Name: Procedimiento para la Ingeniería de pulmón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Aprende a generar tejido pulmonar funcional mediante descelularización de matriz extracelular y bioreactor biomimético en ratas. Este método permite mantener fenotipos diferenciados y lograr intercambio gaseoso in vivo.

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Damos las gracias a Maegan B. Colehour para ayudar con el desarrollo bio-reactor. Estos estudios fueron financiados por la Universidad de Yale Departamento de Anestesia y por el NIH subvención HL 098 220 (a LEN). THP fue apoyado por el NIH T32 GM007171.

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</ol>

LEN tiene acciones en Humacyte, una compañía de medicina regenerativa. Humacyte no financiar estos estudios, y no afectan al diseño, la interpretación, o la notificación de cualquiera de los experimentos o métodos descritos. Los autores (LEN, THP, EAC) y la Universidad de Yale ha presentado una solicitud de patente relacionada con la ingeniería de tejidos de los pulmones.

Los aspectos más críticos del sistema que aquí se presenta incluye el mantenimiento de la esterilidad, y la estrecha vigilancia de las presiones ejercidas sobre el lecho vascular en todo el proceso de preparación y siembra el andamio y el cultivo de la repoblación de pulmón. La esterilidad se mantiene mejor en autoclave todos los materiales antes de su uso, y mediante el montaje de los pulmones en un sistema cerrado poco después de explante y evitar el posterior incumplimiento de esta barrera. Después de la matriz descelularizada ha sido totalmente aclarado y se transfiere a un biorreactor estéril para la cultura, el tapón de silicona y otros sellos y las conexiones no debe ser alterado o eliminado. Para mantener la presión bajo control, el flujo por gravedad, es preferible siempre que sea posible. Cuando una bomba es necesaria para la recirculación del fluido, que comienzan después del lavado con PBS y continua durante el cultivo, se recomienda medir directamente la presión justo antes de que el líquido entra en la arteria pulmonar con un transductor de presión. La magnitud de la presión aplicada no debe exceder los 15 mm Hg. Recellularized pulmones pueden ser cultivados durante períodos variables de tiempo, por lo general van de 4 días a un máximo de 3 semanas. Perfusión vascular se realiza generalmente en 1-3 ml / min durante el cultivo del endotelio, mientras que la ventilación se aplica típicamente a una velocidad de 1 respiración / min durante el cultivo epiteliales. Durante los periodos de la cultura combinados, la ventilación y la perfusión simultánea es la adecuada. La ventilación se puede realizar con cualquier medio líquido o aire. En el transcurso de las últimas décadas, varios grupos han realizado una importante labor de ingeniería de tejidos que muestran la viabilidad de la diferenciación del epitelio pulmonar in vitro y de reproducir varios aspectos de pulmón microanatomía 7,8,9, 10. Sin embargo, hasta hace poco, ninguno de estos intentos de 4,5 para diseñar el tejido pulmonar se había traducido en un órgano implantable que fue capaz de mantener la separación entre la sangre y los compartimentos de las vías respiratorias y que pueden participar en el intercambio de gases. Por lo tanto, aunque los métodos descritos son sólo un primer paso hacia el objetivo a largo plazo de la generación de tejido pulmonar funcional, este trabajo es un paso alentador hacia la posibilidad de aumentar la cantidad de tejido pulmonar disponible para el trasplante. Por otra parte, este trabajo elabora el trabajo realizado por Ott et al. Uygun y sus colegas y 11,12, lo que demuestra la eficacia de una matriz extracelular descelularizada como un andamio para la ingeniería de tejidos tridimensionales complejas estructuras y apoyar el crecimiento y la supervivencia de varios tipos de células . Este trabajo también es importante por su contribución al arsenal terapéutico de las células respiratorias y biólogos moleculares. Al ofrecer un único entorno tridimensional que también puede proporcionar adecuados estímulos mecánicos, y que no comparte el riesgo concomitante de una rápida des-diferenciación que se puede encontrar al epitelio de cultivo de los roedores en el laboratorio con los métodos más tradicionales 13, los científicos podrían usar nuestro sistema para obtener nuevos conocimientos sobre las interacciones célula-célula y célula-matriz que juegan un papel en la diferenciación y función celular. Este conocimiento puede ser muy poderosa si se usa como palanca para guiar el destino de varias poblaciones de células madre, como grupo Cortiella ha demostrado en los estudios iniciales 14.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Eutanasia </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> Nitroprusiato de sodio </td><td> Fluka </td><td> 71778 </td><td></td></tr><tr><td> Euthasol solución de la eutanasia </td><td> Virbac AH </td><td> 710101 </td><td> 390 mg / ml de solución de pentobarbital de sodio de valores debe ser diluido apropiadamente para la administración de IP </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell Solución </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Estadounidense Bioanalytical </td><td> AB01915 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Componentes biorreactor </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 480 ml frasco </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-3460560 </td><td></td></tr><tr><td> Tapón de silicona, talla 14 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.298-26 </td><td></td></tr><tr><td> Y-conectores </td><td> Cole Parmer </td><td> ED-30.614-08 </td><td> Se utiliza para cánulas arteriales y traqueal </td></tr><tr><td> Tubo de silicona </td><td> Masterflex </td><td> 96420-14, 16 </td><td> L / S 14, 16 </td></tr><tr><td> Transductores de presión </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX-212 </td><td></td></tr><tr><td> La válvula de retención </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-98.553-20 </td><td> Válvula de una vía </td></tr><tr><td> Llaves de paso de 4 vías </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 594WSC </td><td></td></tr><tr><td> Filtro de jeringa </td><td> Cole Parmer </td><td> 2915-08 </td><td> PTFE, 0.2μm </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell y apparati enjuague (adiciones al biorreactor) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 y 1000 ml botellas de vidrio </td><td> Corning </td><td> 1395-500;-1L </td><td> Se utiliza para decell y aclarado por la gravedad </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Benzonase tratamiento </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Estadounidense Bioanalytical </td><td> AB14043 </td><td> 1 M, pH 8,0 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> JT Baker </td><td> 2444-01 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase nucleasa </td><td> Sigma </td><td> E1014 </td><td> Endonucleasa utiliza para eliminar restos de ADN de la matriz </td></tr></tbody></table>

procedimiento para la ingeniería de pulmón

Procedure for Lung Engineering

Los tejidos pulmonares, incluyendo cáncer de pulmón y enfermedades pulmonares crónicas, como enfermedad pulmonar obstructiva crónica, de forma acumulativa representan alrededor de 280.000 muertes al año, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica es actualmente la cuarta causa de muerte en los Estados Unidos 1. Que contribuyen a esta mortalidad es el hecho de que los pulmones por lo general no más allá de reparar o regenerar el nivel microscópico, celular. Por lo tanto, el tejido pulmonar que está dañado por la degeneración o una infección, o el tejido pulmonar resecado quirúrgicamente que no es funcionalmente reemplazado en vivo. Para explorar si el tejido pulmonar se pueden generar in vitro, se trataron los pulmones de ratas adultas utilizando un procedimiento que elimina los componentes celulares para producir un andamio extracelular pulmonar acelular matriz. Esta estructura mantiene las estructuras jerárquicas de ramificación de las vías respiratorias y los vasos sanguíneos, así como una membrana basal en gran parte intacto, que comprende colágeno IV, laminina y fibronectina. El andamio se monta en un biorreactor diseñado para imitar los aspectos críticos de la fisiología pulmonar, tales como ventilación con presión negativa y la perfusión vascular pulsátil. Por el epitelio pulmonar y el cultivo de endotelio vascular en el andamio montado en biorreactores, que son capaces de generar tejido pulmonar que es fenotípicamente similar al tejido pulmonar de origen y que es capaz de participar en el intercambio de gases para los intervalos de tiempo (45-120 minutos). Estos resultados son alentadores y sugieren que la repoblación de la matriz pulmonar es una estrategia viable para la regeneración del pulmón. Esta posibilidad se presenta una oportunidad no sólo de trabajar para aumentar la oferta de tejidos de los pulmones para un trasplante, sino también para el estudio de células respiratorias y la biología molecular in vitro durante más tiempo y en un microambiente más preciso que previamente ha sido posible.

Hemos desarrollado una matriz extracelular y de pulmón descelularizada biorreactor novela biomiméticos que se puede utilizar para generar tejido pulmonar funcional. Por la siembra de las células en la matriz y el cultivo en el biorreactor, que generan tejido que demuestra el intercambio de gases eficaz cuando se trasplantan en vivo por periodos cortos de tiempo.

Procedimiento para la Ingeniería de pulmón

El tejido pulmonar, incluyendo el cáncer de pulmón y las enfermedades pulmonares crónicas, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, representan acumulativamente algunas 280 000 muertes...

El objetivo general de este procedimiento es generar tejido pulmonar en cultivo que sea morfológica y fisiológicamente comparable al tejido pulmonar nativo. Esto se logra primero mediante la extracción del corazón y los pulmones de una rata adulta. El siguiente paso consiste en canular la arteria pulmonar y la tráquea, y conectar los pulmones canulados a un biorreactor para la descelularización.Después de la descelularización y el lavado, el pulmón se transfiere a un biorreactor de cultivo estéril y se prepara para la siembra. El paso final del procedimiento consiste en sembrar el compartimento deseado del pulmón con una población celular preparada. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la matriz extracelular descelularizada eficientemente repoblada con células que expresan marcadores pulmonares específicos de región mediante microscopía de inmunofluorescencia.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes de cultivo de células pulmonares in vitro es que las células mantienen fenotipos diferenciados durante un período prolongado de tiempo, lo que permite su estudio durante varias semanas en un sustrato biológicamente derivado tridimensional. Para la descelularización, los pulmones se conectan a la tapa del biorreactor mediante la cánula vascular, y la tapa se conecta al aparato de descelularización. El frasco de vidrio situado encima de los pulmones se mantiene en su lugar mediante un soporte con anillo y una pinza acoplada.En este punto, se puede eliminar el material celular para producir un andamio de matriz extracelular, el cual puede ser repoblado con material celular. En este diagrama se muestra el ensamblaje del biorreactor para la siembra y el cultivo de tejido pulmonar ingenierizado. El conector tipo bayoneta de la cánula traqueal se conecta a un circuito respiratorio entre el depósito traqueal y la cámara principal.El circuito respiratorio incluye dos válvulas unidireccionales. Las posiciones son tales que el medio sigue una trayectoria diferente al entrar y salir del pulmón. Un pequeño reservorio se incorpora temporalmente en la línea de perfusión para la siembra de células endoteliales.Se utiliza una bomba pulsátil para transportar las células desde el depósito hasta el compartimento vascular del pulmón. La perfusión vascular se realiza mediante una bomba de rodillos. El medio se perfunde hacia la arteria pulmonar a través de la cánula conectada, fluye a través de la vasculatura pulmonar y sale por la vena pulmonar directamente hacia el biorreactor principal, donde se extrae el medio para la perfusión.El epitelio pulmonar se coloca mediante inyección en el circuito respiratorio. La cámara principal que contiene el pulmón y el reservorio de la tráquea se utiliza para el cultivo pulmonar a largo plazo. Cuando los pulmones han sido extraídos y las arterias y la tráquea han sido canuladas correctamente, los pulmones recién extraídos deben retener aire sin fugas.Esto puede verificarse inflándolos con aire mientras están sumergidos en líquido. No debe haber burbujas que indiquen fugas de aire. Para comenzar el protocolo, los pulmones se inflan con PBS que contiene nitroprusiato de sodio hasta que estén llenos, pero sin sobreinflar; inmediatamente se tapona la cánula traqueal para que los pulmones permanezcan inflados.A continuación, perfunda los pulmones con PBS y SNP durante al menos 15 minutos a 15 milímetros de mercurio. Después, retire el tapón de la cánula traqueal para permitir que los pulmones se desinflejen. Continúe la perfusión con PBS y SNP durante 15 a 30 minutos si es necesario.Reabra el PBS y el SNP para asegurar que la presión de perfusión se mantenga entre 10 y 15 milímetros de mercurio. Para iniciar el procedimiento de descelularización prolongada, la tapa del biorreactor se conecta al aparato de descelularización. Luego, los pulmones se conectan a la tapa.Utilizando las conexiones de bloqueo del anzuelo unidas a la cánula en forma de YS, la cánula de la arteria pulmonar debe conectarse a la línea de perfusión y la cánula traqueal debe quedar suelta. Para garantizar la descelularización completa del tejido, es fundamental mantener el aire fuera del sistema. Las válvulas unidireccionales en las cánulas arterial y traqueal ayudan a eliminar las burbujas de aire en el tubo mediante el flujo inverso en el mismo.Por lo tanto, permita que las burbujas de aire sean eliminadas mediante la jeringa y asegúrese de que todas las líneas estén libres de aire. Inicie la perfusión con la solución de descelularización. Perfundido con solución de descelularización.Hasta que 500 mililitros de solución hayan perfundido a través de los pulmones, la presión óptima es inferior a 15 milímetros de mercurio. Esto normalmente requerirá 2,5 horas. Las tasas de flujo suelen ser muy lentas al principio y aumentan rápidamente durante la segunda hora hasta aproximadamente un mililitro por minuto o más.Durante la perfusión, retire periódicamente el líquido de descelularización del biorreactor, asegurándose de que quede suficiente líquido para soportar el pulmón y la cánula traqueal. Cuando la perfusión con el líquido de descelularización haya finalizado, transfiera los pulmones y el biorreactor a una cabina de cultivo celular. Para iniciar el lavado del órgano, retire el frasco de 500 mililitros que contiene el líquido de descelularización y sustitúyalo por un frasco estéril que contenga hasta un litro de PBS estéril.Utilice succión al vacío o una jeringa para asegurarse de que los tubos estén libres de aire y perfunda PBS a través de la vasculatura a 10-15 milímetros de mercurio de la misma manera. En cuanto a la descelularización, retire periódicamente el PBS residual del biorreactor empleando técnicas estériles y reemplace o rellene el frasco de PBS. Continúe enjuagando con PBS fresco y estéril hasta que al menos 2,5 litros de PBS estéril hayan perfundido los pulmones.Esto normalmente tomará dos días desde el inicio del proceso de descelularización, cuando finalice el lavado. Transfiera los pulmones a un nuevo sistema de biorreactor estéril que contenga PBS fresco más 10% de FBS más 10% de penicilina-estreptomicina, asegurándose de que tanto todo el circuito de perfusión como todas las líneas de la vía aérea estén completamente llenos de líquido. A partir de este momento, se utilizará una bomba pulsátil para perfundir los pulmones a cinco milímetros por minuto.Sterilice el andamio de matriz extracelular pulmonar mediante perfusión nocturna con PBS que contenga 10% de FBS y 10% de penicilina-estreptomicina. Tras completar este paso, transfiera los pulmones a una incubadora a 37 grados Celsius durante una hora o hasta que se equilibre la temperatura. Como preparación para el tratamiento con Ben Nase, el siguiente paso consiste en tratar los pulmones con Ben Nase.Para eliminar el ADN residual de cada pulmón, primero llene una jeringa de 10 mililitros solo con tampón Prewarm Ben Nase, y otra jeringa de 10 mililitros con 90 unidades por mililitro de Ben Nase diluido en tampón Ben Nase. Detenga la perfusión de los pulmones.Luego, infle la vía aérea con el tampón Ben Nase evitando inyectar aire en el pulmón. Deje que el pulmón se desinfle durante un minuto. A continuación, infle el pulmón con la solución de Ben Nase.Nuevamente, teniendo cuidado de no introducir aire en el pulmón después de insuflar con Ben Nase. Deje los pulmones reposar sin perfusión ni ventilación a 37 grados Celsius durante una hora. Al final de la hora, reanude la perfusión con la PBS más 10 %FBS y 10 %penicilina-estreptomicina que ya está en el biorreactor, y continúe la perfusión durante la noche en el día siguiente.Después de la enjuagada y la esterilización, se puede preparar el andamio largo de matriz extracelular para la repoblación celular. Reemplace la solución de P-B-S-F-B-S benzo a con 250 mililitros de medio de cultivo. Perfunda durante al menos una hora antes de introducir las células y reemplace con medio de cultivo fresco directamente antes de sembrar las células.Se pueden utilizar muchas fuentes celulares para la recesión de órganos. A continuación, se demostrará el asentamiento con una población de células epiteliales. Primero, prepare una jeringa que contenga 15 mililitros de una suspensión celular de la población deseada de células epiteliales.A continuación, llene el reservorio de la vía aérea con 80 mililitros de medio de cultivo y asegúrese de que todas las líneas de ventilación estén libres de aire. Luego coloque el biorreactor en una incubadora de cultivo tisular a 37 grados Celsius y conecte la bomba de jeringa para la ventilación. Siembre las células en los pulmones mediante un bolo rápido único, inyectando la suspensión celular de 15 mililitros en la cánula traqueal.Asegúrese de que los filtros de aire del biorreactor principal estén tapados. Luego, comience inmediatamente una única respiración lenta utilizando la bomba de jeringa para extraer 60 mililitros de aire del biorreactor principal a una velocidad de tres mililitros por minuto. Esto durará aproximadamente 20 minutos.Deje que los pulmones reposen estáticamente durante aproximadamente 18 horas después de eso. Inicie la perfusión vascular lenta a aproximadamente 0,5 mililitros por minuto. Durante el cultivo de órganos, la perfusión generalmente se realiza de uno a tres mililitros por minuto.Al utilizar una bomba de rodillos durante el cultivo epitelial, la ventilación generalmente se proporciona a una tasa continua de una respiración por minuto y un volumen tidal de cinco a 10 mililitros. Mediante el uso de una bomba de jeringa, el aire se extrae e inyecta cíclicamente en el biorreactor para simular la respiración alternando entre presión negativa y presión atmosférica dentro de la cámara principal. Debido a la necesidad de mantener el biorreactor hermético durante la ventilación, esta debe interrumpirse diariamente y el aire en la cámara principal debe renovarse.Además, el medio debe cambiarse aproximadamente cada tres o cuatro días. Durante el cultivo, aproximadamente la mitad del volumen total debe intercambiarse cada vez al cultivar el epitelio pulmonar y el endotelio vascular. Dentro del andamio montado en el biorreactor, es posible generar tejido pulmonar capaz de participar en el intercambio gaseoso durante intervalos de tiempo cortos.Se muestra aquí una tinción estándar de hematoxilina, eosina y tricrómica de pulmón de rata nativo para compararla con una tinción de H y E de un pulmón de rata descelularizado. La matriz extracelular final descelularizada debe estar completamente exenta de materiales celulares y conservar las características macroscópicas, microscópicas y ultraestructurales del pulmón nativo. La tinción de H y E permitirá la visualización de cualquier ADN residual adherido al andamiaje como resultado de una descelularización o lavado insuficientes, condiciones óptimas para la siembra celular y el posterior cultivo del pulmón.Y el biorreactor debería producir una distribución homogénea de células dentro de los cinco lóbulos del pulmón y debería proporcionar una cobertura de aproximadamente el 70% del andamiaje de matriz extracelular. Estas imágenes comparan el pulmón nativo con el pulmón repoblado cuando se tiñen mediante inmunofluorescencia. Para los marcadores clave del pulmón, la población celular cultivada es positiva para la proteína secretora de células de Clara, la proteína secretora pro C y la acuaporina cinco.Los marcadores de interés se muestran en rojo y los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul en todos los paneles. Una vez dominado este procedimiento, desde la descelularización hasta la recesión, puede realizarse en cuatro o cinco días si se lleva a cabo correctamente.

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Este protocolo presenta un modelo de perfusión pulmonar ex-vivo en ratas que incorpora una exposición transitoria a un estrés térmico calibrado, promoviendo mecanismos protectores endógenos para el reacondicionamiento terapéutico de injertos pulmonares dañados. El enfoque es escalable y reproducible y apoya el desarrollo de terapias no farmacológicas para mejorar el éxito del trasplante de pulmón.

Preacondicionamiento térmico durante la perfusión pulmonar ex vivo para la rehabilitación de injertos pulmonares dañados antes del trasplante

Aprende a generar tejido pulmonar funcional mediante descelularización de matriz extracelular y bioreactor biomimético en ratas. Este método permite mantener fenotipos diferenciados y lograr intercambio gaseoso in vivo.

Procedimiento para la Ingeniería de pulmón

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