Metabolómica no focalizados de fuentes biológicas Uso UltraPerformance cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS)

Untargeted metabolómica ofrece una hipótesis de generación instantánea de un perfil metabólico. Este protocolo se demostrará la extracción y el análisis de los metabolitos de las células, suero, o tejidos. Una gama de metabolitos se examinó utilizando extracción en fase líquido-líquido, microflujo UltraPerformance cromatografía líquida / de alta resolución de la espectrometría de masas (UPLC-HRMS) acoplado al software de análisis diferencial.

El objetivo general del siguiente experimento es comparar instantáneas de los perfiles metabólicos de diferentes grupos de muestras biológicas. Esto se logra mediante el uso de una extracción líquida para separar las moléculas orgánicas y polares. Como segundo paso, las moléculas se separan aún más mediante cromatografía líquida y se analizan mediante espectrometría de masas de alta resolución, que proporciona datos de tiempo de retención, relación masa-carga e intensidad para su posterior análisis.

Las siguientes series de cromatografía líquida se alinean y las características se detectan, cuantifican y clasifican. Con el fin de identificar características diferencialmente abundantes entre los grupos. Los resultados muestran las diferencias en las características entre las condiciones de tratamiento en función de la abundancia diferencial de analitos detectados por cromatografía líquida y espectrometría de masas de alta resolución.

Aunque este método se puede utilizar para estudiar el metabolismo celular, también puede proporcionar información sobre el descubrimiento de biomarcadores o el metabolismo zenobiótico. Para las líneas adherentes, agregue 1,5 mililitros de medio a las celdas en una placa de 10 centímetros. Coloque el plato sobre hielo y raspe suavemente para levantar las células.

Transfiera los 1,5 mililitros de suspensión de celda levantada a un tubo de centrífuga de vidrio de 10 mililitros preetiquetado. A continuación, agregue seis mililitros de metanol de cloroformo de dos a uno a cada uno de los tubos de vidrio de 10 mililitros que contienen las muestras. Agite las muestras a baja velocidad durante 30 minutos Después de agitar, centrifugar las muestras con un ajuste de desaceleración de baja aceleración a 1.935 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para separar completamente las fases con una pipeta de pasto de tallo largo.

Transfiera la capa orgánica a un nuevo tubo de centrífuga de vidrio de 10 mililitros preetiquetado. A continuación, transfiera la capa acuosa a un tubo de plástico limpio de dos mililitros de einor. En este punto, evapore las muestras orgánicas y acuosas bajo gas nitrógeno.

Reconstituya las muestras secas en 50 a 100 microlitros de la solución inicial para el método UPLC deseado. Pipetear suavemente la muestra hacia arriba y hacia abajo para ayudar a disolver los analitos. A continuación, transfiera cada muestra a un filtro de tubo de nailon de 0,22 micras y centrifuga hasta 14.000 veces G durante aproximadamente cinco minutos hasta que la muestra haya pasado completamente por el filtro.

Inspeccione la muestra para asegurarse de que no queden precipitados visibles en la muestra. Transfiera el sobrenadante de la muestra filtrada a un vial UPLC preetiquetado con tapa insertable en el vial. A continuación, gírelo para eliminar las burbujas del fondo del vial de muestra.

Coloque la muestra en el muestreador de autos refrigerados. A continuación, cree una tirada para la muestra orgánica utilizando el software de control del cromatógrafo de líquidos. A continuación, cree una ejecución para la muestra orgánica basada en las condiciones UPLC optimizadas.

Utilice las condiciones UPLC optimizadas para crear también un método para la fase acuosa. Si un conjunto conocido de analitos objetivo es de gran interés, optimice las condiciones de UPLC utilizando el análogo marcado pesado de estos compuestos y genere un método. Usando estas condiciones, permita que el UPLC se equilibre adecuadamente.

Antes de colocar una columna y seguir las instrucciones del fabricante para equilibrar el volumen de una nueva columna, mantenga un registro de las contrapresiones iniciales para ayudar a diagnosticar problemas futuros utilizando el software de control para el espectrómetro de masas de alta resolución. Cree un método de modo positivo. A continuación, utilizando las mismas condiciones, cree un método de modo negativo.

Limpie y calibre el instrumento. Establezca una pulverización estable en el espectrómetro y deje tiempo para que la solución de calibración se disipe adecuadamente de la fuente y la óptica. La estabilidad aceptable de la pulverización debe proporcionar una desviación estándar relativa de la intensidad del tres al 5% en al menos 100 exploraciones con la inyección de solución de calibración al mismo caudal que el método lc que se está utilizando.

Utilizando un generador de números aleatorios y una clave, configure las muestras de forma aleatoria para evitar cualquier efecto de lote introducido por el análisis. Configure la secuencia para todas las muestras. Ajuste el volumen de inyección adecuado y ejecute un blanco antes de la primera muestra.

Si se sospecha de efectos de arrastre o matriz entre las muestras, ejecute blancos o lavados adecuados, comience la secuencia y monitoree periódicamente los problemas, incluidas las fluctuaciones de presión o la pérdida de intensidad de la señal a lo largo de la ejecución. Si se detectan problemas graves, detenga la ejecución. Limpie y calibre el instrumento.

Establezca una pulverización estable en el espectrómetro y deje tiempo para que la solución de calibración se disipe adecuadamente de la fuente y la óptica. Antes de comenzar el análisis diferencial, verifique manualmente las corrientes iónicas totales o observe los cromatogramas filtrados para cualquier compuesto conocido en la muestra. Para garantizar la reproducibilidad de las corridas y la estabilidad de la pulverización de corte UPLC en todas las muestras, transfiera los archivos de datos RAW desde el espectrómetro de masas al disco duro de la estación de trabajo donde está instalado el tamiz.

Tamiz abierto. Comience un nuevo experimento y cargue los archivos apropiados en Sieve. Asigne grupos de comparación y seleccione un único archivo de referencia para permitir que SIE V genere los parámetros para el análisis.

Siga las indicaciones y ajuste los parámetros según los requisitos de cualquier experimento individual. Cargue la lista de aductos correcta para el modo positivo o negativo en los parámetros. Una vez finalizado el análisis, compruebe que se ha rellenado una lista de fotogramas en la pantalla.

Asegúrese de que la alineación lc se superponga a los picos de referencia. Si alguna de las corridas de lc no alineadas muestra una gran desviación en los picos de referencia. Esto puede indicar un problema con la muestra.

Grafique los datos por coeficiente de variación dentro de una población de muestra similar. Ordene la lista en función de las características deseadas. A continuación, examine cada pico para ver si hay una alineación de picos adecuada entre los grupos.

Integración de picos, gaussianos, intensidad de señal en forma de pico, isótopos y asignación de aductos. Exporte los datos que desee para su posterior análisis o para generar listas de masas específicas para la confirmación y la EM hasta el final de los experimentos. Se identificó un gran número de aciertos por los dos programas utilizados para los puntos verdes diferenciales que son características más abundantes en el control, mientras que los puntos rojos son más abundantes en el tratamiento.

Un tamaño de punto más grande indica una mayor magnitud de cambio de pliegue entre los grupos y la intensidad del color demuestra un valor P decreciente con una saturación creciente del color en la imagen. Aquí están los cromatogramas que muestran el modo de iones positivos de fase orgánica UPLC MS La ventana de análisis A muestra la corriente iónica total de S Civ 2.0. El cromatograma iónico extraído para la característica identificada como D paneth por XCMS se muestra en la ventana B.La ventana C muestra el cromatograma iónico extraído para la característica identificada como podredumbre conocida de sve.

La ventana D muestra el cromatograma iónico extraído para la característica identificada como podredumbre conocida a partir de sve normalizada a la corriente iónica total. Una característica diferencialmente abundante y reducida en el grupo tratado con podredumbre conocida se identificó tentativamente como d panadina mediante una búsqueda precisa en bases de datos masivas. La identidad del analito se confirmó con espectrometría de masas en tándem U-P-L-C-H-R.

Aquí se muestra una comparación de los cromatogramas y espectros de masas de la muestra y el compuesto puro. No olvide que trabajar con cloroformo puede ser extremadamente peligroso y se deben seguir las precauciones adecuadas, como una campana extractora bien ventilada.