Un método rápido y eficiente para evaluar la patogenicidad de Ustilago maydis en las líneas de maíz y teosinte

El objetivo general de este procedimiento es inocular a través de la inyección con aguja, un cultivo de suspensión de células USTA Lago maus, y llevar a cabo un cribado de reacción de resistencia a la enfermedad de las líneas de tete de laberinto y teosinte de laberinto. Esto se logra seleccionando primero las líneas de plantas para la inoculación y el cribado. A continuación, se plantan las semillas para experimentos experimentales y de control de inoculación por inyección con aguja.

10 días después, la suspensión celular hecha en U se inyecta en el tallo de cada planta. Finalmente, se comparan las reacciones de resistencia de las plantas experimental y control. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran una inoculación exitosa por inyección con aguja a través de la visualización del fenotipo de la planta inoculada con usted. Mais.

La principal ventaja de esta técnica es que libera el patógeno directamente entre las hojas. Esto elimina el problema de la penetración de patógenos. Para comenzar a seleccionar líneas de plantas para la inoculación y el cribado como se muestra aquí, se utilizaron para este estudio dos líneas de laberinto, cinco líneas de teosinte y 40 líneas cruzadas de Teosinte laberinto con resistencia no caracterizada a U Mais para experimentos experimentales y de inoculación con inyección de aguja.

Plante cuatro semillas de cada línea de plantas en pequeños pisos empujando las semillas aproximadamente media pulgada en el suelo con un dedo y cubriéndolas ligeramente con tierra. Luego coloque las plantas en una cámara de crecimiento y riegue las semillas hasta que se empapen, asegurándose de que permanezcan bajo la tierra después de regar. Cultive las plantas con ambientes diurnos y nocturnos de 28 y 20 grados centígrados, y ciclos de luz y oscuridad de 14 y 10 horas respectivamente.

Y aproximadamente 500 micromolares por metro cuadrado por segundo de radiación fotosintéticamente activa en la parte superior del dosel. Mantenga la humedad relativa durante el día y la noche en aproximadamente 70% y 90% respectivamente, y mantenga todas las plantas en la misma cámara de crecimiento para mantener un entorno de crecimiento que sea congruente en todo el experimento. Ocho días después de plantar las semillas, use un asa estéril para rayar huis de un caldo de glicerol congelado en placas de agar papa dextrosa o PDA, incubar a 30 grados centígrados durante dos días y monitorearlo regularmente para asegurarse de que esté creciendo bien bajo una campana de flujo laminar.

Use un palillo de dientes estéril para seleccionar una sola colonia para cada cepa y colóquelas en tubos de tres mililitros de caldo de DP. Incubar los cultivos a 30 grados centígrados y 200 RPM durante dos días, comprobando periódicamente el crecimiento. A continuación, mida el DO 600 de los cultivos para asegurarse de que se cultivaron hasta un DO de 1,0.

Usando agua, lleve los cultivos a una concentración final de 1 millón de células por mililitro en un volumen final de 30 mililitros. Esta concentración de suspensión de células patógenas da como resultado una buena infección de las plantas. Luego, antes de la inoculación, mezcle volúmenes iguales de los dos que hizo como cepas.

Antes de llenar una jeringa de tres mililitros con la suspensión celular, llene la jeringa de control con agua para inyectar con un daño mínimo a la planta. El tejido une una aguja hipodérmica de punto cero de 457 milímetros por 1,3 centímetros al extremo de cada jeringa. Retire las plantas de la cámara de crecimiento e inyecte en un ángulo de 90 grados justo por encima de la línea del suelo.

Inserte con cuidado la aguja del U maus en el tallo de una planta experimental hasta que esté en el medio del tallo. Inyecte aproximadamente 100 microlitros de la suspensión celular. Empujará a través del tallo y será visible a medida que se mueve en el remolino de la planta.

Continúe inyectando plantas experimentales adicionales hasta que las jeringas se vacíen. A continuación, llénelo con agua para limpiar la aguja de cualquier tejido vegetal y vuelva a llenar la jeringa hasta que se inyecten todas las plantas. Utilice la jeringa de agua para inyectar las plantas de control de manera similar.

Cuando se completen las inyecciones. Vuelva a colocar las plantas en la cámara de crecimiento a diario. Riegue solo el suelo y verifique el desarrollo de patógenos y las reacciones de resistencia de las plantas.

Usando una calificación de reacción de resistencia de uno a cinco, escale, marque y registre las reacciones de resistencia para cada planta 7, 10, 14 y 21 días después de la inoculación o DPI. Los valores numéricos de la escala de valoración aumentan a medida que aumenta la gravedad de la enfermedad. Por ejemplo, la reacción de resistencia A1C una A o dos indica resistencia.

Una reacción de resistencia de tres, cuatro o cinco indica susceptibilidad. Compare las reacciones de resistencia de las plantas experimentales y de control, y seleccione plantas experimentales con una calificación de reacción de resistencia A1C de uno, a o dos. Estas plantas se consideran resistentes a los matis.

En este experimento, la mayoría de las plantas inoculadas con humus, fueron susceptibles a la infección. Las plantas mostraron un desarrollo severo de la enfermedad demostrado por la formación de tallo y agallas basales con esporas de telio negro. Varias plantas murieron después de la inoculación debido a la gravedad de la enfermedad.

En contraste, las plantas control estuvieron muy limpias y no mostraron desarrollo de patógenos en ninguna parte de la planta, lo que indica que el desarrollo de patógenos en las plantas experimentales se debió a la inoculación por inyección de aguja con U Mais, se identificaron tres líneas de agresión cruzada de Mais Teosinte que fueron resistentes a U Mais, y se verificó una inoculación exitosa por esclerosis menor. cian en producción, o formación menor de agallas en las hojas. Esta técnica se puede realizar de una manera altamente eficiente con reproducibilidad. Esto ayuda en la inoculación y fenotipado de una gran cantidad de plantas.