Name: Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Aprende el protocolo de fagos y selección de afinidad para identificar interacciones proteicas usando cebas inmovilizadas. Este método permite descubrir proteínas con alta afinidad de unión de manera eficiente.

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Este proyecto fue parcialmente financiado por un IOS NSF (0849230); Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), Fondo Semilla USDA (2011 a 04375), y Sir Frederick McMaster de Becas de Investigación de ABD.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Mediante la ejecución del experimento en tres pocillos replicados, fago adquirido de forma independiente de la misma proteína de unión al cebo puede distinguirse incluso si son del mismo clon (es decir, no hay diferencia en la secuencia de nucleótidos de la región de CDS que ha sido adquirida, pero estos han sido recuperados de pozos independientes). De lo contrario, la única manera de distinguir entre el fago que codifica la misma proteína de unión a la carnada es si son independientemente inversa regiones tra...

¿Por qué utilizar la presentación en fagos y selección por afinidad en vez de las otras técnicas disponibles para miles de descubrir e investigar las interacciones de proteínas con otras moléculas? La presentación en fagos puede reclamar algunas ventajas únicas sobre otros métodos de detección de interacciones proteína-ligando de 1-3, incluyendo lo siguiente: Muy amplio repertorio de moléculas de cebo La razón más importante es en la diversidad de moléculas capaces de actuar como cebo en la selección por afinidad 4. La presentación en fagos es un medio muy poderoso para aislar fragmentos de proteínas que interactúan con otras proteínas, nucleótidos, carbohidratos, etc 5 Esencialmente, si un polímero / molécula puede estar unido a un soporte recuperable, que puede ser examinado para afinidad con las proteínas mostradas de fagos. Además, la molécula de cebo se puede acceder para determinar si se retiene la actividad biológica cuando se inmoviliza 6, si las condiciones utilizadas para reducir / eliminar su actividad son eficaces o 6, de introducir modificaciones después de la traducción a la carnada antes de la selección por afinidad. Resistencia a los fagos a factores externos Una segunda razón para el uso de presentación en fagos, es que es posible que algunos cebos pueden requerir estrés ambiental (calor, altas concentraciones osmolíticas, cofactores específicos, etc.) Para capturar sus proteínas que interactúan, o las proteínas que se muestran fagos puede necesitar ser alterado de alguna manera antes de la selección por afinidad. El factor principal que se está estudiando es la interacción entre la proteína cebo y, no la condición de que permite la interacción que se produzca o si es letal para el organismo de prueba. El fago T7 está particularmente bien adaptado a este tipo de estudios, ya que puede soportar condiciones experimentales duras tanto intactas y viables (por ejemplo, el máximo térmico publicado para la viabilidad de T7 es de ~ 60 ° C 7). Como un ejemplo de fago que altera la muestra Proproteínas, al examinar el proteoma de semillas de Arabidopsis thaliana para sustratos de proteína de la enzima reparadora, Proteína Isoaspartyl metil transferasa (PIMT), el virus usado en estos estudios habían sido &quot;abierto&quot; durante una semana, antes de cada ronda de selección por afinidad, para fomentar la introducción de isoaspartate (isoAsp) los residuos en las proteínas susceptibles 6 que no es posible en los organismos que pueden reconocer y reparar / metabolizar tales anomalías. Metabólicamente inerte Además, el fago son generalmente resistentes a venenos metabólicos y interferir moléculas pequeñas que, por lo menos, dar lugar a efectos pleiotrópicos sobre los organismos de prueba metabólicamente activas. Tras los lavados de rigurosidad, el veneno se elimina antes de que un gran volumen de bacterias se introducen para la infección de modo que el veneno se diluye a una gama inocuo para las bacterias o la replicación del fago posterior. Mientras investiga dianas proteicas de la reparación PIMTenzima, S-adenosil metionina (AdoMet) se utiliza para activar la enzima de microtitulación-placa-así inmovilizado para permitir la captura de la proteína diana mientras que confían en S-adenosil homocisteína (AdoHcy) para inactivar la enzima y proporcionar un control negativo útil en asegurar el conocimiento de que el virus no se vería influenciada negativamente por cualquiera AdoMet o AdoHcy 6. Además, los miembros de ciertas familias de la embriogénesis tardía abundante de proteínas (LEA), investigados en este laboratorio, se sabe que altera su forma en presencia de aditivos tales como sacarosa 8, que pueden alcanzar concentraciones de hasta 200 mm de semillas de soja en el punto de madurez fisiológica 9. No se prevé que el virus sea influenciado por adición de sacarosa 200 mM en cada ronda de selección por afinidad, posiblemente necesario para determinadas interacciones de proteínas de LEA-cliente, que no es el caso de organismos de ensayo viables autónoma 10. Esta práctica de laboratorio se ha centrado en DESCUBRIRg interacciones proteína-proteína en semillas maduras, deshidratados o en germinación que subyacen en el mecanismo de protección proteoma almacenado durante la deshidratación 11 o la reparación de componentes de la proteoma almacenado que son susceptibles a la formación isoAsp una vez que la semilla ha embebido 6. Por lo tanto, la producción y purificación de las proteínas recombinantes requeridos como cebo en un estado activo, y la garantía de que se mantengan así, antes y después de que se inmovilizan, aunque con frecuencia difícil, es una piedra angular de nuestro trabajo. Sin embargo, a medida que cada escenario de producción de proteínas recombinantes es diferente, las condiciones para la optimización de la producción de proteína recombinante no se abordan aquí. Se insta a los usuarios a intentar, siempre que sea posible, para determinar si la proteína inmovilizada es aún funcional (por ejemplo, si se trata de una enzima, hacer un ensayo enzimático en los pocillos de la placa de microtitulación). Esto proporciona cierta confianza en que el cebo es biológicamente activo y por lo tanto, que cualquier interacción descubiertos sonalgo más propensos a tener relevancia biológica.

<table><tbody><tr><td>Triptona</td><td>Becton Dickinson Co.</td><td></td><td></td>211705</tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products International</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de bloqueo</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>69064</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-212</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BLT5403</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>BLT5403</td><td>Genotipo: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)Ampicilina</td></tr><tr><td>, Sal de sodio</td><td>Research Products International</td><td>A40040</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP102-1</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario Penta-HIS</td><td>Qiagen Inc.</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado de fosfatasa alcalina anti-ratón de cabra</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-5153</td><td></td></tr><tr><td>para-Nitrofenilfosfato</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>N-7653</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación T7-UP</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td></td><td>5'-GGAGCTGTCGTCCAGTC-3'T7-DOWN</td></tr> <tr><td>imprimación</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td></td><td>5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick</td></tr> <tr><td>PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen Inc.</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel Qiaquick </td><td>Qiagen Inc.</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Big Dye Terminator v3.1 Kit de secuenciación de ciclo</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>4336917</td><td></td></tr><tr><td>Bloque calefactor</td><td>Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)</td><td>18780</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>Costar 3590</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Incubadora Horno</td><td>Fisher Scientific</td><td>516D</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipetas, 5 &#190; en</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>ChromaView Transilluminator</td><td>UVP Inc.</td><td>TS-15</td><td></td></tr><tr><td>UV Shield</td><td>Oberon</td><td>071AF</td><td></td></tr><tr><td>Guantes, Nitrilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-170-010C</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estériles de 1,5 ml</td><td>USA Scientific Inc</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de borosilicato de 10 ml Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-678-25E</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de borosilicato</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-27</td><td></td></tr><tr><td>Uniskan I, lector de placas ELISA</td><td>Labsystem y Flow Laboratories, Helsinki, Finlandia</td><td>Tipo 362</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Uso de fago recombinante como un andamio para presentar diversas porciones de proteínas codificadas por una biblioteca de ADNc clonado direccionalmente a las moléculas inmovilizadas de cebo es un medio eficaz para descubrir las interacciones. La técnica ha sido ampliamente utilizado para descubrir las interacciones proteína-proteína, pero la molécula cebo a ser cuestionada no tiene que ser restringida a las proteínas. El protocolo que aquí se presenta ha sido optimizado para permitir un modesto número de cebos que se proyectarán en réplicas de maximizar la identificación de clones independientes que presentan la misma proteína. Esto permite una mayor confianza en que interactúan las proteínas identificadas son interactores legítimos de la molécula de cebo. Control de la titulación del fago después de cada ronda de selección por afinidad proporciona información sobre cómo la selección por afinidad está progresando, así como sobre la eficacia de los controles negativos. Un medio de titulación de los fagos, y cómo y qué preparar con antelación para permitir que este proceso progrese lo más eficientementeposible, se presenta. Atributos de amplicones obtenidos después del aislamiento de la placa independiente se destacan que se puede utilizar para determinar lo bien que la selección por afinidad ha progresado. Se explican las técnicas de solución de problemas para minimizar los falsos positivos o de eludir persistentemente recuperó fago. Los medios para reducir la contaminación viral brote se discuten.

Ser capaz de poner en peligro la capacidad de la carnada para interactuar con las proteínas en fagos (metabólicamente envenenando el cebo) proporciona un control negativo potente para esta técnica. También es aconsejable para determinar si el cebo, cuando se une a la placa de microtitulación así, conserva su función. Ambos controles aumentará la confianza que interactúan, las proteínas en fagos recuperados por el cebo nonpoisoned son legítimas. Muestreo tres triplicado de cada pocillo aument...

La presentación en fagos es una técnica poderosa para capturar las proteínas o restos de proteínas que interactúan con una molécula inmovilizada de interés. Una vez que se ha tomado una decisión del tipo de fago biblioteca de cDNA para crear y pantalla, el protocolo aquí descrito permite la selección por afinidad eficaz que conduce a la identificación de los interactores.

Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

El objetivo general de este procedimiento es descubrir interacciones proteicas con moléculas de cebo inmovilizadas. Esto se logra primero adquiriendo e inmovilizando el cebo. El segundo paso consiste en introducir la biblioteca de fagos que se va a tamizar frente al cebo en condiciones que promuevan la unión.A continuación, se eliminan los fagos no unidos mediante lavados rigurosos. Mientras tanto, los fagos unidos se utilizan para infectar las bacterias antes de ser recuperados. El paso final consiste en amplificar los fagos unidos para la siguiente iteración de selección de afinidad.Finalmente, cuando el título del fago se estabiliza, se seleccionan placas individuales y se secuencian para mostrar qué proteínas tienen la mayor afinidad por la cadena rezagada inmovilizada bajo las condiciones experimentales de unión. Este proceso puede ayudar a responder preguntas clave sobre las interacciones entre proteínas. Este procedimiento comienza con la proteína recombinante purificada colocada en el fondo de placas de microtitulación según se describe en el protocolo del texto.El siguiente paso consiste en inocular 50 mililitros de medio Luria burani con 100 microgramos por mililitro de a

a-protocol-for-phage-display-affinity-selection-using-recombinant

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

AVEXIS es una proteína de alto rendimiento ensayo de la interacción desarrollada para detectar sistemáticamente nuevos ligando extracelular del receptor de los pares que intervienen en los procesos de reconocimiento celular. Se ha diseñado específicamente para detectar las interacciones proteína transitorios que son difíciles de identificar el uso de otros métodos de alto rendimiento.

Avidez detección basada en la interacción extracelular (AVEXIS) para la detección escalable de extracelular de baja afinidad interacciones ligando-receptor

En este video, demostramos la técnica de visualización de fagos para aislar fagos prediseñados que expresan proteínas con alta afinidad por la proteína objetivo.

Uso de la visualización de fagos para seleccionar proteínas con alta afinidad con una proteína objetivo

Se describe un método con acompañamiento visual para conducir, las selecciones de rendimiento altos escalables de bibliotecas de anticuerpos sintéticos combinatorios fagos contra cientos de antígenos simultáneamente. El uso de este enfoque paralelo, hemos aislado fragmentos de anticuerpos que exhiben alta afinidad y especificidad para diversos antígenos que son funcionales en inmunoensayos estándar.

Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

Bibliotecas de exhibición bacteriana Biopanning es una técnica probada para el descubrimiento de los reactivos de la afinidad del péptido, una alternativa robusta a los anticuerpos. El método de ordenación semi automatizado en este documento ha aerodinamizado biopanning para disminuir la ocurrencia de falsos positivos. Aquí ilustramos el proceso de pensamiento y técnicas aplicadas en evaluar a los candidatos y la minimización de análisis aguas abajo.

Biopanning semi-automatizado de bibliotecas de exhibición bacteriana péptido afinidad reactivo descubrimiento y análisis de los aislamientos que

Los protocolos descritos permiten la construcción, caracterización y selección (contra el blanco de la opción) de una biblioteca de "domainome" de cualquier fuente de ADN. Esto se logra mediante una tubería de investigación que combina diferentes tecnologías: exhibición phage, un reportero plegable y próxima generación la secuencia con una herramienta web de análisis de datos.

Interactoma-Seq: Un protocolo para la biblioteca de Domainome construcción, validación y selección de Phage Display y la siguiente secuencia de generación

Este protocolo describe un procedimiento detallado para la construcción de una biblioteca de fago que aparecen anticuerpos sintéticos con diversidad a medida. Anticuerpos sintéticos tienen amplias aplicaciones desde la investigación básica para diagnósticos de enfermedad y terapéutica.

Construcción de fagos sintético muestra fabulosa biblioteca con diversidad a medida

Aquí presentamos un método para seleccionar nuevas variantes de la E. coli biotin-protein ligase BirA que biotinyla un péptido objetivo específico. El protocolo describe la construcción de un plásmido para la visualización bacteriana del péptido objetivo, la generación de una biblioteca BirA, la selección y caracterización de variantes BirA.

Pantalla de péptido sinábicos para la selección de nuevas enzimas biotinylantantes

La creación de sistemas de dimerización de proteínas inducidos químicamente con la afinidad y especificidad deseadas para cualquier ligando de moléculas pequeñas dado tendría muchas aplicaciones de detección y accionamiento biológico. Aquí, describimos un método eficiente y generalizable para la ingeniería de novo de sistemas de dimerización inducidos químicamente a través de la selección escalonada de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio visualizada por fago.

Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio

Este estudio tenía como objetivo presentar una estrategia para identificar las interacciones entre fármacos y péptidos. La estrategia consiste en la biopanning de péptidos cortos que reconocen fármacos basados en un biosensor de micropeso de cristal de cuarzo (QCM), seguido de análisis bioinformática para evaluar cuantitativamente la información obtenida para el reconocimiento de fármacos y la anotación de los sitios de unión a fármacos sobre proteínas.

Estrategia de análisis bioaformático y bioinformática basada en biosensores para la validación global de interacciones entre fármacos y proteínas

Este artículo proporciona una metodología detallada para la medición de isolevuglandinas en tejidos por inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo ScFv D11 conjugado con fosfatasa alcalina. Los modelos de hipertensión tanto en ratones como en humanos se utilizan para explicar los procedimientos paso a paso y los principios fundamentales asociados con la medición de isolevuglandina en muestras de tejido.

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La ubiquitinación es una proteína crítica de modificación post-traduccional, cuya desregulación se ha implicado en numerosas enfermedades humanas. Este protocolo detalla cómo se puede utilizar la visualización de fagos para aislar nuevas variantes de ubiquitina que pueden unirse y modular la actividad de las ligasas E3 que controlan la especificidad, la eficiencia y los patrones de ubiquitinación.

Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3

Aprende el protocolo de fagos y selección de afinidad para identificar interacciones proteicas usando cebas inmovilizadas. Este método permite descubrir proteínas con alta afinidad de unión de manera eficiente.

Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

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