Microscopía de localización de moléculas individuales de proteínas de membrana utilizando marcaje de anticuerpo único

Mi investigación se centra en la membrana de las células T y pretende revelar nuevos conocimientos a nanoescala relevantes para la segmentación terapéutica. Los métodos de imagen existentes no suelen visualizar directamente las interacciones anticuerpo-epítopo a nanoescala en las células. Este protocolo supera esa limitación permitiendo la observación directa dentro del entorno celular.

Después de montar la muestra en el microscopio y depositar coloides de oro en la superficie, se utiliza iluminación de campo brillante para verificar que se hayan depositado suficientes coloides en la región de interés. Confirma que la densidad ideal de 5 a 10 coloides de oro está presente dentro de la región de interés antes de continuar. Para la configuración óptica del fluoróforo de la sonda de anticuerpos, abre el software de imagen y accede a los ajustes de configuración óptica.

Seleccione el espejo dicróico adecuado y establezca la longitud de onda y densidad de potencia de excitación del láser. Ajusta el tiempo de integración de la cámara y selecciona el filtro de emisiones. Luego, ajusta el binning de píxeles de la cámara para lograr un tamaño de píxel de 150 a 160 nanómetros.

Ahora, crea una configuración óptica para el paso de decoloración de fotos seleccionando un modo de blanqueamiento fotográfico en el software de imagen. Configura la potencia láser al 100% y ajusta el tiempo de integración de la cámara a un segundo. Establece los parámetros de imagen en el software de adquisición de imagen definiendo el intervalo de no iluminación, el número de fotogramas y la frecuencia del paso de blanqueamiento fotográfico.

A continuación, preparar el tampón de imagen diluyendo el anticuerpo CD81 a una concentración de 1 microgramo por mililitro en 200 microlitros de 5% BSA producidos en DPBS. La concentración final recomendada de anticuerpos es 0,5 nanomolares para las células T Jurkat, o 2 nanomolares para las células U-2 OS. Añadir el buffer de imagen preparado al pozo que contiene las celdas y comenzar la adquisición de imagen en el software para iniciar la recogida de datos.

Utiliza la función de visualización en vivo en el software de imagen configurado para el marcaje de anticuerpos individuales de membrana para monitorizar la unión de anticuerpos en tiempo real. Configura los parámetros de imagen en el software de adquisición de imagen para obtener al menos una adquisición de 10 fotogramas y establece el intervalo no iluminado a cinco segundos. Inicia la adquisición y evalúa la escasez de localizaciones de moléculas individuales en la película grabada.

Si se observan múltiples eventos de unión a anticuerpos superpuestos inmediatamente después de añadir el tampón de imagen, o si se acumulan localizaciones de una sola molécula con el tiempo, se aborta la adquisición. Reducir la concentración de anticuerpos por el doble y repetir la adquisición en una nueva muestra. Continúa duplicando la concentración de anticuerpos y reevaluando el número de eventos por unidad de área hasta alcanzar la densidad deseada de localización de molécula única.

Si la densidad de eventos es escasa, aumenta la concentración de anticuerpos en el buffer de imagen por duplicarse. Repite la adquisición en una nueva muestra y continúa duplicando la concentración de anticuerpos mientras se reevalúa el número de eventos de unión por unidad de área hasta alcanzar la densidad deseada de localización de molécula individual. Para optimizar intervalos sin iluminación, configura los parámetros de imagen en el software de adquisición de imagen para obtener una adquisición de 50 fotogramas.

Tras añadir el anticuerpo y comenzar la adquisición, evalúa la densidad y escasez de localizaciones de moléculas individuales en la película grabada. Determinar el intervalo no iluminador más bajo que produce una densidad óptima de eventos de una sola molécula. Finalmente, si ocurren eventos de unión que se solapan espacialmente a medida que avanza la adquisición de la imagen, introduce un paso de blanqueamiento fotográfico a intervalos regulares.

Ajusta la frecuencia de fotoblanqueo para eliminar la fluorescencia de los anticuerpos unidos antes de que se acumulen eventos superpuestos. Establece la ruta del archivo en el software MATLAB hacia la carpeta que contiene el archivo de valores separados por comas de M celdas reconstruido. Ejecuta el código haciendo clic en Ejecutar en la barra de herramientas MATLAB.

Cuando se lo pida, selecciona el archivo CSV de celda M y haz clic en Abrir para cargarlo en el programa. Ejecuta el análisis usando las entradas previamente definidas como punto de partida. Evaluación del diagrama de dispersión que contiene los datos de localización no agrupados.

Elige un valor mínimo en puntos que sea mayor que el número de localizaciones de ruido pero menor que el número de localizaciones en la celda. Evalúa la ventana que muestra los datos agrupados. Confirma que los racimos se mantienen en la célula con el fenotipo esperado mientras que las localizaciones fuera de la célula se minimizan.

Si los parámetros de agrupamiento son demasiado restrictivos, disminuye el valor mínimo en puntos y aumenta la épsilón. Si los parámetros de agrupamiento son demasiado inclusivos, aumenta el valor mínimo en puntos y disminuye la épsilón. Finalmente, tras ajustar el valor mínimo de puntos y la epsilon, vuelve a ejecutar el código para obtener un agrupamiento óptimo.

Las células T de Jurkat quedaron inmovilizadas con suficiente espacio para preservar la integridad de la membrana y permitir el acceso de anticuerpos a los epítopos de membrana. Se visualizaron coloides dorados y se utilizaron como marcadores fiduciales para la corrección de deriva lateral durante la adquisición de imágenes de células M. La optimización del intervalo sin iluminación mostró que un intervalo de cinco segundos producía eventos de unión de anticuerpos con una superposición espacial mínima en comparación con intervalos más cortos o largos a una concentración de nanomolar.

La aplicación de corrección por deriva mejoró la imagen de la celda M reconstruida en comparación con la reconstrucción sin corregir. El agrupamiento basado en densidad de las localizaciones de las células M redujo las interacciones de fondo de baja densidad y destacó los eventos de unión agrupados de CD81. Podemos observar cómo los anticuerpos interactúan con sus epítopos de membrana en un entorno celular, proporcionando información relevante para los anticuerpos terapéuticos.

La concentración de anticuerpos, el intervalo de no iluminación y los pasos de fotoblanqueo son fundamentales para optimizar. Los parámetros subóptimos comprometen los resultados. El marcaje de un solo anticuerpo puede extenderse para evaluar simultáneamente la unión a proteínas de membrana por múltiples anticuerpos dentro del mismo entorno celular.