Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo obtener imágenes de superresolución de alta calidad mediante la técnica STORM. Esto se logra primero preparando una muestra de prueba marcada con fluorocromos. El segundo paso consiste en preparar el tampón de conmutación y luego llenar la cámara de imágenes con este tampón.

A continuación, se adquieren los datos brutos en un microscopio storm. El paso final consiste en reconstruir imágenes de superresolución a partir de los datos brutos utilizando el software de procesamiento rainstorm. En última instancia, las muestras de prueba se utilizan para mostrar cómo adquirir datos brutos de alta calidad, que luego pueden procesarse para generar imágenes de superresolución storm en células con resoluciones entre 30 y 50 nanómetros, lo que representa un aumento de resolución de cinco a diez veces en comparación con las técnicas tradicionales de microscopía de fluorescencia, incluidas turf y confocal.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no comprenden la importancia de recolectar muchos enlaces dispersos de alta calidad. Esto se facilita considerablemente utilizando el colorante Alexa 6 4 7 en el tampón de conmutación adecuado. Una demostración visual de esta técnica es esencial, ya que la obtención de datos brutos de alta calidad es fundamental para producir imágenes de resolución SPR.

Las secuencias de video crudas de esta técnica se ven completamente diferentes a cualquier otra forma de microscopía de fluorescencia. Para comenzar el procedimiento de recubrimiento de vidrio con dextrina fluorescente, añada 200 microlitros de una solución de polilisina al 0,01 % a cada pocillo de una placa de vidrio cubierta de ocho cámaras e incube durante 10 minutos. Después de 10 minutos, retire la solución de polilisina con una pipeta para asegurarse de que no quede líquido diluido.

0,25 microlitros de una solución stock de dextrina a dos miligramos por mililitro. Alexa 6 47 en 25 microlitros de agua desionizada para crear una solución de 20 microgramos por mililitro con el fin de obtener un recubrimiento denso de dextrina. Solución Alexa 6 47.

Diluya 20 microlitros de la solución de 20 microgramos por mililitro hasta un volumen total de 200 microlitros con agua desionizada. Para una solución de densidad media, diluya dos microlitros en 200 microlitros de agua desionizada. Para una solución de baja densidad, diluya 0,2 microlitros.

En 200 microlitros de agua desionizada, agregue 200 microlitros de las soluciones diluidas de dextrina Alexis X 47 a cada pocillo e incube durante 10 minutos. Pueden utilizarse tiempos de incubación más largos, lo que podría resultar en un recubrimiento de dextrina más denso. Finalmente, elimine las soluciones Dexter Xis X 47 y lave tres veces con agua.

Para preparar filamentos de actina fluorescentes sobre vidrio primero, añada 200 microlitros de solución de polilisina al 0,01 % a cada pocillo de una cámara de ocho compartimentos. Cubra el vidrio e incube durante 10 minutos. Retire la solución con una pipeta para asegurarse de que no quede líquido.

Agregue a cada cámara 90 microlitros de tampón de actina general reconstituido previamente según las instrucciones del fabricante. Luego agregue 10 microlitros de solución de filamentos de actina preformados de 10 micromolar y un microlitro de foid y Alexa 647, y pase suavemente hacia arriba y hacia abajo con la pipeta para mezclar. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente para preparar perlas fluorescentes de microesferas como marcadores fiduciales. Diluya un microlitro de perlas tepec en 200 microlitros de PBS y mezcle. Agregue las perlas diluidas en la cámara de imágenes y espere 15 minutos.

Después de 15 minutos, retire la solución y lave tres veces con PBS antes de la adquisición de imágenes. En este experimento se utilizan células cultivadas hasta una confluencia aproximada del 80 %. Retire el medio de cultivo y lave con PBS. A continuación, agregue 500 microlitros de solución de formaldehído al 4 % durante 10 minutos.

Retire el formaldehído y lave tres veces con PBS. No permita que las células se sequen y siempre use soluciones tamponadas con PBS. Para evitar el estrés hipotónico, agregue dos microlitros de una solución stock de 50 microgramos por mililitro de EGF Alexa 647 a 200 microlitros de solución de BSA al 0,1 %, y luego añada esta solución a las células HeLa.

Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Eliminar la solución y lavar tres veces con PBS. Añadir una solución bloqueadora de BSA al 0,1% y dejar durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Después de eso, elimine la solución bloqueadora y lave tres veces más con PBS antes de la adquisición de imágenes. Justo antes de la adquisición, prepare el tampón de conmutación mezclando las soluciones stock de enzima glucosa y agente reductor en una proporción de 50 microlitros, 400 microlitros y 100 microlitros, y agregue PBS para completar el volumen final hasta un mililitro. Retire el PBS de la cámara de imagen y luego llénela hasta el tope con el tampón de conmutación.

Coloque cuidadosamente una lámina de cubierta sobre la parte superior de la cámara, asegurándose de que no haya burbujas en absoluto y de que toda la cámara quede cubierta. Si se observan burbujas, complete con tampón adicional o PBS. De lo contrario, el rendimiento del tampón puede disminuir.

La recopilación de datos de enlace de alta calidad y escasos es esencial para el éxito de este procedimiento, por lo que asegúrese de que los microscopios estén correctamente enfocados y de que se utilicen los ajustes adecuados de adquisición. Localice una estructura fluorescente de interés que se deba imaginar. Seleccione el ángulo deseado de iluminación.

En este caso, se recomienda un ángulo de barrido o altamente inclinado, ya que mejora la relación señal-ruido al minimizar la luz fuera de foco, lo cual es particularmente beneficioso para muestras celulares. Tome una referencia de la imagen de fracción limitada de la estructura antes de la adquisición mediante STORM. Aumente el láser de excitación a una potencia alta correspondiente a aproximadamente dos kilovatios por centímetro cuadrado mientras realiza la adquisición con ajustes de cámara de 10 milisegundos de exposición y un tiempo de ciclo de aproximadamente 50 hercios o cuadros por segundo.

Una vez que los grupos de flora hayan pasado a un patrón de parpadeo disperso, recolecte 10.000 cuadros. Para comenzar esta reconstrucción, abra el archivo M de RAINSTORM dentro de MATLAB y ejecútelo en la ventana de rainstorm.

Seleccione el archivo de imagen que se analizará utilizando el botón de navegación. Este debe ser un archivo TIF. Modifique el ancho de píxel para que coincida con los datos brutos del sistema de microscopio utilizado para adquirir los datos.

Deje los otros valores en sus valores predeterminados. Presione el botón de procesar imágenes y espere hasta que aparezca una imagen preliminar. La duración del procesamiento dependerá del tamaño del archivo, las especificaciones del equipo y la cantidad de enlaces candidatos dentro de los datos brutos.

Para generar una imagen actualizada de superresolución, presione el botón de revisor abierto y aparecerá una segunda ventana. Presione el botón de ajustar contraste para cambiar la visualización de la imagen según se desee. En algunos casos en los que la imagen es muy oscura, el valor máximo debe disminuirse.

Utilice la ventana del revisor para generar métricas útiles de calidad de imagen y perfeccionar aún más la imagen de superresolución. Deje los primeros tres parámetros de control de calidad con los valores predeterminados de 5 000, 0,1 y 0,8 a 3,5 respectivamente. Actualice el valor de cuentas por fotón.

Modifique el umbral de precisión de localización para equilibrar la optimización de la localización media y la precisión frente al número de localizaciones. En la imagen final, se recomiendan valores entre 30 y 50 nanómetros, dependiendo de la calidad de los datos y de la muestra. El factor de escala de reconstrucción predeterminado es cinco, lo que generará píxeles de superresolución de 32 nanómetros, suponiendo que el píxel en las imágenes originales sea de 160 nanómetros.

Si las imágenes originales tienen un tamaño de píxel de 100 nanómetros, esto producirá imágenes de superresolución con píxeles de 20 nanómetros. Aumente el factor de escala para producir píxeles de superresolución más pequeños. En la imagen final, presione el botón ejecutar revisor para generar una imagen de superresolución actualizada.

Pulse el botón ver histogramas para mostrar las métricas de calidad de la imagen. Por último, pulse el botón guardar imagen en el visor para guardar todos estos datos. Comience este procedimiento generando una imagen de la misma manera que se mostró previamente.

Pulse el botón de seguimiento de caja en el visor y haga clic y arrastre un cuadro sobre el marcador fiduciario en la imagen revisada. Espere hasta que aparezca una nueva imagen, que mostrará las posiciones delimitadas. Guarde esta imagen si lo desea, si el objeto de interés es un marcador fiduciario.

Como sucede en este caso, realice la corrección de deriva haciendo clic en el botón establecer anclaje seguido del botón restar deriva. Finalmente, haga clic nuevamente en ejecutar revisor para generar una nueva imagen de tipo storm. Un recubrimiento exitoso de dextrina debería producir una monocapa fluorescente y en esta figura se muestra un ejemplo típico de datos de dextrina.

Las imágenes con límite de difracción muestran diferentes concentraciones de dextrina antes de la adquisición de imágenes de tormenta. Las reconstrucciones de superresolución tienen un tamaño de píxel de 25 nanómetros. Se recopilaron 10.000 imágenes con un tamaño de cuadro de 128 por 128 píxeles y se muestran cuadros individuales de esa secuencia.

En una concentración alta de dextrina. La monocapa fluorescente debería aparecer relativamente uniforme, como se ilustra en estas imágenes y este segmento de video. En concentraciones más bajas, los parpadeos aparecerán más dispersos y en foco.

Al no haber un fondo evidente durante esta fase de adquisición de imágenes con iluminación láser constante, el número de parpadeos disminuirá con el tiempo, como se ilustra mediante la comparación entre el cuadro 2000 y el cuadro 8,000 en la muestra de alta densidad. La principal diferencia entre las imágenes de superresolución de las concentraciones alta, media y baja de dextrina es la disminución progresiva del número de localizaciones. Este gráfico muestra un promedio de tres secuencias de 10,000 cuadros para cada concentración de dextrina, donde las barras de error indican la desviación estándar.

Sin embargo, esta relación proporcional entre la concentración de las moléculas fluorescentes, el número de parpadeos en los datos brutos y el número de localizaciones no es una relación lineal simple, como se ilustra en esta gráfica del número de localizaciones aceptadas por cuadro. Al utilizar un promedio móvil de 100 cuadros a densidades muy altas de moléculas, el software es incapaz de localizar con éxito las moléculas al obtener imágenes de cualquier muestra. Un problema común puede ser la presencia de un halo fluorescente brillante pero desenfocado a través de la imagen, causado por la difusión del fluoróforo a través del medio.

Estas moléculas fluorescentes desprendidas pueden evitarse o eliminarse aumentando el número de pasos de lavado con PBS antes de añadir el tampón de conmutación o añadiendo tampón de conmutación fresco a la cámara. El procesamiento y la comparación de los datos de cada secuencia de imágenes da como resultado imágenes de superresolución muy diferentes. Los paneles C y D son reconstrucciones de imágenes de superresolución correspondientes a los datos recopilados en los paneles A y B, respectivamente. Esta gráfica representa el número de localizaciones aceptadas por cuadro utilizando un promedio móvil de 100 cuadros.

La línea roja corresponde a las secuencias de tormenta A y C, donde hay un fondo alto; la línea azul corresponde a B y D, donde el fondo es bajo. En el segundo gráfico se muestra el número aceptado de localizaciones para las imágenes correspondientes a datos con fondo alto y bajo. Estas tres imágenes con límite de difracción muestran datos típicos de filamentos de actina preformados adheridos a la superficie del vidrio antes de la adición del tampón de conmutación y del análisis mediante microscopía STORM.

Pueden observarse filamentos de longitudes variables. Los filamentos muy brillantes suelen ser varios filamentos enredados entre sí. Seleccionar filamentos individuales relativamente brillantes en lugar de zonas enredadas da como resultado imágenes de mejor calidad durante la fase de adquisición.

Deberían observarse parpadeos brillantes y enfocados a lo largo del filamento. Durante la fase de adquisición, y posteriormente en el proceso de datos, se debería ver un parpadeo escaso. Debería haber un filamento continuo y delgado en las localizaciones por cuadro, que deben mostrar una disminución gradual.

Típicamente, el ancho total a mitad de la altura máxima o FWHM de un filamento se proporciona como una estimación empírica de la resolución, trazando una línea recta a través de una región ampliada del filamento de actina utilizando la función perfil de trazado en ImageJ y realizando posteriormente un ajuste gaussiano. El FWHM se calcula en 43,2 nanómetros. Puede surgir un problema de mala localización cuando varios filamentos de actina se ramifican y/o se cruzan entre sí, mediante el procesamiento de subconjuntos de cuadros y la comparación de los primeros y últimos 5.000 cuadros.

Se produce una imagen diferente en la imagen de superresolución utilizando los primeros 5.000 fotogramas. Se observan muchas localizaciones en el centro de la imagen. Sin embargo, al utilizar los últimos 5.000 fotogramas, son evidentes muy pocas de estas localizaciones y solo quedan los filamentos, aunque algo continuos debido al bajo número de localizaciones en la imagen.

Si se sospecha una densidad de parpadeo demasiado alta, la comparación de las imágenes con los datos de localización por cuadro puede sugerir fuertemente que este problema ocurre durante el primer conjunto de cuadros. Hay un número promedio de localizaciones por cuadro superior a 10, en comparación con el último conjunto de cuadros, donde es aproximadamente cuatro. Otro problema potencial en la microscopía STORM es la deriva, que ocurre cuando la muestra se mueve con respecto al objetivo durante la fase de adquisición de datos. Aunque es muy difícil de detectar durante la adquisición de imágenes, la deriva puede identificarse en las imágenes de superresolución de estructuras conocidas, como los filamentos de actina.

El primer indicio de que puede haber ocurrido una deriva lateral es que la estructura sea más grande de lo esperado. Por ejemplo, con un ancho relativamente grande a la mitad del máximo en comparación con los datos del límite de precisión provenientes de la tormenta de lluvia, en este caso 90 nanómetros frente a 67 nanómetros. Una manera mejor de detectar la deriva es comparando las localizaciones como función del tiempo, es decir, verificando si las localizaciones en los cuadros posteriores están desplazadas en comparación con las de los cuadros iniciales.

Esto puede observarse claramente en el caso de los filamentos de actina cuando se muestran con un código de colores. Al utilizar la función de seguimiento de cajas en rainstorm, como se muestra en los paneles B y C, las localizaciones se muestran con un color que corresponde al número de cuadro en el que fueron adquiridas. Por ejemplo, las localizaciones obtenidas al principio de la secuencia de adquisición son azules, mientras que las obtenidas al final de la secuencia de adquisición son rojas.

Los colores desplazados indican que ha ocurrido una deriva, con el fin de medirla y corregirla. Para medir la deriva, pueden usarse microesferas fluorescentes de 100 nanómetros de diámetro como marcadores fiduciales; los números del uno al cuatro muestran microesferas recortadas y ampliadas individualmente. En un ejemplo donde hay una deriva relativamente severa de aproximadamente 100 nanómetros durante tres minutos y 10 segundos en la fase de adquisición, puede usarse la misma función de seguimiento de cuadros para codificar por colores y confirmar la deriva ocurrida, ya que las cuatro microesferas en este ejemplo muestran una deriva casi idéntica. Es posible seleccionar una de ellas, en este caso la microesfera dos, para usarla como referencia y restar la deriva de las otras microesferas.

Una comparación con el panel E muestra que la deriva lateral ha sido corregida. Finalmente, las células HeLa marcadas con factor de crecimiento epidérmico pueden utilizarse para dar un ejemplo realista de resolución de imagen. En las células, el panel A muestra una imagen limitada por la difracción de una parte de una célula HeLa enfocada en la superficie basal de la célula, donde las cajas amarillas indican regiones de interés ampliadas que se muestran en los paneles B y C, en contraste con las regiones de interés ampliadas poco definidas en la imagen limitada por la difracción.

Las imágenes de superresolución deben mostrar una mezcla de agrupaciones y, ocasionalmente, píxeles aislados individuales. Las agrupaciones tendrán aproximadamente 100 nanómetros de diámetro y probablemente correspondan a fosas y vesículas en formación. La vía a través de la cual el EGF se downregula predominantemente y las localizaciones de endocitosis por cuadro de datos del Panel D se presentan en el gráfico G. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar algunas muestras de prueba sencillas, adquirir datos y reconstruir imágenes de resolución STORM de alta calidad.

Estos métodos ayudarán a evitar algunas trampas comunes de ajuste, como la deriva, y contribuirán a optimizar su storm. Consulte los experimentos de resolución.