta primera imagen muestra una sección ortogonal representativa a través de la cavidad de la guía de electrodos.

Tenga en cuenta que la retina se desprende del tejido externo del ojo. Esto es particularmente evidente debajo de la región implantada, como lo indica la punta de flecha. Nótese también que no es posible determinar qué parte de la retina estaba adyacente a cada electrodo individual de la matriz.

En este aumento más alto, hay varios artefactos basados en la liberación regular en las capas de la retina como lo indican las puntas de flecha, así como un desprendimiento importante de la capa de torpedos, la capa reflectante en el ojo felino. Sin embargo, tras un aumento adicional, se puede observar que los segmentos externos de los fotorreceptores, así como el epitelio pigmentado, permanecen intactos, lo que sugiere que los desprendimientos observados anteriormente o los efectos secundarios artifactuales del procesamiento son el resultado de un trauma o patología in vivo. Por lo tanto, se implementó la siguiente técnica para minimizar estos artefactos relacionados con la fijación y la delaminación.

Después de nuclear y fijar los ojos, comience por extraer un globo ocular implantado de etanol y recortar cuidadosamente el exceso de tejido, incluida la conjuntiva y la cápsula del tendón. Recorta el nervio óptico a una longitud de dos a tres milímetros. La guía de electrodos es visible a través de la esclerótica semitranslúcida.

A continuación, utilice un pincel de punta fina para aplicar cuidadosamente los tintes histológicos al tejido y etiquetar los electrodos con un código de color predefinido. Teniendo cuidado de no manchar el tinte. Se puede hacer un marcado de tinte adicional para definir puntos de interés o ayudar a alinear secciones.

Aquí, los electrodos estimulados al máximo se han marcado con verde. Los otros electrodos activos han sido marcados con rojo. Los electrodos de retorno de mayor diámetro se han coloreado de amarillo, y las guías adicionales o marcas anatómicas se han etiquetado con tinte azul.

Después de cinco minutos de secado al aire, devuelva el globo al 70% de etanol para deshidratar el tinte. Luego, después de recortar el exceso de tejido del globo ocular de control no plantado como se acaba de demostrar, use las ocho suturas de nailon adjuntas durante el paso de nucleación y fijación para alinear los ojos de control e implantados como un par de espejos. A continuación, coloque una plantilla de silicona con las mismas dimensiones que la guía de electrodos en una ubicación reflejada en el control I correspondiente a la ubicación de la guía en el ojo implantado.

A continuación, etiquete el globo de control como se acaba de demostrar, de modo que cada sitio de electrodo implantado tenga un par de control en una ubicación anatómicamente comparable. A continuación, retire la matriz de implantes del ojo y luego retire la parte frontal del ojo, incluida la córnea, el iris y el cristalino. A continuación, retire el líquido vítreo de la copa ocular restante.

Ahora disecciona el ojo implantado en múltiples tiras de dos milímetros de grosor. Cada uno contiene un subconjunto de las regiones marcadas con troquel. La orientación de las tiras debe seleccionarse para ayudar en la evaluación de varios aspectos de la respuesta del tejido al implante, documentar cuidadosamente la posición de las marcas del troquel en las muestras para futuras referencias.

A continuación, coloque la tira con el lado a cortar primero hacia abajo en un charco poco profundo de agar licuado. Una vez que el agar se haya endurecido, corte alrededor de la muestra y colóquela en un casete de papel sostenido por inserciones de espuma. Después de diseccionar e incrustar el ojo de control, coloque los casetes en formina tamponada neutra y procéselos durante la noche mediante una técnica estándar de procesamiento de parafina automatizada de 12 horas.

Al día siguiente, incruste el tejido procesado en parafina con el lado a cortar primero hacia abajo. Ahora, corta los bloques de parafina en secciones de cinco micras. A continuación, monta las secciones de cada una de las regiones teñidas en portaobjetos.

Para localizar la región DY, revise regularmente los portaobjetos bajo un microscopio. Las regiones inmediatamente adyacentes a cada punto teñido de la esclerótica serán aquellas que estaban más cerca del electrodo correspondiente de la matriz. Finalmente, tiñe las secciones como desees.

Alto rango dinámico. Se muestran macrofotografías de un ojo felino enucleado con una guía de electrodos supracoroideos in situ después de la fijación con el fijador de Davidson y antes de la extracción de la matriz. La esclerótica translúcida permite la visualización de los electrodos individuales en la matriz.

Como se indica con la punta de flecha, los electrodos están marcados con un esquema de color de tinte predefinido. Estas marcas de tinte colocadas con un espaciado regular de los puntos de referencia anatómicos se utilizan para mantener la coherencia en todos los experimentos. Tras la extracción de la guía de electrodos, el ojo se disecciona a mano en tiras de muestra.

Las puntas de flecha indican dos de los sitios adyacentes del electrodo en la esclerótica. La línea discontinua indica el plano de seccionamiento en esta sección representativa obtenida del corte de la muestra de la figura anterior, la forma bruta de la tira de muestra se conservó con artefactos tisulares diferenciales mínimos. Ambas marcas de tinte todavía son visibles en la esclerótica, como lo indican las puntas de flecha.

Aunque el tinte verde era más resistente que el rojo, la ubicación del tinte indica la posición de un electrodo. Por lo tanto, el tejido retiniano adyacente puede ser evaluado por el daño, si lo hubiera, causado por la estimulación eléctrica como se ve en esta ampliación, las capas retinianas adyacentes al tinte verde visto en la imagen anterior no se desprendieron de hecho, y la morfología retiniana se conservó aquí. En esta primera imagen se muestran la tinción especial representativa y la inmunohistoquímica de secciones de tejido de la retina procesadas según el protocolo actual.

La hematina tiñó los núcleos celulares de azul, mientras que la eoína tiñó el citoplasma celular, el colágeno y el tejido de soporte, varios tonos de rosa En esta imagen, el azul rápido luxal tiñó la mielina de azul. La contratinción violeta crestal se utilizó para identificar las células ganglionares tiñendo los cuerpos de los misiles dentro del azul périco y resaltando las células satélite circundantes. En esta sección tratada con azul trione de albañil, la solución de fusión de ácido escarlata BRIC tiñó las fibras musculares de rojo, mientras que el azul linado tiñó el colágeno.

En este caso, el azul de la esclerótica para esta sección teñida por ácido peryódico, los componentes glicoproteicos de la membrana basal y los componentes del tejido conectivo aparecen de color púrpura, mientras que los núcleos de las células de contratinción de hemat toin aparecen de color azul. La sección subescleral que se muestra en esta imagen fue tratada con azul de Prusia perlado en el sitio de la hemorragia. La formación de hemosiderina a partir de glóbulos rojos degradados y la liberación de complejos de hierro produjeron un color púrpura.

La adición de rojo neutro tiñó los lisosomas de rojo en esta imagen, la síntesis anti glutamina se tiñó. Esta enzima degradadora de neurotransmisores que se encuentra en las células de Mueller en verde se extiende en ambas direcciones con los cuerpos de las células de Mueller dentro de la capa nuclear interna y la alimentación del extremo de la célula de Mueller formando la membrana limitante interna para la tinción de la proteína del neurofilamento. Esta proteína del citoesqueleto de cadena pesada se etiquetó como verde que se encuentra en el soma de la célula y procesa los enlaces cruzados de la proteína del neurofilamento con otros neurofilamentos para mantener la estructura de las neuronas.

Las células ganglionares y sus axones se pueden observar en las capas de células ganglionares y fibras nerviosas, mientras que los axones de las células horizontales ubicadas en el borde exterior de la capa nuclear interna en la retina felina aparecen de color verde. En esta imagen final, la proteína ácida fibrilar glial se muestra esta proteína citoesquelética en rojo, prolifera en las células de Mueller y los astrocitos durante la gliosis y se puede ver recubriendo la capa de fibra nerviosa con células de Mueller formando extensiones delgadas a través de las capas internas y externas de la retina. La contratinción con un DPI en azul permite la visualización de las capas de la retina.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar visualizar un flujo de trabajo de muestra en tres dimensiones y considerar regularmente la orientación de las muestras a lo largo del procedimiento. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar todos los métodos histológicos para responder a preguntas adicionales relacionadas con la seguridad después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el desarrollo del ojo biónico evaluaran los niveles de estimulación seguros a largo plazo para los pacientes ciegos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la seguridad de un implante de ojo biónico.