Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo adquirir imágenes de alta calidad de súper resolución de tormentas. Esto se logra preparando primero una muestra de prueba marcada con fluorescente. El segundo paso es preparar el búfer de conmutación y luego llenar la cámara de imágenes con el búfer.

A continuación, los datos brutos se adquieren en un microscopio de tormenta. El paso final es reconstruir imágenes de súper resolución a partir de datos sin procesar utilizando un software de procesamiento de tormentas. En última instancia, las muestras de prueba se utilizan para mostrar cómo adquirir datos brutos de alta calidad, que luego se pueden procesar para generar imágenes de súper resolución de tormentas en celdas con resoluciones entre 30 y 50 nanómetros, lo que representa una mejora de la resolución de cinco a diez veces sobre las técnicas tradicionales de microscopía de fluorescencia, incluidas las de césped y confocal.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no se dan cuenta de la importancia de recopilar muchos enlaces dispersos de alta calidad. Esto se hace mucho más fácil mediante el uso de Alexa 6 4 7 dye en el búfer de conmutación correcto. Una demostración visual de esta técnica es esencial porque la adquisición de datos sin procesar de alta calidad es fundamental para producir imágenes con resolución SPR.

Las secuencias de video en bruto de esta técnica se ven completamente diferentes a cualquier otra forma de microscopía de fluorescencia. Para comenzar el procedimiento de recubrimiento de vidrio con dextrina fluorescente a 200 microlitros de solución de polilisina al 0,01% en cada pocillo de un cubreobjetos de ocho cámaras e incubar durante 10 minutos. Después de 10 minutos, retire la solución de polilisina con una pipeta para asegurarse de que no quede líquido diluido.

0,25 microlitros de una solución madre de dos miligramos por mililitro de dextrina. Alexa 6 47 en 25 microlitros de agua desionizada para crear una solución de 20 microgramos por mililitro para crear una capa de dextrina de alta densidad. Solución Alexa 6 47.

Diluya 20 microlitros de la solución de 20 microgramos por mililitro en un total de 200 microlitros de agua desionizada. Para una solución de densidad media, diluya dos microlitros en 200 microlitros de agua desionizada. Para una solución de baja densidad, diluya 0,2 microlitros.

En 200 microlitros de agua desionizada, agregue 200 microlitros de las soluciones de dextrina diluida Alexis X 47 a cada pocillo e incube durante 10 minutos. Se pueden utilizar tiempos de incubación más largos, lo que puede resultar en un recubrimiento de dextrina más denso. Por último, retira las soluciones de Dexter Xis X 47 y lávalas con agua tres veces.

Para preparar filamentos de actina fluorescentes en vidrio, primero agregue 200 microlitros de solución de polilisina al 0,01% a cada pocillo de una cámara de ocho. Cubra el vaso e incube durante 10 minutos. Retirar con una pipeta para asegurarse de que no quede líquido.

Añadir a cada cámara 90 microlitros de tampón de actina general previamente reconstituido según las instrucciones del fabricante. Luego agregue 10 microlitros de 10 micromolares de solución de filamento de actina preformada y un foid de microlitros y Alexa 6 47 y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar, incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente para preparar perlas fluorescentes de microesferas como marcadores fiduciales para diluir un microlitro de perlas de tepec en 200 microlitros PBS y mezclar. Agregue las perlas diluidas en la cámara de imágenes y espere 15 minutos.

Después de 15 minutos, retire la solución y lave tres veces con PBS antes de obtener imágenes de las células cultivadas a aproximadamente el 80% de la fluidez que se utilizan en este experimento. Retire el medio de cultivo y lávese con PBS. Luego agregue 500 microlitros de solución de formaldehído al 4% durante 10 minutos.

Retire el formaldehído y lave tres veces con PBS. No permita que las celdas permanezcan secas y utilice siempre soluciones tamponadas con PBS. Para evitar el estrés hipotónico, agregue dos microlitros de una solución madre de 50 microgramos por mililitro de EGF Alexa, 6 47 a 200 microlitros de solución de BSA al 0,1% y luego agregue esta solución a las células heladas.

Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Retire la solución y lave tres veces con PBS. Añadir una solución de bloqueo al 0,1%BSA y dejar actuar durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Después de eso, retire la solución de bloqueo y lave otras tres veces con PBS antes de tomar imágenes. Justo antes de la obtención de imágenes, prepare el tampón de conmutación mezclando las soluciones madre de glucosa enzimática y agente reductor En una proporción de 50 microlitros, 400 microlitros y 100 microlitros, agregue PBS para compensar el volumen final a un mililitro. Retire el PBS de la cámara de imágenes y, a continuación, llénelo hasta la parte superior con el búfer de conmutación.

Coloque con cuidado un cubreobjetos sobre la parte superior de la cámara, asegurándose de que no haya burbujas y de que toda la cámara esté cubierta. Si se ven burbujas, rellene con un tampón adicional o PBS. De lo contrario, el rendimiento del búfer puede disminuir.

La recopilación de datos de enlace dispersos y de alta calidad es esencial para el éxito de este procedimiento, así que asegúrese de que los microscopios estén correctamente enfocados y se utilicen los ajustes de adquisición correctos. Localice una estructura fluorescente de interés para obtener imágenes. Seleccione el ángulo de iluminación deseado.

En este caso, se recomienda un césped o un ángulo muy inclinado, ya que esto mejora la relación señal-ruido al minimizar la luz desenfocada, lo que es particularmente beneficioso para las muestras de células. Tome una referencia a la imagen de fracción limitada de la estructura antes de la toma de imágenes de la tormenta. Aumente el láser de excitación a una potencia alta correspondiente a aproximadamente dos kilovatios por centímetro cuadrado mientras toma imágenes con configuraciones de cámara de 10 milisegundos de exposición y un tiempo de ciclo de aproximadamente 50 hercios o fotogramas por segundo.

Una vez que los cuatro de la flora hayan pasado a un patrón de parpadeo disperso, recoge 10.000 fotogramas. Para comenzar esta reconstrucción. Abra el archivo RAINSTORM M desde MATLAB y ejecútelo en la ventana de rainstorm.

Seleccione el archivo de imagen que desea analizar con el botón Examinar. Debe ser un archivo TIF. Modifique el ancho de píxel para que coincida con los datos sin procesar del sistema de microscopio utilizado para adquirir los datos.

Deje los demás valores predeterminados. Presione el botón de procesar imágenes y espere hasta que aparezca una imagen preliminar. La duración del procesamiento dependerá del tamaño del archivo, la especificación del equipo y el número de enlaces candidatos dentro de los datos sin procesar.

Para generar una imagen de súper resolución actualizada, presione el botón abrir revisor y aparecerá una segunda ventana. Presione el botón de ajuste de contraste para cambiar la visualización de la imagen como desee. En algunos casos en los que la imagen es muy oscura, se debe disminuir el valor máximo.

Utilice la ventana del revisor para generar métricas útiles de calidad de imagen y refinar aún más la imagen de superresolución. Deje los tres primeros parámetros de control de calidad con valores predeterminados de 5.000, 0,1 y 0,8 a 3,5, respectivamente. Actualice los recuentos por valor de fotón.

Modifique el límite de precisión de la localización para equilibrar entre la optimización de la localización media y la precisión con el número de localización. En la imagen final, se recomiendan valores de 30 a 50 nanómetros dependiendo de la calidad de los datos y de la muestra. El factor de escala de reconstrucción predeterminado es cinco, lo que generará píxeles de superresolución de 32 nanómetros, suponiendo que el píxel dentro de las imágenes originales es de 160 nanómetros.

Si las imágenes sin procesar tienen un tamaño de píxel de 100 nanómetros, esto producirá imágenes de súper resolución con píxeles de 20 nanómetros. Aumente el factor de escala para producir píxeles de superresolución más pequeños. En la imagen final, presione el botón Ejecutar revisor para generar una imagen de súper resolución actualizada.

Presione el botón de vista de histogramas para mostrar las métricas de calidad de la imagen. Por último, presione el botón Guardar imagen en el revisor para guardar todos estos datos. Comience este procedimiento generando una imagen de la misma manera que se ha demostrado anteriormente.

Presione el botón de seguimiento de caja en el revisor y haga clic y arrastre un cuadro sobre el marcador de referencia en la imagen revisada. Espere hasta que aparezca una nueva imagen, que mostrará las posiciones en caja. Guarde esta imagen si lo desea, si el objeto de interés es un marcador de referencia.

Como es el caso aquí, realice la corrección de deriva haciendo clic en el botón establecer anclaje seguido del botón restar deriva. Por último, vuelva a hacer clic en ejecutar revisor para generar una nueva imagen de tormenta. Un recubrimiento exitoso de dextrina debería producir una monocapa fluorescente y los datos típicos de dextrina se muestran en esta figura.

Las imágenes limitadas por difracción muestran diferentes concentraciones de dextrina antes de las imágenes de la tormenta. Las reconstrucciones de súper resolución tienen un tamaño de píxel de 25 nanómetros. Se recogieron 10.000 imágenes con un tamaño de fotograma de 1 28 por 1 28 píxeles y se muestran fotogramas individuales de esa secuencia.

A una alta concentración de dextrina. La monocapa fluorescente debe aparecer relativamente uniforme, como se ilustra en estas imágenes y en este segmento de vídeo. A concentraciones más bajas, los parpadeos aparecerán más escasos y enfocados.

Sin un fondo obvio durante esta fase de adquisición de imágenes con iluminación láser constante, el número de parpadeos disminuirá con el tiempo, como se ilustra en una comparación entre el fotograma 2000 y el fotograma 8.000 en la muestra de alta densidad. La principal diferencia entre las imágenes de súper resolución de las concentraciones altas, medias y bajas de dextrina es la disminución del número de localizaciones. Este gráfico muestra un promedio de tres secuencias de 10.000 fotogramas de cada concentración de dextrina, donde las barras de error indican la desviación estándar.

Sin embargo, esta relación proporcional entre la concentración de las moléculas fluorescentes, el número de parpadeos en los datos brutos y el número de localizaciones no es lineal simple, como se ilustra en este gráfico del número de localizaciones aceptadas por fotograma. Utilizando un promedio móvil de 100 fotogramas a densidades de moléculas muy altas, el software no puede localizar con éxito las moléculas al obtener imágenes de cualquier muestra. Un problema común puede ser la presencia de neblina fluorescente brillante pero desenfocada a través de la imagen causada por la fuerza del flúor que se difunde a través del medio.

Estas moléculas fluorescentes desprendidas se pueden prevenir o eliminar aumentando el número de pasos de lavado con PBS antes de agregar el tampón de conmutación o agregando un tampón de conmutación nuevo al procesamiento de la cámara y comparando los datos de cada secuencia de imágenes que dan como resultado imágenes de súper resolución muy diferentes. Los paneles C y D son construcciones de imágenes de súper resolución que corresponden a los datos recopilados en los paneles A y B respectivamente. Este gráfico representa el número de localizaciones aceptadas por fotograma utilizando un promedio móvil de 100 fotogramas.

La línea roja corresponde a la secuencia de tormentas A y C donde hay un fondo alto, la línea azul corresponde a B y D donde el fondo es bajo. En el segundo gráfico se muestra el número de localización aceptado para las imágenes correspondientes a los datos de fondo altos y bajos. Estas tres imágenes limitadas por difracción muestran datos típicos de filamentos de actina preformados adheridos a la superficie del vidrio antes de la adición de tampón de conmutación e imágenes de tormentas.

Se pueden ver longitudes variables de filamentos. Los filamentos muy brillantes suelen ser varios filamentos enredados entre sí. La selección de filamentos individuales relativamente brillantes en lugar de áreas enredadas da como resultado imágenes de mejor calidad durante la fase de adquisición.

Se deben ver parpadeos brillantes y enfocados a lo largo del filamento. Se debe observar un parpadeo escaso durante la fase de adquisición y, posteriormente, en los datos de proceso. Debe haber un filamento fino continuo en las localizaciones por fotograma debe mostrar un declive gradual.

Típicamente, el máximo completo con la mitad o FWHM de un filamento se da como una estimación empírica de la resolución dibujando una línea recta a través de una región ampliada del filamento de actina utilizando la característica de perfil de trazado en la imagen J y posteriormente realizando un ajuste gaussiano. El FWHM se calcula como 43,2 nanómetros. Un problema de mala localización puede ocurrir cuando varios filamentos de actina se ramifican o se cruzan entre sí procesando subconjuntos de fotogramas y comparando los primeros y los últimos 5.000 fotogramas.

Se produce una imagen diferente en la imagen de súper resolución utilizando los primeros 5.000 fotogramas. Muchas localizaciones se ven en el centro de la imagen. Sin embargo, cuando se utilizan los últimos 5.000 fotogramas, muy pocas de estas localizaciones son evidentes y solo quedan los filamentos, aunque algo igual de continuos debido al bajo número de localizaciones en la imagen.

Si se sospecha de una densidad de parpadeo demasiado alta, la comparación de las imágenes con los datos de localización por fotograma puede sugerir fuertemente que este problema está ocurriendo durante el primer conjunto de fotogramas. Hay un número medio de localizaciones por fotograma de más de 10 en comparación con el último conjunto de fotogramas, en el que es de aproximadamente cuatro. Otro problema potencial en la microscopía de tormentas es la deriva, que ocurre cuando la muestra se mueve en relación con la lente del objetivo A través de la fase de adquisición de datos, aunque muy difícil de detectar durante la fase de adquisición de imágenes, la deriva se puede detectar en las imágenes de súper resolución de estructuras conocidas como los filamentos de actina.

La primera señal de que puede haber ocurrido una deriva lateral es que la estructura es más grande de lo esperado. Por ejemplo, con un lleno relativamente grande con la mitad del máximo en comparación con los datos del límite de precisión de la tormenta, en este caso 90 nanómetros en comparación con 67 nanómetros. Una mejor manera de detectar la deriva es comparando las localizaciones en función del tiempo IE, viendo si las localizaciones en los fotogramas posteriores están desplazadas en comparación con las de los fotogramas tempranos.

Esto se puede ver claramente en el caso de los filamentos de actina cuando se muestran con un código de colores. Usando la función de seguimiento de caja en rainstorm, como se muestra en los paneles B y c, las localizaciones se muestran con un color correspondiente al número de fotograma de cuando se adquirieron. Por ejemplo, las localizaciones de al principio de la secuencia de adquisición son azules, mientras que las localizaciones del final de la secuencia de adquisición son rojas.

Los colores desplazados indican que se ha producido una deriva para medir y corregir. Para las perlas fluorescentes de deriva de 100 nanómetros de diámetro se pueden usar como marcadores de referencia: los números del uno al cuatro muestran cuentas recortadas y ampliadas individualmente. En un ejemplo en el que hay una deriva relativamente severa de aproximadamente 100 nanómetros en el transcurso de tres minutos y 10 segundos durante la fase de adquisición, se puede usar la misma función de seguimiento de caja para codificar por colores y confirmar que se produjo la deriva ya que las cuatro cuentas en este ejemplo se muestran como deriva casi idéntica, es posible seleccionar una de ellas, en este caso la cuenta dos, para usarla como referencia y restar la deriva de las otras cuentas.

Una comparación con el panel E muestra que la deriva lateral se ha corregido. Por último, las células heela teñidas con factor de crecimiento epidérmico pueden utilizarse para dar un ejemplo realista de la resolución de la imagen. En las células, el panel A muestra una imagen limitada por difracción de parte de una célula hela enfocada en la superficie de la célula basal, donde los recuadros amarillos indican que las regiones de interés ampliadas se muestran en los paneles B y C, en contraste con las regiones de interés ampliadas indistintamente en la imagen limitada por difracción.

Las imágenes de súper resolución deben mostrar una mezcla de clústeres, ocasionalmente aislados, píxeles individuales. Los cúmulos tendrán aproximadamente 100 nanómetros de diámetro y es probable que correspondan a la formación de hoyos y vesículas. La vía a través de la cual el EGF se regula predominantemente a la baja y las localizaciones endocitadas por los datos del Panel D se presentan en el gráfico G. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo hacer algunas muestras de prueba simples, adquirir datos y reconstruir una tormenta de alta calidad, ver imágenes de resolución.

Estos métodos ayudarán a evitar algunos escollos comunes de ajuste, como la deriva, y ayudarán a optimizar su tormenta. Consulte Experimentos de resolución.