La identificación basada en microarrays de expresión individual HERV Loci: Aplicación al descubrimiento de biomarcadores en el cáncer de próstata

Este análisis transcriptómico de tejidos de cáncer de próstata humano identifica loci de expresión de retrovirus endógenos humanos individuales para evaluar un microarray de alta densidad personalizado como herramienta de cribado para el descubrimiento de biomarcadores. Después de que el cirujano ha extraído el órgano prostático del paciente, el patólogo prepara los tejidos tumorales y normales adyacentes por separado en el laboratorio, extrae, purifica y califica la RM. Los NA de los tejidos normales y tumorales amplifican los ARNm utilizando el kit de ovación del transcriptoma completo y, a continuación, escinden y etiquetan los productos amplificados resultantes. A continuación, procese secuencialmente el microarray H-E-R-V-V two mediante llenado, hibridación, lavado y escaneo.

En última instancia, utilizando métodos bioinformáticos, se pueden rastrear conjuntos de sondas, que exhiben una señal significativa y una expresión diferencial, lo que lleva a la identificación de loci individuales transcripcionalmente activos. Hace muchos años exploramos el comportamiento de la familia IRV W en varios contextos, incluyendo muestras de esclerosis múltiple. Placenta testicular.

La primera vez que tuve la idea de su método fue cuando empezamos a entender que se expresaban subgrupos superpuestos o no superpuestos de elementos IRV dentro de una familia. Dependiendo del contexto. El uso de la tecnología de barcos permite la exploración coordinada de varias familias y el análisis simultáneo de diferentes regiones para cada locus.

Por ejemplo, el dominio US tres y UF para LTR, que puede respaldar un papel directo en la patología. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer, como el diagnóstico del cáncer de próstata, donde los biomarcadores proteicos existentes, como el PSA, carecen de especificidad y sensibilidad. Mientras tanto, el ARN no codificante como el PCA tres parece más prometedor, demostrando el procedimiento de manejo de la próstata será vender a Michel un técnico del departamento de patología.

Philippe Per demostrará la preparación y el análisis de la diana de extracción de ARN, mientras que un técnico del laboratorio John Unit demostrará el procedimiento de la nave. Monte el hilera de tejido congelado verticalmente sobre un pequeño montículo de OCT en el criostato. Tome una sola sección de cinco micras, tíñla con Blu udine y luego realice un examen histológico rápido para examinar la naturaleza del tejido en busca de tejido tumoral.

Estime la cantidad de células turales y seleccione solo núcleos con más del 80% de células tumorales. Corta otra sección de cinco micras y tiñe con hematina, eoína y azafrán. Ahora corte 15 secciones de 30 micras de espesor y transfiérelas a un tubo de orph libre de ARN.

A continuación, se toma una última sección de cinco micras para teñirla con hematina, eoína y azafrán para controlar la cantidad de células tumorales. Al final del procedimiento, transfiera las muestras en hielo seco al laboratorio de biología molecular. Homogeneizar el tejido en la solución de Triol sobre hielo, utilizando un molinillo de mano hasta que el tejido se disuelva por completo.

Incubar las muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego agregue 300 microlitros de cloroformo y vórtice durante 15 segundos. Después de dos minutos a temperatura ambiente, centrifugar a 12.000 g durante 15 minutos a dos a ocho grados centígrados.

Para el ARN, transfiera con cuidado la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Añadir 750 microlitros de isopropanol, mezclar por inversión e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Centrifugar las muestras para granular el ARN precipitado, lavar el pellet de ARN con un mililitro de etanol al 80%.

A continuación, centrifugar las muestras a 7.500 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante con las puntas P 1000 y P 10. Deje que el etanol restante se seque al aire.

A continuación, añade 100 microlitros de agua libre de ARN. Transfiera las muestras a un bloque de calor de 70 grados centígrados. Para disolver el pellet, verifique la calidad del ARN y la integridad del ARN utilizando un bioanalizador y un NanoDrop de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En una extracción ideal de ARN, el número de integridad del ARN suele ser siete o mayor. Continúe con todo el kit de amplificación de transcriptoma y ARN siguiendo las instrucciones del proveedor. A continuación, purifique el producto CD NA monocatenario resultante.

Compruebe el rendimiento y la distribución del tamaño del ADNC monocatenario utilizando un bioanalizador y un NanoDrop de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La distribución de tamaño de CD NA amplificado debe estar típicamente entre 101, 500 bases de largo con un pico alrededor de 600 bases y tener una distribución general en forma de campana. A continuación, para fragmentar el CDNA, añadir 6,6 microlitros de mezcla de fragmentación a dos microgramos de CD NA en 30 microlitros, centrifugar e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos.

Luego inactive el ADN a 95 grados centígrados durante 10 minutos y manténgalo en hielo. Alícuota de un microlitro del CDNA fragmentado para la verificación de la distribución de tamaño basada en Agilent. El tratamiento con un solo ADN homogeneiza la distribución del tamaño de CD NA a alrededor de 100 nucleótidos antes de la hibridación.

Compruebe la distribución del tamaño de CD NA monocatenario utilizando un bioanalizador Pfizer prehumedecido. El chip genético HERV con 200 microlitros de prehibridación. Mezclar e incubar a 50 grados centígrados, 60 RPM durante 10 minutos.

Agregue 131 microlitros de mezcla de hibridación a los 69 microlitros de CD NA fragmentado y marcado a temperatura ambiente y en la naturaleza durante dos minutos a 95 grados Celsius. A continuación, incubar a 50 grados centígrados durante cinco minutos y centrifugar a máxima velocidad durante cinco minutos. Ahora vacíe el chip genético HERV prehumedecido y cargue la preparación de objetivos de 200 microlitros.

Aplique puntos difíciles en los dos hibridados SEPTA a 50 grados Celsius, 60 RPM durante 18 horas. Vacíe el chip genético HERV y llene la sonda. Sea una matriz con 250 microlitros de tampón de lavado, coloque 600 microlitros de mezcla de solución SAPE y 600 microlitros de mezcla de solución de anticuerpos en las posiciones número uno y número dos, coloque 800 microlitros de tampón de retención de matriz en la posición.

Número tres, empuje las agujas hacia abajo. Asigne el chip correcto a cada módulo. Seleccione el protocolo FS 4 5 0 0 0 4 y ejecute cada módulo según las instrucciones del software.

Aplique puntos difíciles sobre el SEPTA para evitar fugas. A continuación, cargue el chip en el cargador automático o, alternativamente, directamente en el escáner. Comience a escanear.

Después de escanear los archivos CEL de punto del chip, verifique la imagen y alinee la cuadrícula con el punto para identificar las celdas de la sonda. También someta los chips a varias medidas de control de calidad. Ahora normalice los chips y aplique un enfoque de agrupamiento jerárquico para explorar el conjunto de datos después de la normalización, se realizó un análisis significativo para buscar genes expresados diferencialmente a partir del procedimiento de microarrays y fue seguido por una corrección de la tasa de descubrimiento falso en muestras de ARN de próstata normal y tumor de cinco pares coincidentes.

Esto condujo a la identificación de 207 conjuntos de sondas HERV con valores de expresión diferencial. Un análisis adicional de 35 muestras adicionales de pares de coincidencias de otros tejidos cancerosos identificó 44 conjuntos de sondas HERV específicas de próstata. Estas son las 10 estructuras HERV más relevantes.

Finalmente, el análisis funcional se puede realizar en una interfaz dedicada que consta de secuencias anotadas de interés ilustradas por un elemento H-E-R-V-W elegido entre las 10 estructuras provirales identificadas principales etiquetadas en la parte superior con sus sondas específicas dedicadas presentes en la matriz H-E-R-V-V dos y marcadas con las regiones retrovirales funcionales LTR gag POLE N, y con un enfoque en los cinco subdominios principales LTRU tres y U cinco, y el posterior diseño de cebadores de PCR para la validación de RT PCR. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo dominar los pasos críticos involucrados en la preparación de muestras y objetivos, que son requisitos previos de calidad para tener éxito en el uso de microrrayos para la tierra, así como en el descubrimiento de biomarcadores convencionales. Hemos diseñado un microarray de alta densidad en formato ametri, con el objetivo de caracterizar de forma óptima la expresión individual de loci con el fin de comprender mejor si pueden ser activos si la transcripción de NA de área seca no con o modular la expresión génica codificante.

Esta técnica abre el camino a los investigadores en el campo de las enfermedades crónicas e infecciosas, ya que la identificación sistemática de los vocales activos puede unificar hipótesis genéticas, virales y ambientales como factores desencadenantes en diversas patologías. Trabajar con un número limitado de muestras en un experimento técnico de prueba de concepto puede ser complicado para descubrir con éxito biomarcadores tomar precauciones, como respetar un flujo de trabajo estadísticamente validado, incluida la solidez del método, y una muestra representativa de la población de pacientes objetivo.