Procedimiento para la Ingeniería de pulmón

El objetivo general de este procedimiento es generar tejido pulmonar en cultivo que sea morfológica y fisiológicamente comparable al tejido pulmonar nativo. Esto se logra extrayendo primero el corazón y los pulmones de una rata adulta. El siguiente paso es canular la arteria pulmonar y la tráquea y conectar los pulmones canulados a un biorreactor para su descelularización.

Después de la descelularización y el enjuague, el pulmón se transfiere a un biorreactor de cultivo estéril y se prepara para el asiento. El paso final del procedimiento es sembrar el compartimento deseado del pulmón con una población de células preparada. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la matriz extracelular descelularizada repoblada de manera eficiente con células que expresan marcadores pulmonares regionales específicos a través de la microscopía de inmunofluorescencia.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes de cultivo de células pulmonares in vitro es que las células mantienen fenotipos diferenciados durante un período prolongado de tiempo, por lo que pueden estudiarse durante varias semanas en un sustrato tridimensional de origen biológico. Para la descelularización, los pulmones están conectados a la tapa del biorreactor a través de la cánula vascular, y la tapa está conectada al aparato de descelularización. La botella de vidrio sobre los pulmones se mantiene en su lugar mediante un soporte de anillos y una abrazadera adjunta.

En este punto, el material celular se puede eliminar para producir un andamio de matriz extracelular, que se puede repoblar con material celular. En este diagrama se muestra el ensamblaje del biorreactor para la siembra y el cultivo de tejido pulmonar modificado. El conector de bloqueo de señuelo de la cánula traqueal se conecta a un circuito de respiración entre el depósito de tráquea y la cámara principal.

El asa respiratoria incluye dos válvulas unidireccionales. Posiciones tales que el medio sigue un camino diferente hacia adentro y hacia afuera del pulmón. Un pequeño reservorio se incorpora temporalmente a la línea de perfusión para la siembra de células endoteliales.

Se utiliza una bomba pulsátil para transportar las células desde el reservorio hasta el compartimento vascular del pulmón. La perfusión vascular se realiza mediante una bomba de rodillos. El medio se perfunde en la arteria pulmonar a través de la cánula adjunta, fluye a través de la vasculatura pulmonar y sale por la vena pulmonar directamente al biorreactor principal, donde se extrae el medio para la perfusión.

El epitelio pulmonar se deposita mediante inyección en el asa respiratoria. La cámara principal que contiene el pulmón y el reservorio de la tráquea se utilizan para el cultivo pulmonar a largo plazo. Cuando se han extraído los pulmones y la arteria y la tráquea se han canulado correctamente, los pulmones recién extraídos deben retener el aire sin fugas.

Esto se puede comprobar inflándolos con aire mientras están sumergidos en líquido. No debe haber burbujas que indiquen fugas de aire. Para comenzar el protocolo, los pulmones se inflan con PBS que contiene nitropress de sodio hasta que los pulmones estén llenos pero no sobreinflados inmediatamente tapen la cánula traqueal para que los pulmones permanezcan inflados.

A continuación, perfunda los pulmones con PBS y SNP durante al menos 15 minutos a 15 milímetros de mercurio. Después de eso, retire el tapón de la cánula traqueal para permitir que los pulmones se desinfle. Continúe la perfusión con PBS y SNP durante 15 a 30 minutos si es necesario.

Rellene PBS y SNP para asegurarse de que la presión de profusión se mantenga en 10 a 15 milímetros de mercurio. Para comenzar el procedimiento de descelularización prolongada, la tapa del biorreactor se conecta al aparato de descelularización. Luego, los pulmones se conectan a la tapa.

Usando las conexiones de bloqueo de señuelo conectadas a la cánula en forma de YS, la cánula de la arteria pulmonar debe conectarse a la línea de perfusión y la cánula traqueal debe flotar libremente. Para asegurar la descelularización completa del tejido, es crucial mantener el aire fuera del sistema. Las válvulas unidireccionales en la cánula arterial y traqueal ayudan a eliminar las burbujas de aire en el tubo al permitir el flujo de inversión en el tubo.

Por lo tanto, al permitir que las burbujas de aire se eliminen con una jeringa, asegúrese de que todas las líneas estén libres de aire. Iniciar la perfusión con solución de descelularización. Perfundido con solución de descelularización.

Hasta que 500 mililitros de solución se hayan perfundido a través de los pulmones, la presión óptima es menos de 15 milímetros de mercurio. Por lo general, esto requerirá 2,5 horas. Los caudales suelen ser muy lentos al principio y aumentan rápidamente durante la segunda hora a aproximadamente un mililitro por minuto o más.

Durante la perfusión se extrae periódicamente, se utiliza el líquido de descelularización del biorreactor, al tiempo que se asegura que quede suficiente líquido para soportar el pulmón y la cánula traqueal. Una vez completada la perfusión con el líquido de descelularización, transfiera los pulmones y el biorreactor a una campana de cultivo de tejidos. Para comenzar el enjuague de órganos, retire el frasco de 500 mililitros que contiene el líquido de descelularización y reemplácelo con un frasco estéril que contenga hasta un litro de PBS estéril.

Use ventosa, succión o una jeringa para asegurarse de que las líneas estén libres de aire, perfunde PBS a través de la vasculatura a 10 a 15 milímetros de mercurio de la misma manera. En cuanto a la descelularización, el uso de técnicas estériles elimina periódicamente los residuos de PBS del biorreactor y reemplaza o rellena el frasco de PBS. Con PBS fresco y estéril, continúe enjuagando hasta que al menos 2,5 litros de PBS estéril hayan perfundido los pulmones.

Por lo general, esto tomará dos días desde el comienzo del proceso de descelularización cuando se completa el enjuague. Transfiera los pulmones a un nuevo sistema de biorreactor estéril que contenga PBS fresco más 10 % de FBS más 10 % de estreptococo en la pluma, asegúrese de que tanto todo el circuito de perfusión como todas las vías respiratorias estén llenas de líquido. A partir de aquí, se utilizará una bomba pulsátil para perfundir los pulmones a cinco milímetros por minuto.

Esterilizar el andamio de la matriz extracelular pulmonar mediante perfusión nocturna con PBS que tiene 10% de FBS y 10% de estreptomicina de penicilina. Después de completar este paso, transfiera los pulmones a una incubadora de 37 grados centígrados durante una hora o hasta que la temperatura se equilibre. En preparación para el tratamiento con Ben Nase, el siguiente paso es tratar los pulmones con Ben Nase.

Para eliminar el ADN remanente de cada pulmón, primero llene una jeringa de 10 mililitros con tampón Prewarm Ben Nase solamente, y una jeringa de 10 mililitros con 90 unidades por mililitro. Ben Nase diluido en tampón Ben Nase. Detener la perfusión de los pulmones.

A continuación, infle las vías respiratorias con el tampón Ben Nase evitando inyectar aire en el pulmón. Deje que el pulmón se desinfle durante un minuto. A continuación, infle el pulmón con la solución de Ben Nase.

De nuevo, teniendo cuidado de no introducir aire en el pulmón después de inflar con Ben Nase. Permita que los pulmones se asienten sin perfusión ni ventilación a 37 grados centígrados durante una hora. Al final de la hora, reanude la perfusión con el PBS más 10%FBS 10% penicilina estreptomicina que ya está en el biorreactor, y continúe la perfusión durante la noche del día siguiente.

Después del enjuague y la esterilización, el andamio largo de la matriz extracelular se puede preparar para el repoblamiento celular. Reemplace la solución P-B-S-F-B-S benzo a con 250 mililitros de cultivo. Perfu medio durante al menos una hora antes de que se introduzcan las células y reemplácelo con medio de cultivo fresco directamente antes de sembrar las células.

Muchas fuentes celulares se pueden utilizar para el retroceso de órganos. Aquí, se demostrará el asiento con una población de células epiteliales. Primero, prepare una jeringa que contenga 15 mililitros de una suspensión celular de la población de células epiteliales deseada.

A continuación, llene el depósito de las vías respiratorias con 80 mililitros de medio de cultivo y asegúrese de que todas las líneas de ventilación estén libres de aire. A continuación, coloque el biorreactor en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados y conecte la bomba de jeringa para la ventilación. Siembre las células en los pulmones usando un solo bolo rápido inyectando la suspensión celular de 15 mililitros en la cánula traqueal.

Asegúrese de que los filtros de aire del biorreactor principal estén tapados. A continuación, comience inmediatamente una sola respiración lenta utilizando la bomba de jeringa para extraer 60 mililitros de aire del biorreactor principal a tres mililitros por minuto. Esto durará aproximadamente 20 minutos.

A permitir que los pulmones permanezcan estáticos durante aproximadamente 18 horas después de eso. Comience la perfusión vascular lenta a aproximadamente 0,5 mililitros por minuto. Durante el cultivo de órganos, la perfusión se realiza normalmente a una velocidad de uno a tres mililitros por minuto.

Usando una bomba de rodillo durante el cultivo epitelial, la ventilación generalmente se proporciona a una tasa continua de una respiración por minuto y un volumen corriente de cinco a 10 mililitros. Mediante el uso de una bomba de jeringa, el aire se extrae cíclicamente y se inyecta en el biorreactor para afectar la respiración alternando entre la presión negativa y la presión atmosférica dentro de la cámara principal. Debido a la necesidad de mantener el biorreactor hermético durante la ventilación, la ventilación debe detenerse diariamente y el aire de la cámara principal debe intercambiarse.

Además, el medio debe cambiarse aproximadamente cada tres o cuatro días. Durante el cultivo, aproximadamente la mitad del volumen total debe intercambiarse cada vez mediante el cultivo del epitelio pulmonar y el endotelio vascular. Dentro del andamio montado en el biorreactor, somos capaces de generar tejido pulmonar que es capaz de participar en el intercambio de gases durante cortos intervalos de tiempo.

Aquí se muestra una tinción estándar de hemat, toin y eoin de pulmón de rata nativa para compararla con una tinción H y e de un pulmón de rata descelularizado. La matriz extracelular descelularizada final debe estar completamente desprovista de materiales celulares y conservar las características macroscópicas, microscópicas y ultraestructurales del pulmón nativo. La tinción h y e permitirá la visualización de cualquier remanente de ADN, adherido al andamio como resultado de una descelularización insuficiente o enjuague en condiciones óptimas para la siembra celular y el posterior cultivo del pulmón.

Y el biorreactor debe producir células bien distribuidas dentro de los cinco lóbulos del pulmón y debe proporcionar una cobertura de aproximadamente el 70% del andamiaje de la matriz extracelular. Estas imágenes comparan el pulmón nativo con el pulmón repoblado cuando se tiñen por inmunofluorescencia. En cuanto a los marcadores pulmonares clave, la población de células cultivadas es positiva para la proteína secretora de células Clara, la proteína C prosecretora y la acuaporina cinco.

Los marcadores de interés se muestran en rojo y los núcleos teñidos con DAPI están en azul en todos los paneles. Una vez dominado este procedimiento desde la descelularización hasta el retroceso, se puede realizar en cuatro o cinco días si se realiza correctamente.