Procedimiento para la Ingeniería de pulmón

El objetivo general de este procedimiento es generar tejido pulmonar en cultivo que sea morfológica y fisiológicamente comparable al tejido pulmonar nativo. Esto se logra primero extrayendo el corazón y los pulmones de una rata adulta. El siguiente paso consiste en canular la arteria pulmonar y la tráquea, y conectar los pulmones canulados a un biorreactor para la descelularización.

Después de la descelularización y el lavado, el pulmón se transfiere a un biorreactor de cultivo estéril y se prepara para la siembra celular. El último paso del procedimiento consiste en sembrar el compartimento deseado del pulmón con una población celular preparada. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la matriz extracelular descelularizada eficientemente repoblada con células que expresan marcadores pulmonares específicos de región mediante microscopía de inmunofluorescencia.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes de cultivo de células pulmonares in vitro es que las células mantienen fenotipos diferenciados durante un período prolongado de tiempo, lo que permite su estudio durante varias semanas en un sustrato biológicamente derivado tridimensional. Para la descelularización, los pulmones se conectan a la tapa del biorreactor mediante la cánula vascular, y la tapa se conecta al aparato de descelularización. El frasco de vidrio situado encima de los pulmones se mantiene en su lugar mediante un soporte con anillo y una pinza acoplada.

En este punto, se puede eliminar el material celular para producir un andamio de matriz extracelular, el cual puede ser repoblado con material celular. En este diagrama se muestra el ensamblaje del biorreactor para la siembra y el cultivo de tejido pulmonar ingenierizado. El conector de bloqueo tipo anzuelo de la cánula traqueal se conecta a un circuito respiratorio entre el depósito traqueal y la cámara principal.

El circuito respiratorio incluye dos válvulas unidireccionales. Las posiciones son tales que el medio sigue una trayectoria diferente al entrar y salir del pulmón. Un pequeño reservorio se incorpora temporalmente en la línea de perfusión para la siembra de células endoteliales.

Se utiliza una bomba pulsátil para transportar las células desde el depósito hasta el compartimento vascular del pulmón. La perfusión vascular se realiza mediante una bomba de rodillos. El medio se perfunde hacia la arteria pulmonar a través de la cánula conectada, fluye a través de la vasculatura pulmonar y sale por la vena pulmonar directamente hacia el biorreactor principal, donde se extrae el medio para la perfusión.

El epitelio pulmonar se coloca mediante inyección en el circuito respiratorio. La cámara principal que contiene el pulmón y el reservorio de la tráquea se utiliza para el cultivo pulmonar a largo plazo. Cuando los pulmones han sido extraídos y las cánulas se han insertado correctamente en la arteria y la tráquea, los pulmones recién extraídos deben retener aire sin fugas.

Esto puede verificarse inflándolos con aire mientras están sumergidos en líquido. No debe haber burbujas que indiquen fugas de aire. Para comenzar el protocolo, los pulmones se inflan con PBS que contiene nitroprusiato de sodio hasta que estén llenos, pero sin sobreinflar; inmediatamente, tape la cánula traqueal para que los pulmones permanezcan inflados.

A continuación, perfunda los pulmones con PBS y SNP durante al menos 15 minutos a 15 milímetros de mercurio. Después, retire el tapón de la cánula traqueal para permitir que los pulmones se desinflejen. Continúe la perfusión con PBS y SNP durante 15 a 30 minutos si es necesario.

Reponga el PBS y el SNP para asegurar que la presión de perfusión se mantenga entre 10 y 15 milímetros de mercurio. Para iniciar el procedimiento de descelularización prolongada, la tapa del biorreactor se conecta al aparato de descelularización. Luego, los pulmones se conectan a la tapa.

Mediante las conexiones de bloqueo del cebo unidas a la cánula en forma de YS, la cánula de la arteria pulmonar debe conectarse a la línea de perfusión y la cánula traqueal debe quedar libre flotando. Para garantizar la descelularización completa del tejido, es fundamental mantener el aire fuera del sistema. Las válvulas unidireccionales en las cánulas arterial y traqueal ayudan a eliminar las burbujas de aire en el tubo mediante el flujo inverso en el tubo.

Por lo tanto, permita que las burbujas de aire sean eliminadas mediante la jeringa; asegúrese de que todas las líneas estén libres de aire. Comience la perfusión con la solución de descelularización. Perfundido con solución de descelularización.

Hasta que 500 mililitros de solución hayan perfundido a través de los pulmones, la presión óptima es inferior a 15 milímetros de mercurio. Esto generalmente requerirá 2,5 horas. Las tasas de flujo suelen ser muy lentas al principio y aumentan rápidamente durante la segunda hora hasta aproximadamente un mililitro por minuto o más.

Durante la perfusión, retire periódicamente el fluido de descelularización utilizado del biorreactor, asegurándose de que quede suficiente líquido para soportar el pulmón y la cánula traqueal. Cuando la perfusión con el fluido de descelularización haya finalizado, transfiera los pulmones y el biorreactor a una cabina de cultivo de tejidos. Para iniciar el lavado del órgano, retire el frasco de 500 mililitros que contiene el fluido de descelularización y sustitúyalo por un frasco estéril que contenga hasta un litro de PBS estéril.

Utilice succión al vacío o una jeringa para asegurarse de que los tubos estén libres de aire y perfunda PBS a través de la vasculatura a 10-15 milímetros de mercurio de la misma manera. En cuanto a la descelularización, retire periódicamente el PBS residual del biorreactor utilizando técnicas estériles y reemplace o rellene el frasco de PBS. Continúe enjuagando con PBS fresco y estéril hasta que al menos 2,5 litros de PBS estéril hayan perfundido los pulmones.

Esto normalmente tomará dos días desde el inicio del proceso de descelularización, una vez completado el lavado. Transfiera los pulmones a un nuevo sistema de biorreactor estéril que contenga PBS fresco más 10 % de FBS más 10 % de penicilina-estreptomicina, asegurándose de que tanto todo el circuito de perfusión como todas las líneas de vía aérea estén llenos de líquido. A partir de este momento, se utilizará una bomba pulsátil para perfundir los pulmones a cinco milímetros por minuto.

Sterilice el andamio de matriz extracelular pulmonar mediante perfusión nocturna con PBS que contenga 10% de FBS y 10% de penicilina-estreptomicina. Tras completar este paso, transfiera los pulmones a una incubadora a 37 grados Celsius durante una hora o hasta que se equilibre la temperatura. Como preparación para el tratamiento con Ben Nase, el siguiente paso consiste en tratar los pulmones con Ben Nase.

Para eliminar el ADN remanente de cada pulmón, primero llene una jeringa de 10 mililitros solo con tampón Prewarm Ben Nase, y otra jeringa de 10 mililitros con 90 unidades por mililitro de Ben Nase diluido en tampón Ben Nase. Detenga la perfusión de los pulmones.

Luego, infle la vía aérea con el tampón Ben Nase evitando inyectar aire en el pulmón. Deje que el pulmón se desinfle durante un minuto. A continuación, infle el pulmón con la solución de Ben Nase.

Nuevamente, tenga cuidado de no introducir aire en el pulmón después de insuflar con Ben Nase. Deje reposar los pulmones sin perfusión ni ventilación a 37 grados Celsius durante una hora. Al finalizar la hora, reanude la perfusión con la PBS más 10% FBS y 10% penicilina-estreptomicina que ya está en el biorreactor, y continúe la perfusión durante toda la noche al día siguiente.

Después de la enjuagada y la esterilización, se puede preparar el andamio largo de matriz extracelular para la repoblación celular. Reemplace la solución de P-B-S-F-B-S benzo a con 250 mililitros de medio de cultivo. Perfunda durante al menos una hora antes de introducir las células y sustituya por medio de cultivo fresco inmediatamente antes de sembrar las células.

Se pueden utilizar muchas fuentes celulares para la recesión de órganos. Aquí, se demostrará el asentamiento con una población de células epiteliales. Primero, prepare una jeringa que contenga 15 mililitros de una suspensión celular de la población deseada de células epiteliales.

A continuación, llene el reservorio de la vía aérea con 80 mililitros de medio de cultivo y asegúrese de que todas las líneas de ventilación estén libres de aire. Luego coloque el biorreactor en un incubador de cultivo tisular a 37 grados Celsius y conecte la bomba de jeringa para la ventilación. Siembre las células en los pulmones mediante un bolo rápido único, inyectando la suspensión celular de 15 mililitros en la cánula traqueal.

Asegúrese de que los filtros de aire del biorreactor principal estén tapados. Luego, comience inmediatamente una única respiración lenta utilizando la bomba de jeringa para extraer 60 mililitros de aire del biorreactor principal a una velocidad de tres mililitros por minuto. Esto durará aproximadamente 20 minutos.

Deje reposar los pulmones estáticamente durante aproximadamente 18 horas después de eso. Inicie la perfusión vascular lenta a aproximadamente 0,5 mililitros por minuto. Durante el cultivo del órgano, la perfusión se realiza típicamente de uno a tres mililitros por minuto.

Al utilizar una bomba de rodillos durante el cultivo epitelial, la ventilación generalmente se proporciona a una tasa continua de una respiración por minuto y un volumen tidal de cinco a 10 mililitros. Mediante el uso de una bomba de jeringa, el aire se extrae e inyecta cíclicamente en el biorreactor para simular la respiración alternando entre presión negativa y presión atmosférica dentro de la cámara principal. Debido a la necesidad de mantener el biorreactor hermético durante la ventilación, esta debe interrumpirse diariamente y el aire en la cámara principal debe renovarse.

Además, el medio debe cambiarse aproximadamente cada tres o cuatro días. Durante el cultivo, aproximadamente la mitad del volumen total debe intercambiarse cada vez al cultivar el epitelio pulmonar y el endotelio vascular. Dentro del andamio montado en el biorreactor, es posible generar tejido pulmonar capaz de participar en el intercambio gaseoso durante intervalos de tiempo cortos.

Se muestra aquí una tinción estándar de hemat, toin y eoin de pulmón de rata nativo para comparación con una tinción H y E de un pulmón de rata descelularizado. La matriz extracelular final descelularizada debe estar completamente exenta de materiales celulares y conservar las características macroscópicas, microscópicas y ultraestructurales del pulmón nativo. La tinción H y E permitirá la visualización de cualquier ADN residual adherido al andamiaje como resultado de una descelularización o lavado insuficientes, condiciones óptimas para la siembra celular y el posterior cultivo del pulmón.

Y el biorreactor debería producir células bien distribuidas dentro de los cinco lóbulos del pulmón y debería proporcionar una cobertura de aproximadamente el 70 % del andamiaje de matriz extracelular. Estas imágenes comparan el pulmón nativo con el pulmón repoblado cuando se tiñen mediante inmunofluorescencia. Para los marcadores clave del pulmón, la población celular cultivada es positiva para la proteína secretora de células de Clara, la proteína secretora pro C y la acuaporina cinco.

Los marcadores de interés se muestran en rojo y los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul en todos los paneles. Una vez dominado este procedimiento, desde la descelularización hasta la recolonización, puede realizarse en cuatro o cinco días si se lleva a cabo correctamente.