La cuantificación de la expresión de la proteína y Co-localización Uso de multiplexado inmunohistoquímica y tinción de imágenes multiespectrales

El objetivo general de este método es cuantificar objetivamente la expresión y la colocalización de proteínas mediante imágenes multiespectrales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación básica y la patología diagnóstica, como la forma en que las proteínas cambian la expresión y la localización después del tratamiento, o en la progresión de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que elimina la subjetividad del operador inherente a los métodos tradicionales de cuantificación.

Para comenzar el proceso de cuantificación, abra el software de imágenes multiespectrales para crear una biblioteca espectral a partir de portaobjetos de control previamente preparados teñidos con cromógenos individuales y el portaobjetos teñido con hematoxilina. A continuación, abra un cubo de imagen adquirido de una diapositiva de control y seleccione cuatro o cinco áreas teñidas positivamente para definir ópticamente el cromógeno. Repita los pasos con cubos de imagen de otras diapositivas de control hasta que se cree una biblioteca espectral completa que represente todos los cromógenos y, a continuación, guarde la biblioteca espectral.

Comience un nuevo proyecto dentro del software de imágenes multiespectrales seleccionando Multiespectral o im3 para la opción de formato de imagen y Campo claro para el formato de muestra. Configure el proyecto eligiendo el tejido del segmento, la búsqueda de características, el fenotipado, la puntuación y la exportación. Cambie la resolución de la imagen para acelerar el tiempo de análisis, si lo desea.

Importe la biblioteca espectral creada anteriormente y seleccione todos los cromógenos que se incluirán en el análisis. Abra los cubos de imagen que se incluirán en el conjunto de datos de entrenamiento seleccionando la opción Abrir cubo de imagen. Seleccione al menos el 18% del número total de imágenes que se van a analizar para garantizar la precisión del entrenamiento.

A continuación, elija el conjunto de imágenes de entrenamiento. Imágenes que representan todos los estados de la enfermedad, para aumentar la precisión de la segmentación. Incluya abundantes imágenes de tinción negativas en el conjunto de entrenamiento para evitar sesgos durante este paso.

Equilibre los blancos de las imágenes del conjunto de entrenamiento seleccionando la herramienta Cuentagotas y eligiendo un área de una imagen que sea blanca. Seleccione el botón de avance para mover la segmentación del tejido. A continuación, utilice el panel de categorías de tejidos para elegir los tipos de tejidos que se van a analizar para una localización más precisa de los tejidos proteicos, se pueden utilizar categorías de tejidos seleccionados.

Comience a crear el algoritmo y a definir las categorías de tejido utilizando la herramienta Pluma y dibujando alrededor de grupos de celdas dentro de las imágenes de entrenamiento. Cuando termine con una categoría de tejido, repita el paso para otras categorías de tejidos. Asegúrese de elegir grupos de células dentro de las imágenes que sean característicos del tipo de categoría de tejido.

Seleccione los componentes que se incluirán en el entrenamiento para el segmentador de tejidos. Elija una escala de patrón adecuada para entrenar el segmentador de tejido. A continuación, seleccione el botón del segmentador de tejido entrenado.

Observe un cuadro emergente que muestra la precisión de la proporción de píxeles dentro de las regiones de entrenamiento clasificadas correctamente. Segmente todo el conjunto de imágenes de entrenamiento haciendo clic en segmentar imágenes. Cuando termine, revise el conjunto de entrenamiento para encontrar cualquier tejido clasificado incorrectamente con un algoritmo de entrenamiento actual.

Cuando esté seguro de los resultados del algoritmo de segmentación de tejidos, seleccione el botón de avance. Asegúrese de que los núcleos ya están seleccionados para elegir el citoplasma y/o la membrana. Seleccione la pestaña de núcleos y elija la configuración adecuada para la segmentación nuclear.

A continuación, elija si se incluirán en la segmentación las categorías individuales o todas las categorías de tejidos. Seleccione el enfoque de umbral basado en objetos de contratinción para obtener un método simplificado para obtener buenos resultados. A continuación, seleccione el enfoque de umbral basado en objetos en una contratinción nuclear confiable.

Seleccione los parámetros de forma de citoplasma eligiendo la pestaña citoplasma. A continuación, seleccione la distancia exterior al núcleo. A continuación, seleccione el tamaño mínimo.

Seleccione el siguiente componente de opción con las opciones primario, secundario y terciario como secundario. Muévase a la pestaña de membrana. Elija primero para el marcador específico de membrana utilizado.

Ajuste la densidad óptica a escala completa o OD para encontrar un umbral mínimo o un positivo para cada marcador en las membranas celulares. Continuando en la pestaña de membrana, seleccione el tamaño máximo de celda. Después de seleccionar todas las opciones, seleccione segmentar todo.

Aplique la configuración a las imágenes y obsérvelas. Elija avance para pasar al paso de puntuación IHQ y elija una categoría de tejido para puntuar. Elija el tipo de puntuación deseado y elija el compartimento de celda que se utilizará en el análisis de puntuación.

A continuación, seleccione ver datos de componentes y mueva el cursor sobre las imágenes de entrenamiento para encontrar el umbral mínimo de tinción de densidad óptica adecuado para las celdas positivas para los componentes de interés. Exporte los datos del conjunto de entrenamiento para probar el algoritmo creado a través de la segmentación de tejidos, la segmentación de celdas y los valores de puntuación, siga las indicaciones para crear una nueva carpeta para el directorio de exportación. Seleccione las imágenes y tablas que se crearán e incluirán en el análisis.

A continuación, realice el análisis seleccionando exportar para todos. Una vez finalizado el análisis, vea los datos de segmentación y puntuación de celdas para imágenes con tinción alta y baja para evaluar la precisión de la configuración. Una vez que esté satisfecho con la configuración, haga clic en la pestaña de análisis por lotes para copiar el algoritmo en el proyecto activo.

A continuación, elija un nuevo directorio de exportación y seleccione las imágenes y tablas que desea incluir en el análisis. En la opción Archivos de entrada, elija todas las imágenes que se incluirán en el análisis por lotes. Seleccione la opción de ejecución para realizar el análisis.

Una vez completado, avance a la pestaña de combinación de revisiones. Seleccione Incluir todo y seleccione Combinar para crear hojas de datos con datos de resumen para el análisis. Se realizó entrenamiento en los tejidos prostáticos para segmentar las imágenes en porciones epiteliales y estromales.

Junto con un compartimento que no es de tejidos. Se importó un conjunto de imágenes de entrenamiento en un software de imágenes multiespectrales que representaban los tipos de tejido y los estados de enfermedad de todo el conjunto de imágenes. Se crearon categorías de tejidos, incluidos estroma, epitelios y no tejidos, y las categorías se definieron dibujando manualmente sobre imágenes de entrenamiento.

Se creó un algoritmo para la segmentación de tejidos y se aplicó al conjunto de imágenes de entrenamiento. Segmentación precisa de los tejidos. Utilizando la técnica de inmunohistoquímica múltiple, se identificaron células positivas para la expresión nuclear de ER-alfa observadas como rojas y AR vistas como marrones a pesar de la superposición de señales de color y métricas. La expresión específica de la membrana celular de CD-147 se cuantificó mediante el uso de E-catherine vista como negro como proteína marcadora.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la expresión de proteínas y la colocalización, informar y corregir los tejidos incluidos en parafina.