מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין אינטראקציות של תאי אנדותל תאי גזע in vivo. זה מושג על ידי החדרת קטטר עורק הירך לבעל חיים מורדם לגישה תוך עורקית. במהלך השלב השני, שריר הכרומה מוכן בניתוח למיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיונית.

לאחר מכן, אוכלוסיית תאי הגזע המעניינת מוזרקת דרך צנתר עורק הירך. בסופו של דבר, ניתן לדמיין ולכמת את האינטראקציות בין תאי הגזע המועברים באימוץ לבין האנדותל של המיקרו-סירקולציה של שריר המאסטר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כגון כיצד מווסתת הנדידה של תאי גזע המיושמים באופן טיפולי בתוך אורגניזם חי?

לפני תחילת המיקרו-כירורגיה D air, צנתר מחובר למזרק מיליליטר אחד עם 0.9% נתרן כלורי. לאחר מכן גלח בעדינות את ההיבט הקדמי של שק האשכים הימני, כמו גם את הירך והמפשעה הימנית של עכבר זכר מורדם במשקל 20 עד 25 מיליגרם. אספו את כל השיער הרופף בעזרת צמר גפן לח, ולאחר מכן הניחו את הצד הגחוני של העכבר כלפי מעלה על פרספקס, במת צפייה בהתאמה אישית המורכבת מלוחית בסיס וצלחת שנייה בקצה הקפיצה של לוחית הבסיס להגבהה של שתי הרגליים האחוריות ושק האשכים.

לאחר קיבוע כפות הרגליים עם וילון אלסטי, הניחו את הבמה על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה על 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן באמצעות הגדלה של פי 10 עד 16, השתמש במיקרוסקופ דיסקציה ובמספריים כדי לבצע חתך ראשוני בירך ימין, ממש בחלק הקדמי של כלי הירך מהברך ועד המפשעה. זהה את עורק הירך ועקוב אחריו באופן קרוב, תוך גיוס העורק מהרקמה הרכה שמסביב.

לאחר מכן בעזרת צריבה תרמית, זהה וחתוך ענף עורקי גדול המוביל לאשך השמאלי. הנח תפר שהייה של שש או פרולן באופן שטחי באשך השמאלי. לאחר מכן זהה וצרוב את ענף העורק הגדול העובר באופן מדיאלי בירך.

לאחר מכן, בעזרת מתיחה עדינה, קשרו את עורק הירך בחלק הדיסטלי של הירך הימנית, ואז הניחו תפר סביב עורק הירך הפרוקסימלי קרוב ככל האפשר למרכז החיה. כעת, הניחו קשר רופף סביב עורק הירך, אך אל תקשרו אותו. לאחר מכן יש למרוח מתיחה עדינה על התפר כדי ליצור כיווץ עורקי.

לאחר ביסוס הכיווץ, השתמש בזוג מספריים מיקרו כדי לגודל בזהירות את העורק, תוך הקפדה מיוחדת לא לפגוע בווריד הירך. לאחר מכן, הכנס את המיקרו-קטטר שהוכן בעבר לחתך. משחרר בזהירות את הכיווץ כדי להקל על מעבר הקטטר.

זרימת הדם העורקית צריכה להיות גלויה מיד בתוך הצנתר. התקדם לאט את הקטטר כמה מילימטרים מעבר לקיפול הקודם. לאחר מכן קשרו את הקשירה המוכנה לקיבוע הקטטר.

כעת שטוף בעדינות את הקטטר עם הנתרן הכלורי ולאחר מכן שאב את התמיסה כדי לאשר את המיקום הנכון של הצנתר. השתמש בפיסת סרט כדי לאבטח עוד יותר את הקטטר לשלב הפעולה. לאחר שהקטטר תוקן כראוי והוזז הצידה, חתוך את העור והפאשיה מעל ההיבט הגחוני של שק האשכים הימני.

הקפד לא לגעת ברקמה הבסיסית עם מכשירים כלשהם. הרחב את החתך עד לקפל המפשעתי ובקלילות לקצה הדיסטלי של שק האשכים. לאחר מכן הפרד בזהירות את הרקמות הרכות והחיבוריות הבסיסיות מעל שק הקרמאסטר מבלי לגעת ברקמה עצמה.

לאחר מכן הנח תפר שהייה של שש או פרולן בקצה הדיסטלי של הקרמאסטר כדי להאריך מעט את השריר. לאחר מכן, משוך בעדינות את השריר בקלילות וקדימה כדי לכרות את הרקמה הרכה שנותרה מתחת לשק השריר. לאחר ההפרדה המלאה מרקמת החיבור, השתמש במספריים כדי לפתוח את שק C master בקצה הגולגולת ולהאריך את החתך מפתח זה עד לקצה הדיסטלי של השריר.

לאחר צריבה תרמית של הכלי הקטן המחבר את האשך על הקרמסטר, השתמש במספריים כדי לחתוך את החיבורים הנותרים בין השריר לאשך. המשרפה הפתוחה תשכב כעת שטוחה על הבמה. כעת הניחו ארבעה שש או פרולן הישארו תפרים בשולי הרקמה וקבעו אותם בעזרת הווילון האלסטי.

על מנת להפיץ את רקמת שריר הקרמאסטר מנקודה זו ואילך, השתמש במזרק של מיליליטר אחד כדי להרטיב את הרקמה ברציפות עם PBS. לאחר שהתכשיר נח במשך 15 דקות, יש להזריק 0.05 עד 0.1 מיליליטר של דקסטרין רודין 1% דרך עורק הירך השמאלי לשיפור הניגודיות של כלי הדם המיקרו. כעת, הזז את העכבר ואת הבמה תחת מכשיר מצמד טעינה.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מחובר למצלמת וידאו, המותאם להארת אפי, תוך הקפדה מיוחדת לא לעקור את קטטר עורק הירך. לאחר התאמת מטרת הטבילה במים להדמיה מספקת של המיקרו-סירקולציה של chma, הגדיר באופן סטוכסטי שישה ES פוסט-נימי לניתוח מאוחר יותר של היצמדות תאי גזע מוצקים. לאחר מכן טען מזרק מיליליטר אחד עם 200 מיקרוליטר של תאי גזע של מח עצם מתורם פלואורסצנטי שסומנו בעבר.

הקש בעדינות על המזרק כדי להחיות אותו, השהה את תרחיף התאים ולאחר מכן תן את התאים דרך קטטר הירך בזריקות של 40 מיקרוליטר בסך הכל חמש זריקות רצופות. הקלט את תאי הגזע מתגלגלים מיד לאחר הזרקת התאים. הגדרת גלגול כהפחתה של יותר מ-50% במהירות התא לאורך רירית האנדותל בשילוב עם תנועות המקל והשחרור התאיות האופייניות.

לאחר השלמת המיקרוסקופיה התוך-חיונית, הסר בזהירות את שריר הקרמאסטר ואחסן אותו לניתוח מאוחר יותר. באופן כללי, האינטראקציה של תאי גזע או אב שהוזרקו ישירות עם האנדותל של כלי הדם בתוך המיקרו-סירקולציה של שריר הקרמסטר היא אירוע נדיר ומתרחשת אך ורק בלס הפוסט-נימי עקב התיוג הפלואורסצנטי. ניתן להבחין בבירור בין התאים המתגלגלים כפי שמסומנים על ידי ראש החץ השחור ותאי הגזע הנצמדים היטב כפי שמצוין על ידי החצים הלבנים, לבין הלויקוציטים האנדוגניים המסתובבים ב-es.

תנאי המיקרו סירקולציה המיוצגים על ידי מהירות זרימת הדם וקצב גזירת הדופן בדרך כלל אינם שונים באופן משמעותי בין קבוצות הניסוי המתאימות עם טיפול כימוקין שונה. טיפול מקומי ברקמת שריר המאסטר עם כימוקינים שונים או מתווכים של תגובה דלקתית. לדוגמה, גורם אלפא אחד שמקורו בתאי סטרומה או גורם נמק גידול אלפא מסוגל לחקות תנאים מיקרו-סביבתיים ספציפיים.

תנאים כאלה משפרים את האינטראקציות של תאי האנדותל של תאי הגזע בדרגות שונות בהתאם לכימוקין או למתווך הספציפי המופעל ולאוכלוסיית תאי הגזע המוזרקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין אינטראקציות של תאי גזע ותאי athe in vivo באמצעות מיקרוסקופיה תוך-חיונית של מיקרו-סירקולציה של שריר CreER.