Name: Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 52 s
Description: Aprende a preparar muestras de prueba fluorescentes para optimizar la microscopía STORM de superresolución. Este método permite adquirir datos de alta calidad y generar imágenes con resoluciones de 30-50 nm en células.

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Reconocemos la financiación del programa de la Oficina Nacional de Medición del Reino Unido y Metrología Química Biológica. Damos las gracias a Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi y Eric Rees consejos técnicos y sugerencias. Agradecemos a Miklos Erdelyi, Eric Rees y Max Ryadnov útil para los comentarios y discusiones sobre este manuscrito.

No tenemos nada que revelar.

Se demuestra con algunas muestras de prueba simples y la libre disposición de procesamiento temporal de lluvia software es posible optimizar STORM imágenes de super-resolución. Estas herramientas y métodos proporcionarán puntos de partida útiles para los nuevos usuarios y los modos para los usuarios con experiencia para aumentar la confianza en sus microscopios y su uso de ellos para estudiar las estructuras biológicas y celulares con un detalle sin precedentes. Mediante el uso de una combinación de muestras con estructuras conocidas o bien entendidas y un algoritmo que puede producir una serie de indicadores de calidad de imagen de utilidad, como las estimaciones de precisión media, el número de localización e histogramas mostrando que es posible mejorar la calidad de la imagen y para tener una mayor confianza en el proceso de formación de imágenes TORMENTA. No hay una talla única aproximación a la adquisición de los datos, ya que hay un número de diferentes configuraciones de microscopio comerciales y de construcción propia que se puede utilizar. Por otra parte, hay muchos de preparación y de imágenes de ejemplo pasos de adquisición que puede influirEnce la imagen final, por tanto, contar con herramientas de software y muestras de prueba es fundamental para la comprensión y la optimización de la calidad de imagen TORMENTA. Además, estos protocolos pueden proporcionar formas útiles y menos ambiguas de la solución de cualquier problema que pueda surgir. Por ejemplo, la muestra de dextrano es una manera muy útil para identificar si hay cualquier desalineación del haz láser o iluminación desigual de la muestra. Si existen dudas de que el búfer de conmutación puede no estar funcionando una prueba visual muy simple para ver si hay alguna &#39;parpadear&#39; ayudará. Los filamentos de actina son una forma útil de medir la resolución utilizando comparaciones FWHM así como destacar la deriva y mislocalization artefactos. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que a medida que los métodos de super-resolución basada en la localización puede ser la densidad fluoróforo sensible, a pesar de los otros factores que contribuyen, como los tiempos de exposición, velocidades, potencias de láser y la forma en que la imagen se procesa, es imposible asignar una resolución para unparticular, microscopio y asumir que todas las imágenes tengan esa resolución. Lo que es posible, sin embargo, es la medición de diversos aspectos de la resolución, como precisiones de localización media, número de la localización y de la deriva 27. Incluso si los marcadores de referencia no se pueden incorporar en cada experimento que pueden, al menos, ser utilizado para caracterizar un sistema de microscopio, su entorno y comprender mejor las consideraciones operativas, tales como cómo se requiere mucho tiempo para alcanzar el equilibrio térmico después del arranque. Además de la corrección de la deriva lateral, marcadores de referencia pueden ser utilizados para caracterizar y corregir la deriva axial, aunque esto requiere el uso de una lente astigmática y un mecanismo de retroalimentación para corregir la posición de la muestra, mientras que las imágenes están siendo adquiridas 43. Sistemas de super-resolución comerciales por lo general incluirán algún tipo de control de estabilidad o de bloqueo de enfoque mecanismo, que puede ser una solución más práctica para corregir el enfoque deriva. Hay unre alternativas a recubrir de forma no específica el cristal con dextrano, tales como el uso de colorantes directamente u otras moléculas conjugadas, tales como anticuerpos secundarios. Una limitación de estos enfoques es que el número de moléculas unidas al vidrio no se conoce. Estructuras filamentosas alternativos que se han utilizado incluyen los microtúbulos 28 y el ADN 21. Sin embargo, la combinación de muy pequeño tamaño y convenientes reactivos disponibles comercialmente hacer actina una alternativa atractiva, especialmente en lo que la distancia de separación de los filamentos divergentes o ramificados que también puede ser una medida útil de rendimiento del sistema 27. Hay espacio para un mayor desarrollo de las muestras de ensayo, a pesar de los recientes avances en esta área 28,29,46,47. En particular, formación de imágenes de varios colores presenta un número de retos en todos los 3 aspectos principales de la formación de imágenes, el etiquetado de la muestra, de adquisición de imágenes (de hardware), y el software (procesamiento de imágenes y la alineación). Ha sido ununa serie de publicaciones que abordan estos aspectos 4-6 y por lo tanto, está claro que las muestras y los métodos de prueba apropiados son fundamentales para generar e interpretar con fiabilidad de este tipo de imágenes. De hecho, recientemente se ha demostrado que dSTORM se podría utilizar para tomar dos imágenes en color de, y resolver, la naturaleza altamente simétrico del complejo del poro nuclear y los autores sugirieron que esto sería una forma ideal para evaluar el desempeño de las correcciones de aberración cromática 45. Otro enfoque interesante es el uso de origami de ADN para crear un nanoruler, lo que crea la posibilidad de fluoróforos posicionamiento a distancias específicas sub-difracción de distancia 46. Esto proporciona una manera de evaluar la resolución y haciendo mediciones de distancia. Sin embargo, el objetivo final es aplicar estas técnicas de super-resolución para muestras no idealizados, como las células, que son estructuras tridimensionales complejas. En este caso, una combinación de comprensión más completa de Tque técnica combinada con herramientas de software que ayudan al usuario en la adquisición de datos, su procesamiento de manera apropiada, y proporcionar mediciones de la imagen es probable que sea la última respuesta. 28,29,47,48

Recientemente se han desarrollado una serie de técnicas de microscopía óptica, normalmente se conoce como microscopia de super-resolución o nanoscopía, que puede pasar por alto el límite de difracción y generar imágenes con resoluciones de 100 nm o mejor 1,2. Desde el anuncio de super-resolución de la microscopía como el método de Nature Methods del año en 2008, ha habido un gran desarrollo de los microscopios basados ​​en la localización. Por ejemplo, hay aplicaciones multi-color de 3-6, 7-12 implementaciones 3D, y aplicaciones de células incluso en vivo 5,13-17. Por otra parte, ya que estos sistemas están siendo comercializados y ahora están haciendo su manera de salir de los laboratorios de óptica en manos de los biólogos celulares no es probable que sea un nuevo aumento en su uso y aplicación a las cuestiones biomédicas. Una rama de esta familia son los métodos basados ​​en la localización que trabajan por la construcción de una molécula de molécula-por-imagen. Yoorden n para hacer esto, la mayoría de las moléculas fluorescentes dentro de la muestra se debe desconectar de manera que sólo unas pocas moléculas separadas espacialmente-están activos en un momento dado. Estas moléculas se conmutan a continuación, rápidamente del apagado y se toman muchas imágenes de manera que una parte significativa de la población se forma la imagen para reflejar la estructura subyacente con precisión de sub-difracción. Un número de enfoques han sido publicados incluyendo GSDIM 18, PALM 19, fPALM 20, STORM 21 y RESOLFT 22. Los algoritmos que miden la posición de una sola molécula de detección se pueden utilizar para localizar la posición real de la molécula con precisiones mejores que 20 nm utilizando apropiado gaussiana 23, por ejemplo rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, palm3d 12 y tormenta de lluvia 27. Cuando imágenes de células u otras muestras biológicas, que tienen una alta densidad de molécula, que por lo tanto es necesario tener muchos miles de marcos deEl parpadeo, espacialmente separada, de la señal con el fin de imagen una proporción significativa de las moléculas marcadas. Microscopía estocástico reconstrucción óptica (TORMENTA) y el dSTORM altamente relacionados y métodos GSDIM son métodos de super-resolución basada en la localización, que se han demostrado para trabajar con tintes orgánicos disponibles en el mercado 21. Desde entonces, han demostrado ser aplicable a un número de diferentes colorantes 28-30, lo que hace que la metodología particularmente atractiva debido a la especificidad y la comodidad relativa de enfoques immunolabeling bien establecidos para llevar a cabo la microscopía de fluorescencia. En consecuencia, no es fácil acceso a una amplia gama de conjugados colorante-anticuerpo-colorante y biomolécula, que tienen el potencial de ser utilizado en formación de imágenes de super-resolución basada en la localización. Mientras que los principios generales de la tormenta y enfoques similares son relativamente simples, ya primera vista la preparación del hardware y de la muestra parecen relativamente straightforward, hay una serie de pasos en el proceso que son críticos para el logro de alta calidad, libres de artefactos, imágenes de super-resolución. Al igual que con todas las técnicas de microscopía el proceso se puede considerar en 3 pasos principales: primero, la preparación de muestras, segundo, la adquisición de imágenes y, tercero, procesamiento de imágenes y / o análisis de imágenes y la interpretación. El poder de resolución adicional y método de generación de imágenes de super-resolución utilizando un enfoque basado en la localización introduce algunos nuevos problemas y consideraciones 31-33. A partir de la preparación de la muestra, cuando se realiza inmunomarcaje, particularmente inmunofluorescencia indirecta cuando se utiliza una combinación de anticuerpos primaria y secundaria, hay que señalar que el colorante fluorescente puede ser de hasta 20 nm de distancia de la molécula de interés. En el caso de los microtúbulos, esto se traduce en diámetros de 35-50 nm en comparación con un diámetro de microtúbulos esperado de 25 nm 28,30. Además, la densidad de etiquetado debe mEEG, el criterio de Nyquist a fin de generar una imagen de alta calidad 14. Por ejemplo, para una resolución de imagen prevista de 20 nm a lo largo de una estructura filamentosa no debe haber una molécula de colorante por lo menos cada 10 nm 27. Mientras que muchos colorantes se han publicado a trabajar para los enfoques basados ​​en la localización de los resultados globales del colorante es una mezcla de por lo menos cuatro criterios importantes, a saber, los fotones detectados por evento de conmutación (el brillo de cada parpadeo - más brillante es mejor), el equilibrio en -off ciclo de trabajo (la relación de contraste de tintes en el off contra el Estado - más fuera es generalmente mejor), la fracción de supervivencia (una tasa de blanqueo bajo es mejor) y el número de ciclos de conmutación (el número de parpadeos por fluoróforo - más es mejor para alta resolución, aunque 1 parpadeo por fluoróforo puede ser una ventaja para los propósitos de recuento de molécula). La situación se complica aún más por el hecho de que estas propiedades para cualquier tinte dado pueden variar en diferentes condiciones de tampón ycon 28,29 potencia del láser. Además, así como estas consideraciones STORM únicas, la calidad de imagen puede mejorarse mediante la optimización de la preparación de muestras de la misma manera como técnicas de microscopía de fluorescencia más tradicionales, por ejemplo, reduciendo al mínimo la autofluorescencia por modificación de las condiciones de fijación y el uso de reactivos de enfriamiento. También, minimizando fluoróforos unidos de forma no específica es importante, lo que puede hacerse mediante el ajuste de las concentraciones de etiquetas, los tiempos de incubación y etapas de bloqueo y lavado. El segundo paso de adquisición de la imagen también es crítica. Los ajustes óptimos en el microscopio dependerán del colorante, condiciones de tampón, la densidad de etiquetado, y el tipo de muestra, por ejemplo, monocapas sobre el vidrio, células o muestras de tejido. Las principales consideraciones son el tiempo de exposición de la cámara, número de cuadro, ángulo de iluminación (TIRF, HILO, Epi) y la potencia del láser. El objetivo es recoger la mayor cantidad de brillantes parpadeos separados espacialmente lo más rápido posible. Si el fondo is muy altos o los parpadeos no son muy brillantes, en otras palabras, la relación señal a ruido es pobre, el algoritmo de reconstrucción no será capaz de localizar las posiciones con la mayor precisión. Así como maximizar la precisión de localización, es decir, la precisión con la posición de cada molécula se puede medir, calidad de la imagen depende también de un elevado número de localizaciones. Si son expuestas un número insuficiente de las moléculas de interés, ya sea debido a la falta de etiquetado de eficiencia, fotoblanqueo excesiva o un número de cuadro inadecuada, entonces la imagen de super-resolución resultante será punteada y discontinua ya que no se han cumplido los criterios de Nyquist 14,27 . Y, por último, el tercer paso, el procesamiento de imágenes, es particularmente importante en comparación con técnicas de microscopía de fluorescencia estándar. Hay una variedad de forma libre y comercialmente disponibles algoritmos, que es a la vez una ventaja, en términos de elección, y una desventaja, ya que puede ser confuso saber which es el más apropiado para usar. Si, por ejemplo, los datos en bruto tiene bien espaciados espacialmente distintas parpadea entonces un algoritmo de ajuste de una sola molécula puede ser muy precisa y eficiente, por ejemplo, por los algoritmos de ajuste escasos disponibles en Rainstorm 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 y el software QuickPALM 26 . Si los datos en bruto contiene una gran cantidad de superposición de señales a continuación algoritmos que pueden ser más apropiado incluir DAOSTORM 34, 35 y 3B deconSTORM 36. Por otra parte, estos algoritmos contienen umbrales para diversos criterios tales como recuentos de señal, o fotones por abrir y cerrar, así como distintas opciones de visualización de imágenes diferentes, tales como la visualización con funciones gaussianas suavizadas o como histogramas con rejillas de píxel, donde el tamaño de píxel de super-resolución puede ser seleccionado por el usuario. Todas estas opciones de cambiar el aspecto de la imagen final y tienen implicaciones para la interpretación y análisis de imágenes. <p class="jove_content"&gt; Por lo tanto, presentamos 3 muestras de prueba que constituya el nuevo usuario con un punto de partida para los experimentos a base de colorantes basados ​​en localización de super-resolución, que en aras de la claridad, nos referiremos como tormenta, y los usuarios más experimentados, la oportunidad de optimizar aún más sus experimentos. En primer lugar, es posible recubrir la superficie de vidrio con una capa fluorescente de dextrano-colorante conjugado. Esto proporciona una forma rápida y simple para establecer que el microscopio, tinte y tampón están trabajando para generar el parpadeo de la señal fluorescente. El método puede ser extendido mediante la comparación de las métricas media de precisión de localización y número generados por temporal de lluvia para optimizar las condiciones de tampón, la configuración de adquisición de imágenes y probar diferentes tintes. En segundo lugar, se presenta un protocolo sencillo para la preparación de los filamentos de actina en el vidrio que puede ser etiquetada fácilmente utilizando conjugados phalloidin-dye. Estos proporcionan estructuras ideales para tomar mediciones de la resolución 27 y por lo general el ancho medio máximo (FWHM)de un filamento se da como una estimación empírica de la resolución 37. Cabe señalar que la resolución varía entre las muestras y entre las imágenes dentro de la misma muestra porque la resolución en super-resolución de la microscopía basada en la localización es una función del brillo fluoróforo, ruido de fondo y la densidad de localización 27 y estos no son necesariamente constantes en todo el espécimen. Los filamentos de actina se utilizan para demostrar posibles artefactos tales como mislocalizations y la deriva y cómo pueden ser identificadas con las características del software dentro de tormenta. Por otra parte, se describe el uso de marcadores de referencia fluorescentes tanto a medida y la deriva correcta. Y en tercer lugar, se describe la tinción de las células con factor de crecimiento epidérmico (EGF) conjugados de tinte. EGF proporciona un indicador útil de la calidad de la imagen de super-resolución, porque una proporción del receptor en la superficie celular experimenta endocitosis a través de vesículas, que son estructuras de tamaño sub-difracción de aproximadamente 50-150 Nm de diámetro 27,38,39.

<table><tbody><tr><td>Labtek Cámara de imagen de vidrio</td><td>Fisher</td><td>CBR-166-390E Preparación de</td><td>muestras</td></tr><tr><td>Microscopio invertido </td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>* Consulte a continuación las alternativas</td></tr><tr><td>Lente de objetivo 100 X TIRF</td><td>Olympus</td><td>UAPON 100XOTIRF</td><td>* Consulte a continuación las alternativas</td></tr> Cámara <tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>* Consulte a continuación las alternativas Láser</td></tr> <tr><td></td><td>de 640 nmToptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td>*150 mW - para la toma de imágenes Alexa 647 o Cy5 tintes</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>*Software de adquisición (hardware de control)</td></tr><tr><td>PC </td><td>Dell</td><td></td><td>Windows XP (64 bits), CPU Intel Xeon E5420, 16 GB de RAM *Control de instrumentos y procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Análisis y procesamiento de imágenes <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>rainSTORM</td><td>Laser Analytics Group (Cambridge) software</td><td></td><td><a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Running rainSTORM</td><td></td><td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/" target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td></tr><tr><td>*Ejemplo de microscopios</td><td></td><td></td> STORM/PALM de fabricación propia <td>Ver también referencia 29 <a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope" target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</ a></td></tr><tr><td>*Microscopios</td><td></td><td></td> comerciales de superresolución STORM/PALM: <td>Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss, Elyra P.1, DeltaVision, OMX Blaze (Monet Localization) Alternativas a los microscopios de construcción propia</td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 1. Materiales & Equipo </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Fisher</td><td>VX70013065</td><td>1; 2; 3; 4</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>1.1; 2.1</td></tr><tr><td>Dextran-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>D-22914</td><td>1.2</td></tr><tr><td>Tampón de actina general</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>BSA01</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Filamentos de actina prereformados</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>AKF99</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Phallodin-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Microesferas TetraSpeck (0.1 micras)</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>4.1</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>VX31966021</td><td>4.1</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher VX10500064</td><td></td><td>4.1</td></tr><tr><td>Pluma/Paso</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Platos de plástico</td><td>Invitrogen</td><td>734-0006</td><td>4.1</td></tr><tr><td>EGF - Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>E35351</td><td>4.3</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>4.3, 4.4</td></tr><tr><td>Formaldehído - Solución al 10 %</td> EM <td>grado Polysciences</td><td>04018-1</td><td>4.2</td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Sigma</td><td>C100</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>5.1</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>5.1</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>C4706</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>93352</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>C7528</td><td>5.2</td></tr><tr><td>MEA-HCl</td><td>Sigma</td><td>M6500</td><td>5.3</td></tr><tr><td>Glicerina</td><td>Sigma</td><td>G2289</td><td>5.1; 5.2</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Tabla 2.</fuerte> Reactivos</td></tr></tbody></table>

las muestras de prueba para optimizar storm super-resolución de microscopía

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM es una técnica de microscopia de super-resolución de reciente desarrollo con hasta 10 veces mejor resolución que las técnicas de microscopía de fluorescencia estándar. Sin embargo, como la imagen se adquiere de una manera muy diferente de lo normal, mediante la creación de una molécula de molécula-por-imagen, hay algunos desafíos significativos para los usuarios para tratar de optimizar su adquisición de la imagen. Con el fin de ayudar a este proceso y obtener una visión más clara de cómo funciona STORM presentamos la preparación de 3 muestras de prueba y la metodología de adquisición y procesamiento de imágenes STORM super-resolución con las resoluciones típicas de entre 30 a 50 nm. Mediante la combinación de las muestras de ensayo con el uso del software de procesamiento de tormenta libremente disponible, es posible obtener una gran cantidad de información acerca de la calidad y la resolución de la imagen. El uso de estos indicadores es entonces posible para optimizar el procedimiento de imagen de la óptica, para la preparación de muestras, selección de colorantes, condiciones del tampón y los ajustes de adquisición de imágenes. Tenemos unmuestran ejemplos de lso de algunos problemas comunes que dan lugar a la mala calidad de imagen, como la deriva lateral, donde los movimientos de la muestra durante la adquisición de imágenes y la densidad relacionadas problemas derivados del fenómeno &#39;mislocalization&#39;.

Se describe la preparación de tres muestras, y cómo pueden ser utilizados para optimizar y evaluar el desempeño de los microscopios TORMENTA. El uso de estos ejemplos nos muestran la forma de adquirir los datos en bruto y luego procesarla para obtener imágenes de super-resolución en las células de aproximadamente 30 a 50 nm de resolución.

Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo obtener imágenes de superresolución de alta calidad mediante la técnica STORM. Esto se logra primero preparando una muestra de prueba marcada con fluorocromos. El segundo paso consiste en preparar el tampón de conmutación y luego llenar la cámara de imágenes con este tampón.A continuación, se adquieren los datos brutos en un microscopio storm. El paso final consiste en reconstruir imágenes de superresolución a partir de los datos brutos utilizando el software de procesamiento rainstorm. En última instancia, las muestras de prueba se utilizan para mostrar cómo adquirir datos brutos de alta calidad, que luego pueden procesarse para generar imágenes de superresolución storm en células con resoluciones entre 30 y 50 nanómetros, lo que representa un aumento de resolución de cinco a diez veces en comparación con las técnicas tradicionales de microscopía de fluorescencia, incluidas turf y confocal.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no comprenden la importancia de recolectar muchos enlaces dispersos de alta calidad. Esto se facilita considerablemente utilizando el colorante Alexa 6 4 7 en el tampón de conmutación adecuado. Una demostración visual de esta técnica es esencial, ya que la obtención de datos brutos de alta calidad es fundamental para producir imágenes de resolución SPR.Las secuencias de video crudas de esta técnica se ven completamente diferentes a cualquier otra forma de microscopía de fluorescencia. Para comenzar el procedimiento de recubrimiento de vidrio con dextrina fluorescente, añada 200 microlitros de una solución de polilisina al 0,01 % a cada pocillo de una placa de vidrio cubierta de ocho cámaras e incube durante 10 minutos. Después de 10 minutos, retire la solución de polilisina con una pipeta para asegurarse de que no quede líquido diluido.0,25 microlitros de una solución stock de dextrina a dos miligramos por mililitro. Alexa 6 47 en 25 microlitros de agua desionizada para crear una solución de 20 microgramos por mililitro con el fin de obtener un recubrimiento denso de dextrina. Solución Alexa 6 47.Diluya 20 microlitros de la solución de 20 microgramos por mililitro hasta un volumen total de 200 microlitros con agua desionizada. Para una solución de densidad media, diluya dos microlitros en 200 microlitros de agua desionizada. Para una solución de baja densidad, diluya 0,2 microlitros.En 200 microlitros de agua desionizada, agregue 200 microlitros de las soluciones diluidas de dextrina Alexis X 47 a cada pocillo e incube durante 10 minutos. Pueden utilizarse tiempos de incubación más largos, lo que podría resultar en un recubrimiento de dextrina más denso. Finalmente, elimine las soluciones Dexter Xis X 47 y lave tres veces con agua.Para preparar filamentos de actina fluorescentes sobre vidrio primero, añada 200 microlitros de solución de polilisina al 0,01 % a cada pocillo de una cámara de ocho compartimentos. Cubra el vidrio e incube durante 10 minutos. Retire la solución con una pipeta para asegurarse de que no quede líquido.Agregue a cada cámara 90 microlitros de tampón de actina general reconstituido previamente según las instrucciones del fabricante. Luego agregue 10 microlitros de solución de filamentos de actina preformados de 10 micromolar y un microlitro de foid y Alexa 647, y pase suavemente hacia arriba y hacia abajo con la pipeta para mezclar. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente para preparar perlas fluorescentes de microesferas como marcadores fiduciales. Diluya un microlitro de perlas tepec en 200 microlitros de PBS y mezcle. Agregue las perlas diluidas en la cámara de imágenes y espere 15 minutos.Después de 15 minutos, retire la solución y lave tres veces con PBS antes de la adquisición de imágenes. En este experimento se utilizan células cultivadas hasta una confluencia aproximada del 80 %. Retire el medio de cultivo y lave con PBS. A continuación, agregue 500 microlitros de solución de formaldehído al 4 % durante 10 minutos.Retire el formaldehído y lave tres veces con PBS. No permita que las células se sequen y siempre use soluciones tamponadas con PBS. Para evitar el estrés hipotónico, agregue dos microlitros de una solución stock de 50 microgramos por mililitro de EGF Alexa 647 a 200 microlitros de solución de BSA al 0,1 %, y luego añada esta solución a las células HeLa.Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Eliminar la solución y lavar tres veces con PBS. Añadir una solución bloqueadora de BSA al 0,1% y dejar durante 15 minutos a temperatura ambiente.Después de eso, elimine la solución bloqueadora y lave tres veces más con PBS antes de la adquisición de imágenes. Justo antes de la adquisición, prepare el tampón de conmutación mezclando las soluciones stock de enzima glucosa y agente reductor en una proporción de 50 microlitros, 400 microlitros y 100 microlitros, y agregue PBS para completar el volumen final hasta un mililitro. Retire el PBS de la cámara de imagen y luego llénela hasta el tope con el tampón de conmutación.Coloque cuidadosamente una lámina de cubierta sobre la parte superior de la cámara, asegurándose de que no haya burbujas en absoluto y de que toda la cámara quede cubierta. Si se observan burbujas, complete con tampón adicional o PBS. De lo contrario, el rendimiento del tampón puede disminuir.La recopilación de datos de enlace de alta calidad y escasos es esencial para el éxito de este procedimiento, por lo que asegúrese de que los microscopios estén correctamente enfocados y de que se utilicen los ajustes adecuados de adquisición. Localice una estructura fluorescente de interés que se deba imaginar. Seleccione el ángulo deseado de iluminación.En este caso, se recomienda un ángulo de barrido o altamente inclinado, ya que mejora la relación señal-ruido al minimizar la luz fuera de foco, lo cual es particularmente beneficioso para muestras celulares. Tome una referencia de la imagen de fracción limitada de la estructura antes de la adquisición mediante STORM. Aumente el láser de excitación a una potencia alta correspondiente a aproximadamente dos kilovatios por centímetro cuadrado mientras realiza la adquisición con ajustes de cámara de 10 milisegundos de exposición y un tiempo de ciclo de aproximadamente 50 hercios o cuadros por segundo.Una vez que los grupos de flora hayan pasado a un patrón de parpadeo disperso, recolecte 10.000 cuadros. Para comenzar esta reconstrucción, abra el archivo M de RAINSTORM dentro de MATLAB y ejecútelo en la ventana de rainstorm.Seleccione el archivo de imagen que se analizará utilizando el botón de navegación. Este debe ser un archivo TIF. Modifique el ancho de píxel para que coincida con los datos brutos del sistema de microscopio utilizado para adquirir los datos.Deje los otros valores en sus valores predeterminados. Presione el botón de procesar imágenes y espere hasta que aparezca una imagen preliminar. La duración del procesamiento dependerá del tamaño del archivo, las especificaciones del equipo y la cantidad de enlaces candidatos dentro de los datos brutos.Para generar una imagen actualizada de superresolución, presione el botón de revisor abierto y aparecerá una segunda ventana. Presione el botón de ajustar contraste para cambiar la visualización de la imagen según se desee. En algunos casos en los que la imagen es muy oscura, el valor máximo debe disminuirse.Utilice la ventana del revisor para generar métricas útiles de calidad de imagen y perfeccionar aún más la imagen de superresolución. Deje los primeros tres parámetros de control de calidad con los valores predeterminados de 5 000, 0,1 y 0,8 a 3,5 respectivamente. Actualice el valor de cuentas por fotón.Modifique el umbral de precisión de localización para equilibrar la optimización de la localización media y la precisión frente al número de localizaciones. En la imagen final, se recomiendan valores entre 30 y 50 nanómetros, dependiendo de la calidad de los datos y de la muestra. El factor de escala de reconstrucción predeterminado es cinco, lo que generará píxeles de superresolución de 32 nanómetros, suponiendo que el píxel en las imágenes originales sea de 160 nanómetros.Si las imágenes originales tienen un tamaño de píxel de 100 nanómetros, esto producirá imágenes de superresolución con píxeles de 20 nanómetros. Aumente el factor de escala para producir píxeles de superresolución más pequeños. En la imagen final, presione el botón ejecutar revisor para generar una imagen de superresolución actualizada.Pulse el botón ver histogramas para mostrar las métricas de calidad de la imagen. Por último, pulse el botón guardar imagen en el visor para guardar todos estos datos. Comience este procedimiento generando una imagen de la misma manera que se mostró previamente.Pulse el botón de seguimiento de caja en el visor y haga clic y arrastre un cuadro sobre el marcador fiduciario en la imagen revisada. Espere hasta que aparezca una nueva imagen, que mostrará las posiciones delimitadas. Guarde esta imagen si lo desea, si el objeto de interés es un marcador fiduciario.Como sucede en este caso, realice la corrección de deriva haciendo clic en el botón establecer anclaje seguido del botón restar deriva. Finalmente, haga clic nuevamente en ejecutar revisor para generar una nueva imagen de tipo storm. Un recubrimiento exitoso de dextrina debería producir una monocapa fluorescente y en esta figura se muestra un ejemplo típico de datos de dextrina.Las imágenes con límite de difracción muestran diferentes concentraciones de dextrina antes de la adquisición de imágenes de tormenta. Las reconstrucciones de superresolución tienen un tamaño de píxel de 25 nanómetros. Se recopilaron 10.000 imágenes con un tamaño de cuadro de 128 por 128 píxeles y se muestran cuadros individuales de esa secuencia.En una concentración alta de dextrina. La monocapa fluorescente debería aparecer relativamente uniforme, como se ilustra en estas imágenes y este segmento de video. En concentraciones más bajas, los parpadeos aparecerán más dispersos y en foco.Al no haber un fondo evidente durante esta fase de adquisición de imágenes con iluminación láser constante, el número de parpadeos disminuirá con el tiempo, como se ilustra mediante la comparación entre el cuadro 2000 y el cuadro 8,000 en la muestra de alta densidad. La principal diferencia entre las imágenes de superresolución de las concentraciones alta, media y baja de dextrina es la disminución progresiva del número de localizaciones. Este gráfico muestra un promedio de tres secuencias de 10,000 cuadros para cada concentración de dextrina, donde las barras de error indican la desviación estándar.Sin embargo, esta relación proporcional entre la concentración de las moléculas fluorescentes, el número de parpadeos en los datos brutos y el número de localizaciones no es una relación lineal simple, como se ilustra en esta gráfica del número de localizaciones aceptadas por cuadro. Al utilizar un promedio móvil de 100 cuadros a densidades muy altas de moléculas, el software es incapaz de localizar con éxito las moléculas al obtener imágenes de cualquier muestra. Un problema común puede ser la presencia de un halo fluorescente brillante pero desenfocado a través de la imagen, causado por la difusión del fluoróforo a través del medio.Estas moléculas fluorescentes desprendidas pueden evitarse o eliminarse aumentando el número de pasos de lavado con PBS antes de añadir el tampón de conmutación o añadiendo tampón de conmutación fresco a la cámara. El procesamiento y la comparación de los datos de cada secuencia de imágenes da como resultado imágenes de superresolución muy diferentes. Los paneles C y D son reconstrucciones de imágenes de superresolución correspondientes a los datos recopilados en los paneles A y B, respectivamente. Esta gráfica representa el número de localizaciones aceptadas por cuadro utilizando un promedio móvil de 100 cuadros.La línea roja corresponde a las secuencias de tormenta A y C, donde hay un fondo alto; la línea azul corresponde a B y D, donde el fondo es bajo. En el segundo gráfico se muestra el número aceptado de localizaciones para las imágenes correspondientes a datos con fondo alto y bajo. Estas tres imágenes con límite de difracción muestran datos típicos de filamentos de actina preformados adheridos a la superficie del vidrio antes de la adición del tampón de conmutación y del análisis mediante microscopía STORM.Pueden observarse filamentos de longitudes variables. Los filamentos muy brillantes suelen ser varios filamentos enredados entre sí. Seleccionar filamentos individuales relativamente brillantes en lugar de zonas enredadas da como resultado imágenes de mejor calidad durante la fase de adquisición.Deberían observarse parpadeos brillantes y enfocados a lo largo del filamento. Durante la fase de adquisición, y posteriormente en el proceso de datos, se debería ver un parpadeo escaso. Debería haber un filamento continuo y delgado en las localizaciones por cuadro, que deben mostrar una disminución gradual.Típicamente, el ancho total a mitad de la altura máxima o FWHM de un filamento se proporciona como una estimación empírica de la resolución, trazando una línea recta a través de una región ampliada del filamento de actina utilizando la función perfil de trazado en ImageJ y realizando posteriormente un ajuste gaussiano. El FWHM se calcula en 43,2 nanómetros. Puede surgir un problema de mala localización cuando varios filamentos de actina se ramifican y/o se cruzan entre sí, mediante el procesamiento de subconjuntos de cuadros y la comparación de los primeros y últimos 5.000 cuadros.Se produce una imagen diferente en la imagen de superresolución utilizando los primeros 5.000 fotogramas. Se observan muchas localizaciones en el centro de la imagen. Sin embargo, al utilizar los últimos 5.000 fotogramas, son evidentes muy pocas de estas localizaciones y solo quedan los filamentos, aunque algo continuos debido al bajo número de localizaciones en la imagen.Si se sospecha una densidad de parpadeo demasiado alta, la comparación de las imágenes con los datos de localización por cuadro puede sugerir fuertemente que este problema ocurre durante el primer conjunto de cuadros. Hay un número promedio de localizaciones por cuadro superior a 10, en comparación con el último conjunto de cuadros, donde es aproximadamente cuatro. Otro problema potencial en la microscopía STORM es la deriva, que ocurre cuando la muestra se mueve con respecto al objetivo durante la fase de adquisición de datos. Aunque es muy difícil de detectar durante la adquisición de imágenes, la deriva puede identificarse en las imágenes de superresolución de estructuras conocidas, como los filamentos de actina.El primer indicio de que puede haber ocurrido una deriva lateral es que la estructura sea más grande de lo esperado. Por ejemplo, con un ancho relativamente grande a la mitad del máximo en comparación con los datos del límite de precisión provenientes de la tormenta de lluvia, en este caso 90 nanómetros frente a 67 nanómetros. Una manera mejor de detectar la deriva es comparando las localizaciones como función del tiempo, es decir, verificando si las localizaciones en los cuadros posteriores están desplazadas en comparación con las de los cuadros iniciales.Esto puede observarse claramente en el caso de los filamentos de actina cuando se muestran con un código de colores. Al utilizar la función de seguimiento de cajas en rainstorm, como se muestra en los paneles B y C, las localizaciones se muestran con un color que corresponde al número de cuadro en el que fueron adquiridas. Por ejemplo, las localizaciones obtenidas al principio de la secuencia de adquisición son azules, mientras que las obtenidas al final de la secuencia de adquisición son rojas.Los colores desplazados indican que ha ocurrido una deriva, con el fin de medirla y corregirla. Para medir la deriva, pueden usarse microesferas fluorescentes de 100 nanómetros de diámetro como marcadores fiduciales; los números del uno al cuatro muestran microesferas recortadas y ampliadas individualmente. En un ejemplo donde hay una deriva relativamente severa de aproximadamente 100 nanómetros durante tres minutos y 10 segundos en la fase de adquisición, puede usarse la misma función de seguimiento de cuadros para codificar por colores y confirmar la deriva ocurrida, ya que las cuatro microesferas en este ejemplo muestran una deriva casi idéntica. Es posible seleccionar una de ellas, en este caso la microesfera dos, para usarla como referencia y restar la deriva de las otras microesferas.Una comparación con el panel E muestra que la deriva lateral ha sido corregida. Finalmente, las células HeLa marcadas con factor de crecimiento epidérmico pueden utilizarse para dar un ejemplo realista de resolución de imagen. En las células, el panel A muestra una imagen limitada por la difracción de una parte de una célula HeLa enfocada en la superficie basal de la célula, donde las cajas amarillas indican regiones de interés ampliadas que se muestran en los paneles B y C, en contraste con las regiones de interés ampliadas poco definidas en la imagen limitada por la difracción.Las imágenes de superresolución deben mostrar una mezcla de agrupaciones y, ocasionalmente, píxeles aislados individuales. Las agrupaciones tendrán aproximadamente 100 nanómetros de diámetro y probablemente correspondan a fosas y vesículas en formación. La vía a través de la cual el EGF se downregula predominantemente y las localizaciones de endocitosis por cuadro de datos del Panel D se presentan en el gráfico G. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar algunas muestras de prueba sencillas, adquirir datos y reconstruir imágenes de resolución STORM de alta calidad.Estos métodos ayudarán a evitar algunas trampas comunes de ajuste, como la deriva, y contribuirán a optimizar su storm. Consulte los experimentos de resolución.

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