Descelularización y recelularización pulmonar de primates no humanos mediante un biorreactor especializado de órganos grandes

El objetivo general de este procedimiento es aislar matrices biológicas de órganos completos de los pulmones de Reus Maccas y utilizar estas matrices como andamios para investigar aplicaciones de ingeniería de tejidos pulmonares. Esto se logra descelularizando primero los pulmones enteros de Reuss Maca con detergentes, sales y enzimas. El segundo paso es instalar los andamios pulmonares descelularizados en un biorreactor capaz de ventilar la vía aérea y perfundir la vasculatura pulmonar con medios de cultivo celular líquidos.

A continuación, los andamios pulmonares se asientan con las células madre a través de las vías respiratorias y las células endoteliales a través de la vasculatura pulmonar. El paso final es cultivar las células dentro del andamio pulmonar en las condiciones de ventilación y perfusión proporcionadas por el biorreactor durante el tiempo deseado, seguido del análisis de la morfología celular y tisular resultante. En última instancia, la reización de andamios pulmonares acelulares de Maca con células madre y células endoteliales da como resultado un tejido diseñado que imita las características anatómicas e histológicas de los tejidos pulmonares nativos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la ingeniería del tejido pulmonar, como si las células madre o progenitoras se pueden usar para regenerar el tejido pulmonar, ya sea solas o en conjunto con células epiteliales y endoteliales pulmonares maduras. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de las enfermedades pulmonares en etapa terminal, ya que la ización de matrices pulmonares acelulares con células madre o progenitoras derivadas del paciente tiene el potencial de aumentar el número de pulmones de donantes disponibles para el trasplante de pulmón. Además, los pulmones resultantes, modificados con células madre del propio paciente, pueden ser resistentes al rechazo inmunitario.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando vimos un video de Joe publicado anteriormente por miembros del laboratorio de la Dra. Laura Nicholson en la Universidad de Yale. Aquí presentamos modificaciones de su procedimiento para roedores para adaptarse a las necesidades de nuestro modelo de animales grandes Resus Meac. Se debe tener sumo cuidado para evitar incidentes de exposición infecciosa cuando se trabaja con tejidos de maca.

Antes de manipular tejidos de primates no humanos, colóquese el equipo de protección personal, como una mascarilla quirúrgica, un protector facial, una capa de guantes quirúrgicos, una bata desechable y una segunda capa de guantes quirúrgicos con los pulmones acostados en una bandeja de disección, canule la arteria pulmonar con un conector de señuelo femenino con una púa del tamaño adecuado. Asegure la cánula en su lugar con una brida esterilizada con alcohol. Desliza una brida de plástico alrededor de la tráquea.

Inserte un conector de señuelo hembra en la abertura traqueal y apriete la brida alrededor de la lengüeta del conector para mantener la tráquea en su lugar alrededor de la lengüeta. Elimine el aire atrapado de los pulmones instilando solución salina tamponada con fosfato o PBS que contenga 30 unidades por mililitro de heparina y cinco microgramos por mililitro de nitropress de sodio. Los SNP abreviados permiten que la solución sea expulsada por retroceso natural antes de repetir.

Instalación dos veces más después de la tercera instalación de la vía aérea con la solución PBS Heparin SNP. Tape la cánula de señuelo traqueal con un tapón de señuelo. Cortar el ápice del corazón e irrigar los ventrículos internos con PBS Heparina SNP para eliminar la sangre residual, lacerar ambas aurículas para facilitar el drenaje de los circuitos pulmonares tras la perfusión.

Conecte una jeringa de 60 cc llena de la solución de PBS Heparin SNP a la cánula de la arteria pulmonar y retire con cuidado el émbolo para permitir que el líquido fluya hacia la vasculatura. Retire el tapón de la cánula traqueal y permita que el líquido de las vías respiratorias sea expulsado por retroceso natural. Continúe la perfusión hasta que se extraiga la mayor cantidad de sangre posible de la vasculatura pulmonar.

El aspecto más difícil del procedimiento es enjuagar y lavar eficazmente las vías respiratorias pulmonares Con líquidos, el flujo de líquido se inhibe en relación con los gases, ya que las vías respiratorias no están diseñadas para conducir líquidos, el tiempo y los pacientes son necesarios para realizar estos pasos, aconsejamos continuar con el protocolo, a pesar de que el líquido residual permanece en las vías respiratorias a medida que avanza la descelularización y se eliminan los desechos celulares, la viscosidad del líquido se mantendrá baja y los pulmones podrán expulsar líquidos de manera eficiente el primer día. Sumerja el bloque cardíaco-pulmonar en agua desionizada, infle y perfunda el pulmón con agua desionizada utilizando jeringas de 60 cc conectadas a la cánula traqueal y arterial sumergidas respectivamente. Repetir eficazmente los lavados de las vías respiratorias y vasculares con agua desionizada.

Cuatro veces más, para un total de cinco enjuagues de aproximadamente 0,5 a un litro cada uno después de cinco lavados, retire los pulmones del agua y sumerja el bloque en la solución de Triton. Infle y perfunda los pulmones con la solución Triton. Como antes, repita la instalación por segunda vez e incube los órganos sumergidos en la solución Triton durante la noche a cuatro grados centígrados.

Después de una incubación durante la noche, retire el bloqueo pulmonar de la solución de Triton y lave externamente con agua desionizada. A continuación, sumergió el bloque en agua desionizada dulce. Instilar el agua desionizada en la tráquea y la arteria pulmonar cinco veces para lavar la solución de Tritón y los restos celulares.

Retire los pulmones del agua desionizada y sumérjalos en una solución de desoxiato de sodio al 2% o SDC. Infle y perfunde con la solución SDC de la misma manera. Sumerja los pulmones en una solución SDC durante la noche a cuatro grados centígrados el tercer día.

Lavar el tejido nuevamente con agua desionizada externamente y a través de la vía aérea y la vasculatura cinco veces. Como antes, retire el tejido del agua desionizada y sumérjalo en la solución de cloruro de sodio de un molar. Infle y perfunda con la solución de cloruro de sodio como antes, y sumerja el tejido en una solución de cloruro de sodio durante una hora a temperatura ambiente después de lavar los pulmones de la solución de cloruro de sodio con cinco enjuagues de agua desionizada.

Al igual que antes, báñelos en una solución fresca de ADN e instile esta solución en las vías respiratorias y la vasculatura. Incubar los pulmones en una solución de ADN durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, retire los pulmones de la solución de ADN y lávelos externamente con una solución de PBS.

Sumerja los pulmones en una solución de PBS y lave esta solución cinco veces a través de las vías respiratorias y la vasculatura. Al igual que antes, almacene los pulmones en una solución de PBS en un recipiente sellado durante la noche a cuatro grados centígrados al cuarto día. Lave los pulmones en una solución fresca y helada de PBS cinco veces a través de las vías respiratorias y la vasculatura.

Luego guárdelos en una solución de PBS en un recipiente estéril sellado a cuatro grados centígrados hasta su uso. Ensamble los componentes del biorreactor bajo una campana de flujo laminar de acuerdo con el esquema. En el protocolo de texto, llene la cámara principal con medio de cultivo que se haya equilibrado a la atmósfera de 5% de CO2 de una incubadora de cultivo celular inmediatamente antes de su uso en el biorreactor, aplique los adaptadores de cánula traqueal y vascular a la cánula pulmonar.

Instale los órganos en la cámara principal del biorreactor bañando los pulmones en el medio de cultivo y conectando los adaptadores de cánula a los puertos apropiados en la tapa modificada. Una vez conectado, fije la tapa de forma segura y hermética. La cámara no se volverá a abrir durante el tiempo que dure la reación. Aspire el aire del tubo utilizando los puertos de la jeringa y una jeringa de 60 CCC equipada con una aguja de calibre 18 que mueve la direccionalidad de las llaves de parada de tres vías para dirigir el flujo de líquido hacia la jeringa.

Mueva las cámaras de biorreactor selladas conectadas contiguamente con órganos instalados a una incubadora de cultivo de tejidos para equilibrar la temperatura y el gas. Ventile los pulmones con una bomba de jeringa conectada a la cámara principal aproximadamente una respiración completa cada dos minutos, y perfunde la vasculatura a través de la bomba peristáltica a aproximadamente 10 mililitros por minuto durante un total de 30 minutos para sentarse en las vías respiratorias. Infle los pulmones con la suspensión celular inyectando suavemente a través del puerto de la jeringa conectado a la llave de parada de tres vías en el circuito de respiración.

Mantenga los pulmones estáticamente a 37 grados Celsius, 5% de CO2 durante la noche sin vías respiratorias ni perfusión vascular para permitir que las células se adhieran a la matriz pulmonar descelularizada. Después de la incubación durante la noche, reinicie el programa estándar de ventilación de las vías respiratorias y el cultivo, los órganos durante tres a siete días para el asiento vascular. La direccionalidad de la trayectoria del flujo se puede cambiar de la cámara principal a un depósito de asiento endotelial girando la válvula en la llave de paso colocada en la tubería que conecta estos dos compartimentos, sembrando las células endoteliales gradualmente usando la bomba peristáltica mientras se agita suavemente usando la agitación magnética cuando se completa la siembra.

Pisotea la perfusión e incuba estáticamente durante aproximadamente cuatro a seis horas. Reiniciar la perfusión vascular con el medio de la cámara principal a una velocidad aproximada de 10 mililitros por minuto. Cultivo de tres a siete días con perfusión vascular continua concomitantemente con el período de cultivo de ventilación de la vía aérea.

A lo largo del proceso de descelularización, los pulmones MCCA mostraron un blanqueamiento progresivo que culminó con una apariencia translúcida al final del proceso. Sin embargo, los pulmones mantuvieron sus características anatómicas macroscópicas y permanecieron en gran medida elásticos y capaces de producir un retroceso natural después del inflado con líquido. A nivel microscópico.

La ultraestructura histológica permaneció intacta después de la descelularización. Es decir, bronquios, respiratorios, bronquiales, sacos alveolares. Los vasos sanguíneos y los capilares todavía se distinguían con bastante claridad por microscopía de baja potencia.

Sin embargo, la microanatomía histológica demostró que, mientras que la anatomía macroscópica y la ultraestructura del pulmón se vieron ligeramente alteradas por la descelularización, el tejido carecía por completo de células intactas, como se ve aquí. Solo quedaban trazas de ADN en los tejidos descelularizados. Además, el ADN traza, que se concentró por precipitación de alcohol y se visualizó en un gel de AROS al 0,8%, estaba compuesto en su mayoría por fragmentos degradados de bajo peso molecular.

La eficiencia de la eliminación de proteínas celulares se evaluó mediante análisis de Western blot de proteínas pulmonares nativas y descelularizadas. Lisados que utilizan un anticuerpo contra la beta actina, la beta actina se detectó fácilmente en los lisados pulmonares nativos, pero no en los lisados pulmonares descelularizados, lo que sugiere que la descelularización agotó drásticamente las células y eliminó el material proteico asociado a las células 14 días después de la siembra de las vías respiratorias con células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea maca o BMC y el cultivo en biorreactor con aproximadamente un ciclo de espiración de inspiración cada dos minutos. El parénquima de los pulmones de Maca descelularizada fue efectivamente utilizado.

Las BMC recubrían los tabiques alveolares mientras mantenían una luz alveolar clara y abierta. La matriz denudada de las vías respiratorias grandes también fue utilizada por las BMC utilizando el biorreactor, la superficie luminal de un bronquio del tallo principal se recubrió con una monocapa de BMC escamosas similares a las BMC después de 14 días de cultivo. En el biorreactor que se muestra aquí hay un lóbulo pulmonar de Reus descelularizado cinco días después de sembrar la vasculatura con células endoteliales microvasculares y proporcionar una perfusión vascular constante con medio de cultivo endotelial a cinco mililitros por minuto.

El análisis histológico reveló células que recubren la pequeña vasculatura en el parénquima pulmonar. En algunos casos, las células parecían estar unidas a la matriz a través de varias proyecciones celulares a través de la luz, mientras que otras secciones transversales de vasos mostraban células que recubrían la superficie endotelial con luz clara. Siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como la inmunohistoquímica, el Western blot y la PCR cuantitativa en tiempo real para responder a preguntas adicionales como si las células madre sembradas se diferencian en células de linaje pulmonar una vez cultivadas en la matriz pulmonar acelular o con células epiteliales y endoteliales maduras dentro del biorreactor. Después de ver este video, deberíamos tener una buena comprensión de cómo descelularizar pulmones de primates no humanos y, posteriormente, usar los pulmones acelulares resultantes como andamios para cultivar células madre, células epiteliales y células endoteliales en un sistema de biorreactores. No olvide que trabajar con tejidos de primates no humanos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección personal completo, incluido un protector facial y una doble capa de guantes de látex o nitrilo mientras se realiza este procedimiento.