Un protocolo simplificado para microscopía de localización de molécula única en núcleos de Arabidopsis

Mi investigación se centra en la edición epigenomica y la visualización de la organización de la cromatina en núcleos de Arabidopsis mediante microscopía de superresolución. Los métodos existentes no están adaptados a la imagen STORM. Este protocolo mejora la pureza de los núcleos, la consistencia del marcado, el montaje de muestras y la estabilidad de la imagen.

Se aplica a Arabidopsis thaliana y otros sistemas vegetales para estudiar la organización nuclear, la estructura de la cromatina y la epigenética en alta resolución. Para empezar, coloca una placa de cultivo de seis pozos sobre hielo bajo la campana extractora. Mezclar la solución de fijación que contiene un 4% de volumen por volumen, formaldehído estabilizado por metanol 0,1%, Triton X100 y PBS.

Añade aproximadamente cuatro mililitros de solución de fijación con hielo en cada pozo bajo la campana extractora. Utilizando pinzas limpias, retira las plántulas de Arabidopsis que estén entre ocho y quince días después de la germinación de Murashige y Skoog sólidos de media concentración, o medio MS. Sumerge inmediatamente las plántulas en la solución de fijación y coloca aproximadamente 20 plántulas por pozo.

Utiliza tres pozos para obtener suficiente material por muestra. Coloca la placa en la cámara de vacío llena de hielo y ciérrala. Aplica un ciclo de vacío entre menos 0,6 bar y menos 0,8 bar durante 15 minutos para eliminar el aire atrapado y permitir una penetración profunda del fijador en los tejidos vegetales.

Luego, suelta el vacío poco a poco. Mezcla la muestra y aplica el vacío durante otros 15 minutos. Debajo de la campana extractora, retira la solución de fijación con una pipeta.

Lava cada pozo tres veces durante 10 minutos cada uno con una agitación suave usando cinco mililitros de PBS bien frío. Después de lavar, quita el PBS. Usando pinzas, transfiere el tejido fijo a una placa de Petri de 120 por 120 milímetros y añade 50 microlitros de buffer de aislamiento de núcleos a las plántulas fijas.

Con una cuchilla, corta el tejido fijo. Usando la misma hoja, raspa el tejido picado hasta un borde de la placa de Petri. Añade 600 microlitros de buffer de aislamiento de núcleos y lava cualquier tejido pegado a la hoja.

Transfiere la suspensión de tejido a un tubo homogeneizador Dounce de dos mililitros y acaricia de cinco a diez veces con el mano de mano más pequeño. Luego, acaricia con el mano de mano más grande hasta que se mueva suavemente dentro del tubo, normalmente requiriendo entre cinco y diez embestidas de cinco a diez pasadas. Filtra la muestra homogeneizada a través de un filtro de malla de 30 micrómetros en un tubo de 50 mililitros.

Transfiere el filtrado a un tubo nuevo de 1,5 mililitros. Centrifuga la suspensión durante 10 minutos a 800G usando la rampa más baja tanto para la aceleración como para la desaceleración. Tras la centrifugación, hay que observar que entre los restos de tejido verde es visible un pequeño pellet blanco.

Desechar el sobrenadante y volver a suspender el perdigón en 600 microlitros de tampón de aislamiento de núcleos. Centrifuga de nuevo durante 10 minutos a 800G y retira el sobrenadante. Tras lavar completamente los restos verdes, almacenar la suspensión de núcleos aislados a cuatro grados Celsius durante un máximo de una semana y inmunotinchar los núcleos con los anticuerpos deseados.

Calienta la solución de agarosa de baja fusión al 1,5% en peso por volumen a 90 grados Celsius durante un minuto para disolver el polvo y obtener una solución clara. Vórtice brevemente para asegurar una mezcla completa. Enfría la solución y mantenla a 37 grados Celsius antes de proceder para evitar la desnaturalización térmica del tampón de glucosa oxidasa.

Después de que la solución de agarosa de baja fusión alcance los 37 grados Celsius, prepare el tampón STORM añadiendo 100 milimolares de mercaptoetilamina y tampón de glucosa oxidasa a la agarosa de baja fusión para lograr una concentración final 1X y mezclar la solución suavemente. Deposita 10 microlitros de la mezcla de núcleos sobre una capa de cobertura de 1,5 horas tratada con ozono que haya sido tratada durante 20 minutos en un sistema de limpieza ultravioleta con ozono. Espera tres minutos para permitir que los núcleos se depositen en el desliz de la cubierta.

Luego, retira el exceso de líquido y espera dos minutos. Añade 10 microlitros de la agarosa preparada de baja fusión al engobe de la cubierta y cubre inmediatamente con una lámina de microscopio. Sella la cubierta con sellador de silicona.

Mezcla cantidades iguales de solución A y solución B en una pequeña placa de Petri usando una punta de micropipeta. Aplica la mezcla sobre los bordes del engobe de la cubierta para sellar la muestra. Deja que el sellador de silicona se endurezca durante cinco minutos.

Monta la lámina de muestra en el microscopio y encuentra el enfoque. Localiza y céntrate en un núcleo. Activar un módulo de mantenimiento de enfoque si está disponible para garantizar estabilidad durante adquisiciones largas.

Seleccione una región donde uno o varios nanodiamantes estén posicionados cerca del núcleo para mejorar la corrección de deriva durante la reconstrucción. Para la imagen de dos colores, comienza la adquisición con el canal de longitud de onda más larga y luego cambia al canal de longitud de onda más corta para completar la imagen. Procesa las pilas de imágenes en bruto en ThunderSTORM usando ajuste gaussiano con estimación de mínimos cuadrados ponderados y genera imágenes reconstruidas.

Aplicar filtrado basado en sigma e incertidumbre por debajo de 30 nanómetros para mantener localizaciones precisas y eliminar el ruido. Finalmente, realiza la corrección de deriva de muestra usando correlación cruzada ThunderSTORM o el algoritmo COMET y confirma la deriva mínima en las imágenes reconstruidas. Se aislaron núcleos de plántulas silvestres de 15 días de antigüedad inmunomarcadas con anticuerpos secundarios conjugados AF647 y contra-teñidas con Hoechst H33258.

La imagen confocal mostró múltiples núcleos aislados y bien conservados con residuos mínimos, con cromocentros y el nucléolo claramente distinguibles. La señal de la ARN polimerasa II estaba ausente en los cromocentros y en el nucleolo. La difracción limitó las proyecciones de máxima intensidad y las correspondientes reconstrucciones SMLM revelaron detalles estructurales de la ARN polimerasa II y el marcaje del ADN, incluyendo regiones de interés agrandadas que mostraban estructuras más finas.

El filtrado de localización basado en sigma e incertidumbre mejoró la definición tanto de la ARN polimerasa II como de las señales de ADN en comparación con las localizaciones detectadas. Y un mayor refinamiento tras la corrección de deriva mantuvo esta estructura mejorada. El filtrado basado en valores sigma eliminó localizaciones con anchos ajustados excesivamente pequeños o grandes.

El análisis de correlación en anillo de Fourier mostró que la resolución en el canal AF647 mejoró de 90,1 a 47,7 nanómetros tras el filtrado, mientras que el canal JF549 mejoró de 56,6 a 27,9 nanómetros. Mantener la integridad nuclear minimizando los residuos y la fluorescencia de fondo es fundamental para lograr imágenes de moléculas individuales de alta calidad. Estudios futuros pueden vincular la arquitectura nuclear con la regulación génica bajo condiciones ambientales o de desarrollo.