La cuantificación de la expresión de la proteína y Co-localización Uso de multiplexado inmunohistoquímica y tinción de imágenes multiespectrales

El objetivo general de este método es cuantificar objetivamente la expresión proteica y la co-localización mediante imágenes multiespectrales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación básica y en el campo de la patología diagnóstica, como cómo cambian la expresión y la localización de las proteínas tras un tratamiento o durante la progresión de una enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que elimina la subjetividad del operador inherente a los métodos tradicionales de cuantificación.

Para comenzar el proceso de cuantificación, abra el software de imágenes multiespectrales para crear una biblioteca espectral a partir de portaobjetos control previamente preparados teñidos con cromógenos individuales y el portaobjeto teñido con hematoxilina. A continuación, abra un cubo de imagen adquirido a partir de un portaobjeto control y seleccione de cuatro a cinco áreas teñidas positivamente para definir ópticamente el cromógeno. Repita los pasos con cubos de imagen de otros portaobjetos control hasta crear una biblioteca espectral completa que represente todos los cromógenos, y luego guarde la biblioteca espectral.

Inicie un nuevo proyecto dentro del software de imagen multispectral seleccionando Multispectral o im3 como opción de formato de imagen y Campo claro para el formato de muestra. Configure el proyecto eligiendo segmentar tejido, encontrar características, fenotipado, puntuación y exportación. Cambie la resolución de la imagen para acelerar el tiempo de análisis, si se desea.

Importe la biblioteca espectral creada previamente y seleccione todos los cromógenos que se incluirán en el análisis. Abra los cubos de imagen que se incluirán en el conjunto de datos de entrenamiento seleccionando la opción Abrir cubo de imagen. Seleccione al menos el 18 % del número total de imágenes que se analizarán para garantizar la precisión del entrenamiento.

A continuación, elija el conjunto de entrenamiento de imágenes. Imágenes que representen todos los estados de la enfermedad, para aumentar la precisión de la segmentación. Incluya abundantes imágenes con tinción negativa en el conjunto de entrenamiento para evitar sesgos durante esta etapa.

Iguale el balance de blancos de las imágenes en el conjunto de entrenamiento seleccionando la herramienta cuentagotas y eligiendo un área en una imagen que sea blanca. Seleccione el botón de avanzar para pasar a la segmentación del tejido. Luego, utilice el panel de categorías de tejido para elegir los tipos de tejido que se analizarán; para una localización proteica más precisa en el tejido, se pueden usar categorías de tejido específicas.

Comience a crear el algoritmo y defina categorías de tejidos utilizando la herramienta de lápiz y dibujando alrededor de grupos de células dentro de las imágenes de entrenamiento. Cuando termine con una categoría de tejido, repita el paso para otras categorías de tejidos. Asegúrese de elegir grupos de células dentro de las imágenes que sean característicos del tipo de categoría de tejido.

Seleccione los componentes que se incluirán en el entrenamiento del segmentador de tejidos. Elija una escala de patrón adecuada para entrenar el segmentador de tejidos. Luego, seleccione el botón del segmentador de tejidos entrenado.

Observe un cuadro emergente que muestra la precisión de la proporción de píxeles dentro de las regiones de entrenamiento clasificadas correctamente. Segmenta todo el conjunto de entrenamiento de imágenes haciendo clic en segmentar imágenes. Una vez finalizado, revise el conjunto de entrenamiento para identificar cualquier tejido mal clasificado con el algoritmo de entrenamiento actual.

Cuando esté seguro de los resultados del algoritmo de segmentación del tejido, seleccione el botón de avanzar. Asegúrese de que ya esté seleccionado el núcleo para elegir el citoplasma y/o la membrana. Seleccione la pestaña de núcleos y elija la configuración adecuada para la segmentación nuclear.

Luego, elija si se incluirán categorías individuales o todas las categorías de tejido en la segmentación. Seleccione el umbral basado en objetos de contraste para un método simplificado que permita obtener buenos resultados. A continuación, seleccione el enfoque de umbral basado en objetos en una tinción nuclear de contraste confiable.

Seleccione los parámetros con forma citoplasmática eligiendo la pestaña de citoplasma. A continuación, seleccione la distancia externa al núcleo. Luego seleccione el tamaño mínimo.

Seleccione el siguiente componente de opción con primaria, secundaria y seleccione terciaria como opciones secundarias. Pase a la pestaña de membrana. Elija primero el marcador específico de membrana utilizado.

Ajuste la densidad óptica a escala completa u OD para encontrar un umbral mínimo o un positivo para cada marcador en las membranas celulares. Continúe bajo la pestaña de membrana y seleccione el tamaño máximo de célula. Después de seleccionar todas las opciones, seleccione segmentar todo.

Aplique los ajustes a las imágenes y obsérvelas. Elija avanzar para pasar al paso de puntuación de IHC y seleccione una categoría de tejido para puntuar. Elija un tipo de puntuación deseado y seleccione el compartimento celular que se utilizará en el análisis de puntuación.

A continuación, seleccione ver los datos del componente y mueva el cursor sobre las imágenes de entrenamiento para encontrar el umbral mínimo de densidad óptica adecuado de la tinción para las células positivas, correspondientes a los componentes de interés. Exporte los datos del conjunto de entrenamiento para probar el algoritmo creado mediante la segmentación de tejido, la segmentación celular y los valores de puntuación; siga las indicaciones para crear una nueva carpeta para el directorio de exportación. Seleccione las imágenes y tablas que se generarán y que se incluirán en el análisis.

A continuación, realice el análisis seleccionando exportar para todo. Cuando finalice el análisis, revise los datos de segmentación celular y puntuación para imágenes con tinción alta y baja a fin de evaluar la precisión de los ajustes. Una vez satisfecho con los ajustes, haga clic en la pestaña de análisis por lotes para copiar el algoritmo al proyecto activo.

Luego, elija un nuevo directorio de exportación y seleccione las imágenes y tablas que se incluirán en el análisis. En la opción de archivos de entrada, elija todas las imágenes que se incluirán en el análisis por lotes. Seleccione la opción ejecutar para realizar el análisis.

Una vez finalizado, avance a la pestaña de revisión de combinación. Seleccione incluir todo y luego seleccione combinar para crear hojas de datos con datos resumidos para el análisis. El entrenamiento se realizó en tejidos prostáticos para segmentar las imágenes en porciones epiteliales y estromales.

Junto con un compartimento no tisular. Se importó un conjunto de imágenes de entrenamiento al software de imagen multiespectral que representaba los tipos de tejido y estados patológicos del conjunto completo de imágenes. Se crearon categorías de tejido, incluyendo estroma, epitelios y no tejido, y las categorías se definieron dibujando manualmente sobre las imágenes de entrenamiento.

Se creó y aplicó un algoritmo para la segmentación de tejidos al conjunto de entrenamiento de imágenes. Segmentación precisa de los tejidos. Mediante la técnica de inmunohistoquímica múltiple, se identificaron células positivas para la expresión nuclear de ER-alfa, visibles como rojas, y AR, visibles como marrones, a pesar de las señales superpuestas de color y métricas. La expresión específica de la membrana celular de CD-147 se cuantificó utilizando la E-cadherina, visible como negra, como proteína marcadora.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la expresión proteica y la co-localización, así como informar y fijar tejidos incluidos en parafina.