Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

El objetivo general de este procedimiento es descubrir las interacciones de las proteínas con las moléculas de cebo inmovilizadas. Esto se logra adquiriendo e inmovilizando primero el cebo. El segundo paso consiste en introducir en el cebo la biblioteca de fagos que se va a cribar en condiciones que favorezcan la unión.

A continuación, los fagos no unidos se eliminan mediante un lavado estricto. Mientras que los fagos unidos se utilizan para infectar las bacterias antes de ser recuperadas. El paso final es amplificar el fago unido para la siguiente iteración de la selección de afinidad.

En última instancia, cuando los títulos de los fagos se estabilizan, se seleccionan y secuencian placas individuales para mostrar qué proteínas tienen la mayor afinidad por el retraso inmovilizado en las condiciones de unión experimentales. Este proceso puede ayudar a responder preguntas clave en las interacciones proteína-proteína. Este procedimiento comienza con la colocación de proteína recombinante purificada en el fondo de las placas de microtitulación, como se describe en el protocolo de texto.

El siguiente paso es inocular 50 mililitros de medio Luria burani con 100 microgramos por mililitro de ampicilina en un matraz erlenmeyer de 250 mililitros con una sola colonia que haya sido previamente cultivada como se describe en el protocolo de texto, incubar a 37 grados centígrados, 200 RPM en un agitador horizontal y utilizar un espectrofotómetro para monitorear la densidad celular hasta obtener una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,5 a 0,6. A continuación, vierta las células en un tubo Falcon de 50 mililitros o similar y manténgalas a cuatro grados centígrados hasta su uso, las células suelen permanecer viables durante aproximadamente una semana el primer día. Prepárese para la selección de afinidad como se describe en el protocolo de texto en la mañana del segundo día.

Coloque nueve matraces erlenmeyer vacíos de 250 mililitros en las pinzas de un agitador de incubación, inocule 500 mililitros de lal burani con 500 microlitros de uno de los cultivos nocturnos de células BLT 5 4 0 3 infectadas con fagos iniciados la noche anterior después de colocar el matraz en la incubadora, encienda el espectrofotómetro y configúrelo para que lea la absorbancia a 600 nanómetros. Mientras tanto, retire la placa de microtitulación de cuatro grados centígrados y retire la película de plástico. Retire cualquier proteína no unida del plato lavando 10 veces con 200 microlitros por pocillo de una solución salina tamponada X tris o TBS pH 7.5 y golpeando el plato boca abajo sobre la toalla de papel entre lavados.

Bloquear con 200 microlitros por pocillo de reactivo de bloqueo al 5% en TBS durante una hora. Con el plato envuelto en una envoltura de plástico, lave la solución de bloqueo 10 veces con 200 microlitros de un X-T-B-S-T golpeando el plato boca abajo sobre cuatro capas de papel. Toalla entre lavados.

A partir de aquí, utilice las puntas de barrera del filtro para evitar la contaminación cruzada de fagos. Pipetear 100 microlitros de la biblioteca de fagos con las proteínas. Vuelva a sellar la placa con una envoltura de plástico e incube a temperatura ambiente durante una hora.

Al cabo de una hora, retire la envoltura de plástico del plato y lávela inmediatamente agitando el fago en los residuos biopeligrosos. A continuación, utilice una pipeta múltiple para añadir rápidamente 200 microlitros de un X-T-B-S-T a cada uno. Bueno, pon un temporizador para un minuto.

Después de un minuto, agite el tampón en el residuo de riesgo biológico, golpee el plato boca abajo sobre una toalla de papel y vuelva a colocarlo en el banco. Repita los pasos de lavado 10 veces después del 10º lavado. Tome 200 microlitros de celdas BLT 5 4 0 3 del tubo de halcón de 50 mililitros a cuatro grados centígrados y transfiéralos al fondo de cada uno de los nueve pocillos de los que se ha eliminado el último lavado.

Envuelva los platos en una envoltura de plástico y póngalo a 37 grados centígrados durante 20 minutos para que cualquier fago que aún esté adherido al cebo infecte las bacterias al final de los 20 minutos. Desenvuelve los platos. A continuación, retire 10 microlitros de bacterias de la BSA a 25 grados Celsius de replicación en un pocillo y transfiéralo a los 990 microlitros de medio marcados uno.

Repita este proceso dos veces más para ese pocillo, lo que da como resultado tres triplicados de uno a 100 diluidos del fago de ese pocillo, esta es la replicación de BSA una muestra tres veces. Estas diluciones se utilizarán para estimar el título promedio más o menos el error estándar de la media para esa replicación de BSA, hacer lo mismo para la replicación dos y tres de BSA para los tres pocillos replicados de la proteína de cebo envenenada y para la proteína de cebo dejar a un lado estos 27 tubos EOR. Si las bacterias del matraz tienen una densidad óptica de 0,6 a 1,0, decantar 50 mililitros de las células del matraz de helecho en cada uno de los 9 matraces Erlenmeyer de 250 mililitros.

Tome los 170 microlitros restantes de bacterias BLT 5 4 0 3 infectadas con fagos en el pocillo de replicación BSA y agréguelo a los 50 mililitros de células marcadas como BSA rep. Uno. Haga esto para los nueve pocillos antes de agitar los matraces en la incubadora a 37 grados centígrados. Mientras tanto, realice diluciones de las 27 diluciones iniciales tomando 100 microlitros del LB con bacterias del tubo de Einor uno y agregándolo a los 900 microlitros de LB en el tubo de Einor.

Cuatro para la dilución de 10 a menos tres, deseche la punta de la barrera del filtro por una nueva antes de obtener 100 microlitros de LB con bacterias del tubo einor cuatro y agregarlo a los 900 microlitros de LB en el tubo eph. Siete para la dilución de 10 a menos cuarto, continuar la dilución para todos los triplicados de todas las réplicas de todas las proteínas y tratamientos. Debe haber 135 tubos en total una vez que las células se hayan acostado.

Lleve el cultivo a cloruro de sodio de 0,5 molares añadiendo cinco mililitros de un caldo de cloruro de sodio de cinco molares y transfiriendo la muestra a una centrífuga de botella de centrífuga etiquetada a 8.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, decanta el sobrenadante que contiene el virus en un tubo de halcón limpio y estéril de 50 mililitros. Añadir unas gotas de cloroformo al sobrenadante decantado en el tubo Falcon.

El sobrenadante se puede almacenar a cuatro grados Celsius para la siguiente ronda de selección de afinidad en el tercer día, pipetear 250 microlitros de células VLT 5 4 0 3 de cuatro grados Celsius en cada uno de los tubos de ensayo de silicato bo numerados previamente preparados. A continuación, pipetee 100 microlitros de la dilución en el tubo de einor uno en los 250 microlitros de células en el tubo de ensayo de silicato de bur. Uno. Caliente brevemente las primeras cinco pulgadas de la pipeta sobre la llama y sumérjala en el aros superior fundido.

Tire tres mililitros y exátelos rápidamente en el tubo de ensayo sobre las células y el fago. Mezcle moviendo con un dedo mientras sostiene el tubo con la otra mano y luego vierta el contenido en el plato. Incline el plato y use el tubo de ensayo para perseguir burbujas y manchas secas hasta que todo el plato esté cubierto por los agros superiores.

Déjalo a un lado en posición vertical en el banco para que se enfríe. Deseche el tubo de silicato boros. Expulse la punta de la barrera del filtro y obtenga una nueva y continúe hasta que se haya plateado toda la dilución.

Recupere las placas preparadas de la incubadora a medida que se agoten, pero no más de seis a la vez o se enfríen y la parte superior se solidifica demasiado rápido, examine la placa formada en las placas y deseche las que tengan lisis confluente. Determine cuál de las diluciones seriadas restantes ha producido suficientes placas para permitir un registro preciso del número de placas de estas placas y proceda a calcular el título como se describe en el protocolo de texto al final de la selección de afinidad. En la cuarta ronda, seleccione 18 colonias individuales de placa bien definidas con una punta de pipeta amarilla estéril.

Humedecer el interior de la punta con clorhidrato de tris pH 8,5 en un tubo de einor. A continuación, extrae el núcleo de estas placas de las placas de tittering empujando la punta a través de una placa bien aislada directamente a la placa de Petri de plástico que se encuentra debajo y aspirando el núcleo, expulsa el núcleo en 100 microlitros de clorhidrato de tris pH 8,5 en el tubo adecuado antes de la formación en vórtice. Brevemente, caliente 20 microlitros de este volumen a 65 grados centígrados durante 10 minutos y proceda con la PCR y la secuenciación como se describe en el protocolo de texto que se muestra aquí son resultados de titulación típicos al muestrear varias veces los recuentos finales estimados no son tan susceptibles a errores de pipeteo y una estimación más precisa del título real y la variación en torno a esto.

Se estima que se obtienen pocillos aumentando el título de fagos preferentemente para el cebo no envenenado a medida que aumenta el número de rondas de selección de afinidad. También proporciona la confianza de que la técnica está funcionando. La retención de un porcentaje cada vez mayor de insertos que contienen fagos en pozos de cebo no envenenados a medida que aumenta el número de selecciones de afinidad también es auspiciosa después de rondas avanzadas de selección de afinidad.

Un aumento en el número de fagos recuperados independientemente que se han insertado en relación con la primera ronda y el asentamiento de estos amplicones en unas pocas bandas de tamaño idéntico es una buena indicación de que se están seleccionando clones particulares en la selección de afinidad después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la facilidad de dos híbridos, para validar las interacciones descubiertas por la visualización de fagos.