Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

El objetivo general de este procedimiento es descubrir interacciones proteicas con moléculas de cebo inmovilizadas. Esto se logra primero adquiriendo e inmovilizando el cebo. El segundo paso consiste en introducir la biblioteca de fagos que se va a tamizar frente al cebo en condiciones que promuevan la unión.

A continuación, se eliminan los fagos no unidos mediante lavados rigurosos. Mientras tanto, los fagos unidos se utilizan para infectar las bacterias antes de ser recuperados. El paso final consiste en amplificar los fagos unidos para la siguiente iteración de selección de afinidad.

Finalmente, cuando el título del fago se estabiliza, se seleccionan placas individuales y se secuencian para mostrar qué proteínas tienen la mayor afinidad por la cadena rezagada inmovilizada bajo las condiciones experimentales de unión. Este proceso puede ayudar a responder preguntas clave sobre las interacciones entre proteínas. Este procedimiento comienza con la proteína recombinante purificada colocada en el fondo de placas de microtitulación según se describe en el protocolo del texto.

El siguiente paso consiste en inocular 50 mililitros de medio Luria burani con 100 microgramos por mililitro de ampicilina en un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros con una colonia aislada que se haya crecido previamente según se describe en el protocolo del texto, incubar a 37 grados Celsius, 200 RPM en un agitador horizontal y utilizar un espectrofotómetro para monitorear la densidad celular hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,5 a 0,6. A continuación, vierta las células en un tubo Falcon de 50 mililitros o similar y manténgalas a cuatro grados Celsius hasta su uso; por lo general, las células permanecen viables durante aproximadamente una semana. El día uno, prepare todo para la selección por afinidad según se describe en el protocolo del texto, por la mañana del día dos.

Coloque nueve matraces Erlenmeyer de 250 mililitros vacíos y esterilizados en autoclave en las pinzas de un agitador incubador, inocule 500 mililitros de caldo LB con 500 microlitros de una de las cultivos nocturnos de células BLT5403 infectadas con fago iniciadas la noche anterior. Después de colocar el matraz en el incubador, encienda el espectrofotómetro y ajústelo para leer la absorbancia a 600 nanómetros. Mientras tanto, retire la placa de microtitulación de cuatro grados Celsius y quite la película de plástico. Elimine cualquier proteína no unida de la placa lavando 10 veces con 200 microlitros por pocillo de solución salina tamponada con tris 1X o TBS pH 7,5 y golpeando la placa boca abajo sobre una toalla de papel entre cada lavado.

Bloquee con 200 microlitros por pocillo de reactivo bloqueador al 5 % en TBS durante una hora. Con la placa envuelta en film plástico, elimine el reactivo bloqueador lavando 10 veces con 200 microlitros de TBS-T 1X, golpeando la placa boca abajo sobre cuatro capas de papel absorbente entre cada lavado.

A partir de aquí, utilice puntas con barrera de filtro para evitar la contaminación cruzada por fagos. Pipete 100 microlitros de la biblioteca de fagos junto con las proteínas. Vuelva a sellar la placa con papel de plástico y incube a temperatura ambiente durante una hora.

Al final de una hora, retire la envoltura de plástico de la placa y lave inmediatamente agitando para eliminar el fago en el desecho biopeligroso. Luego, utilice un multicanilla para agregar rápidamente 200 microlitros de una X-T-B-S-T a cada pozo. Configure un temporizador durante un minuto.

Después de un minuto, agite el tampón hacia el residuo biopeligroso, golpee la placa boca abajo sobre una toalla de papel y colóquela nuevamente sobre el banco. Repita los pasos de lavado 10 veces tras el décimo lavado. Tome 200 microlitros de células BLT 5 4 0 3 del tubo cónico de 50 mililitros a cuatro grados Celsius y transfiera a la parte inferior de cada uno de los nueve pozos de los que se ha eliminado el último lavado.

Envuelva las placas con papel de plástico y colóquelas a 37 grados Celsius durante 20 minutos para permitir que cualquier fago que aún esté adherido al cebo infecte las bacterias. Al final de los 20 minutos, desenvuelva las placas. A continuación, retire 10 microlitros de bacterias del pozo de replicación de BSA a 25 grados Celsius y transfiera a los 990 microlitros de medio marcado como uno.

Repita este proceso otras dos veces para ese pocillo, obteniendo así tres réplicas triples de una dilución de uno a 100 del fago proveniente de ese pocillo; esto es replicación de BSA uno muestreada tres veces. Estas diluciones se utilizarán para estimar la titulación promedio más o menos el error estándar de la media para esa replicación de BSA. Haga lo mismo para la replicación dos y tres de BSA, para los tres pocillos replicados de la proteína cebo envenenada y para el conjunto de proteína cebo. Coloque aparte estos 27 tubos EOR. Si las bacterias en el matraz tienen una densidad óptica entre 0,6 y 1,0, vierta 50 mililitros de las células del matraz Erlenmeyer en cada uno de los 9 matraces Erlenmeyer de 250 mililitros.

Tome los 170 microlitros restantes de bacterias BLT 5 4 0 3 infectadas con fagos en el pocillo de replicación de BSA y añádalos a los 50 mililitros de células marcados como BSA rep.Uno. Haga esto para los nueve pocillos antes de agitar los matraces en el incubador a 37 grados Celsius. Mientras tanto, realice diluciones a partir de las 27 diluciones iniciales tomando 100 microlitros de LB con bacterias del tubo Einor uno y añadiéndolos a los 900 microlitros de LB en el tubo einor.

Cuatro para la dilución de 10 a la menos tres, deseche la punta con barrera de filtro y use una nueva antes de tomar 100 microlitros de LB con bacterias del tubo einor cuatro y agregarlos a los 900 microlitros de LB en el tubo eph. Siete para la dilución de 10 a la menos cuatro, continúe la dilución para todos los triplicados de todas las réplicas de todas las proteínas y tratamientos. Debe haber 135 tubos en total una vez que las células hayan lizado.

Lleve el cultivo a cloruro de sodio 0.5 molar añadiendo cinco mililitros de un stock de cloruro de sodio 5 molar y transfiera la muestra a un frasco para centrífuga etiquetado; centrifugue a 8,000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, deseche el sobrenadante que contiene el virus en un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Añada unas gotas de cloroformo al sobrenadante decantado en el tubo cónico.

El sobrenadante puede almacenarse a cuatro grados Celsius para la siguiente ronda de selección de afinidad el día tres; pipetee 250 microlitros de células VLT 5 4 0 3 desde cuatro grados Celsius hacia cada uno de los tubos de ensayo de borosilicato numerados previamente preparados. Luego, pipetee 100 microlitros de la dilución en el tubo de einor uno hacia los 250 microlitros de células en el tubo de ensayo de borosilicato Uno. Caliente brevemente los primeros cinco centímetros de la pipeta sobre la llama e insértela en el agar fundido superior.

Aspire tres mililitros y dispense rápidamente en el tubo de ensayo sobre las células y el fago. Mezcle golpeando ligeramente con un dedo mientras sostiene el tubo con la otra mano, y luego vierta el contenido sobre la placa. Incline la placa y utilice el tubo de ensayo para eliminar burbujas y zonas secas hasta que toda la placa esté cubierta por el agar superior.

Déjelo aparte en posición vertical sobre la mesa para que se enfríe. Deseche el tubo de borosilicato. Extraiga la punta con barrera de filtro y tome una nueva, y continúe hasta que todas las diluciones hayan sido envasadas en placas.

Retire las placas preparadas del incubador a medida que se agoten, pero no más de seis a la vez, ya que de lo contrario se enfrían y el agar superior solidifica demasiado rápido; examine las placas formadas en las placas y deseche aquellas con lisis confluentes. Determine cuáles de las diluciones seriadas restantes han producido un número suficientemente bajo de placas para permitir un recuento preciso. Registre el número de placas a partir de estas placas y continúe calculando la titulación según se describe en el protocolo del texto al final de la selección por afinidad. En la cuarta ronda, seleccione 18 colonias individuales bien definidas utilizando la punta estéril de un pipeta amarilla.

Humezca el interior de la punta con clorhidrato de tris pH 8,5 en un tubo einor. Luego, extraiga los núcleos de estas placas a partir de las placas de titulación insertando la punta a través de una placa bien aislada directamente hasta el fondo del plato de Petri de plástico y aspirando el núcleo; expulse el núcleo en 100 microlitros de clorhidrato de tris pH 8,5 en el tubo correspondiente antes de mezclar mediante vortex. Breve calentamiento de 20 microlitros de este volumen a 65 grados Celsius durante 10 minutos y continúe con la PCR y la secuenciación según se describe en el protocolo de texto mostrado aquí, que son resultados típicos de titulación mediante muestreo repetido; las cifras finales estimadas no son tan susceptibles a errores de pipeteo y proporcionan una estimación más precisa de la titulación real y la variación alrededor de esta.

Se obtienen estimaciones de pozo a pozo con un aumento del título de fagos preferentemente en el cebo no envenenado a medida que aumenta el número de rondas de selección por afinidad. Asimismo, esto proporciona confianza en que la técnica está funcionando. La retención de un porcentaje creciente de fagos que contienen el inserto en los pozos con cebo no envenenado a medida que aumenta el número de selecciones por afinidad también es favorable tras rondas avanzadas de selección por afinidad.

Un aumento en el número de fagos recuperados independientemente que poseen insertos en comparación con la primera ronda, junto con la formación de estos amplicones en unas pocas bandas de tamaño idéntico, es una buena indicación de que determinados clones están siendo seleccionados en la selección por afinidad siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el sistema de dos híbridos, para validar las interacciones descubiertas mediante la presentación en fagos.