Name: Microscopía de localización de moléculas individuales de proteínas de membrana utilizando marcaje de anticuerpo único (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprende a visualizar interacciones antígeno-anticuerpo a nanoescala en membranas de células T mediante marcaje de anticuerpo único. Este protocolo permite observar directamente la unión de anticuerpos en su entorno celular nativo.

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<table><tbody><tr><td>Anticuerpo anti-CD81 Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-44132</td><td>Anticuerpo de imagen</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>MilliporeSigma</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio con tapa con cámara, 8 pozos</td><td>Cellvis</td><td>C8-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Medios DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>Suero tamponado con fosfato de Dulbecco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>MilliporeSigma</td><td>F0926-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído, 10 %</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Coloides de oro, 100 nm</td><td>Ted Pella</td><td>15711 y menos; 20</td><td>Marcador fiduciario</td></tr><tr><td>Aceite de inmersión &nbsp;</td><td>Laboratorios Cargille</td><td>16245</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido&nbsp; equipado con módulo TIRF</td><td>Instrumentos Nikon</td><td>Eclipse Ti2-E</td><td>Microscopio</td></tr><tr><td>Línea celular Jurkat E6.1</td><td>MilliporeSigma</td><td>88042803-1VL</td><td>Celdas de suspensión</td></tr><tr><td>Lanzamiento láser, 6 líneas</td><td>Oxxius</td><td>L6CC-CS8-1511</td><td>Láser de excitación</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Tubo microcentrífuga, 1,5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagen de microscopía</td><td>Instrumentos Nikon</td><td>Investigación Avanzada de NIS-Elementos</td><td>Software de adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Objetivo, 100x/1.49 CFI APO TIRF&nbsp;</td><td>Instrumentos Nikon</td><td>MRD01991</td><td>Objetivo de microscopio</td></tr><tr><td>Paraformaldehído, 16 %</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Solución de poli-L-lisina, 0,01%&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>P4707-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Cámara Prime 95B sCMOS</td><td>Soluciones de visión Teledyne</td><td>01-PRIME-95B-R-M-16-C</td><td>Cámara</td></tr><tr><td>Medios RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>Medios para celdas de suspensión</td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19038-1000</td><td></td></tr><tr><td>Borohidruro de sodio</td><td>MilliporeSigma</td><td>213462-25G</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultivo T25</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>169900</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas TetraSpeck</td><td></td><td></td><td>Marcador fiduciario</td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos, 100 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Células adherentes</td></tr></tbody></table>

microscopía de localización de moléculas individuales de proteínas de membrana utilizando marcaje de anticuerpo único

Single-Molecule Localization Microscopy of Membrane Proteins using Single-Antibody Labeling

Microscopía de localización de moléculas individuales de proteínas de membrana utilizando marcaje de anticuerpo único

The plasma membrane defines the cell shape and serves as the interface that governs intercellular communication. Membrane proteins constitute a major ...

single-molecule-localization-microscopy-membrane-proteins-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Demostramos el uso de la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) para obtener imágenes simultáneas de múltiples tipos de moléculas marcadas con fluorescencia dentro de las células. Las técnicas descritas producen la localización de miles a cientos de miles de proteínas individuales marcadas con fluorescentes, con una precisión de decenas de nanómetros dentro de células individuales.

Imágenes Multicolor Simultáneas de Estructuras Biológicas con Microscopía de Localización de Fotoactivación de Fluorescencia

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para visualizar y rastrear receptores individuales en la superficie de las células vivas y, por lo tanto, analizar la movilidad lateral del receptor, el tamaño de los complejos de receptores, así como para visualizar las interacciones transitorias receptor-receptor. Este protocolo puede extenderse a otras proteínas de membrana.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Aquí se muestra la preparación de bicapas lipídicas planas funcionalizadas con proteínas, la determinación de la movilidad de las proteínas en su interior y la medición de las densidades de las proteínas. Se esboza una hoja de ruta para la construcción de un microscopio de reflexión interna total con reducción de ruido, que permite visualizar fluorocromos residentes de una sola capa con alta resolución espacio-temporal.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

Demostramos un método para la imagen de múltiples moléculas dentro de nano-estructuras heterogéneas con una sola molécula exactitud utilizando secuencial vinculante y elución de fluorescently marcó anticuerpos.

Multiplexado de alta resolución de imágenes de células T utilizando madSTORM

Aquí, presentamos un protocolo para la localización de varios color de proteínas de membrana único en organelos de células vivas. Para colocar fluoróforos, se usan proteínas auto etiquetadas. Proteínas, situadas en compartimientos diferentes membranas de la mismo orgánulo, se pueden localizar con una precisión de ~ 18 nm.

Microscopía de localización de varios colores solo de proteínas de membrana en organelos de células mamíferas vivas

Presentamos un protocolo para la detección óptica en tiempo real de las proteínas solo como se secretan de las células vivas. Esto se basa en Microscopia interferométrica dispersión (iSCAT), que puede ser aplicada a una variedad de configuraciones y sistemas biológicos diferentes.

Etiqueta-libre la proyección de imagen de solo proteínas secretada desde las células viven por medio de la iSCAT microscopía

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la homogeneidad de etiquetado para cada especie de proteína en una muestra de proteína compleja en el nivel de molécula única.

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

La microscopía de localización de una sola molécula 3D se utiliza para sondear las posiciones espaciales y las trayectorias de movimiento de las proteínas etiquetadas fluorescentes mente en células bacterianas vivas. El protocolo experimental y de análisis de datos descrito en este documento determina los comportamientos difusivos prevalentes de las proteínas citosólicas basadas en trayectorias agrupadas de una sola molécula.

Microscopía de seguimiento de una sola molécula - Una herramienta para determinar los estados difusos de las moléculas citosólicas

Este protocolo describe un enfoque de procesamiento de imágenes basado en iSCAT y seguimiento de una sola partícula que permite la investigación simultánea de la masa molecular y el comportamiento difusivo de las macromoléculas que interactúan con las membranas lipídicas. Las instrucciones paso a paso para la preparación de muestras, la conversión de masa a contraste, la adquisición de películas y el posprocesamiento se proporcionan junto con instrucciones para prevenir posibles trampas.

Seguimiento de partículas sensibles a la masa para caracterizar la dinámica de macromoléculas asociada a la membrana

Aquí, se presenta un protocolo para realizar y analizar la unión, movilidad y ensamblaje de moléculas individuales en membranas lipídicas artificiales apiñadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de molécula única (smTIRF).

Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros

Este artículo ofrece una descripción detallada de cómo crear muestras para el seguimiento de una sola proteína en bicapas lipídicas soportadas por sólidos. También explica un microscopio de fluorescencia sencillo con sensibilidad a una sola molécula y una tasa de fotogramas rápida. Finalmente, describimos el procedimiento para extraer trayectorias de una sola proteína.

Seguimiento de proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia

Aprende a visualizar interacciones antígeno-anticuerpo a nanoescala en membranas de células T mediante marcaje de anticuerpo único. Este protocolo permite observar directamente la unión de anticuerpos en su entorno celular nativo.

Microscopía de localización de moléculas individuales de proteínas de membrana utilizando marcaje de anticuerpo único

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