Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual

El objetivo general del siguiente experimento es realizar los aspectos clave de la obtención crónica de imágenes de dos fotones en ratones, explorando un entorno de realidad virtual. Esto se logra modificando un microscopio de dos fotones para obtener imágenes rápidas y estables en ratones que se comportan. A continuación, se instala una cinta de correr con soporte neumático capaz de realizar el seguimiento de la locomoción.

A continuación, se prepara un entorno de realidad virtual que utiliza un proyector LED sincronizado con el microscopio con el fin de minimizar la fuga de luz. Como resultado, se obtienen grabaciones de imágenes buenas y estables debido a la reducción de los artefactos de movimiento, la reducción de la fuga de luz y la minimización del borde de daño fotográfico. Aunque este método se puede utilizar para medir la neuroactividad durante la navegación en un entorno de realidad virtual, también se puede adaptar fácilmente a una amplia variedad de paradigmas conductuales diferentes que requieren estimulación visual.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y llevados a cabo de acuerdo con las directrices del departamento veterinario de la estación del Cantón de Basilia. Los dos microscopios de fotones utilizados en estos experimentos consisten en un cabezal de escaneo compuesto por un escáner resonante de ocho o 12 kilohercios y un galvanómetro estándar. Esto permite velocidades de fotogramas de 40 o 60 hercios a 750 veces 400 píxeles y reduce la distorsión de la imagen inducida por el movimiento cerebral, el fotoblanqueo y la fototoxicidad.

Se utiliza un escalador paso Z piezoeléctrico de alta velocidad para adquirir secuencialmente imágenes intercaladas en el tiempo a múltiples profundidades. Se utiliza una suturadora mecánica para reducir la exposición del láser al tejido en los puntos de giro de la trayectoria de escaneo, la sucinta debe ser ajustable para establecer su ancho. Dependiendo de la amplitud del escáner resonante, conecte un tubo de suministro de aire con un diámetro interior de al menos 10 milímetros al soporte de bolas de la cinta de correr y coloque una cantidad BLE de tubos entre el suministro de aire principal y el soporte de bolas para reducir el ruido.

Coloca una bola de espuma de poliestireno de 20 centímetros de diámetro en un portabolas diseñado a medida e impreso en 3D. Si el paradigma conductual solo requiere locomoción hacia adelante y hacia atrás, inserte un alfiler como una aguja hipodérmica de calibre 19 en el costado de la pelota. Para restringir el movimiento de la bola en el eje horizontal, use uno o dos ratones ópticos de computadora para rastrear el movimiento de la bola alrededor de dos o los tres ejes respectivamente.

Para preparar el entorno de realidad virtual, utilice proyectores LED o pantallas de ordenador con retroiluminación LED para la visualización. Integre un circuito de compuerta para un parpadeo rápido de los LED durante la toma de imágenes. La frecuencia de parpadeo de 24 kilohercios es órdenes de magnitud por encima del umbral de fusión de parpadeo, por encima del cual el parpadeo ya no es percibido por el animal.

Ajuste la frecuencia de parpadeo exacta y el ciclo de trabajo para sincronizar la salida de luz del proyector con los puntos de respuesta del escáner resonante para el seguimiento de la pupila, use una cámara de video basada en CMO. Asegúrese de que la cámara no contenga un filtro de bloqueo de infrarrojos. Aproximadamente dos o tres semanas después de inyectar el indicador genético de calcio e implantar una ventana craneal, utilice la iluminación de epifluorescencia para comprobar la claridad y la expresión del implante de ventana craneal.

Claramente visible y nítidamente definido. Los límites de los vasos sanguíneos superficiales son una buena indicación de que el implante de ventana es adecuado para la obtención de imágenes uno o dos días después. Para llevar a cabo el experimento de dos fotones, mida y ajuste la potencia del láser a un valor inferior a 50 milivatios en la muestra.

A continuación, encienda el flujo de aire a la cinta de correr esférica. A continuación, fije al animal en la cinta de correr esférica. Las primeras veces que el mouse está fijo en la cabeza.

Este proceso se puede facilitar sedando brevemente al animal con iso flúor. Una vez que el animal se ha acostumbrado al procedimiento, el montaje se puede realizar normalmente sin sedación. Tenga en cuenta que es fundamental minimizar el estrés del animal durante este procedimiento.

A continuación, coloque el sistema de visualización lo más cerca posible del animal para permitir el acceso al animal. Asegúrese de que el implante de ventana craneal esté libre de suciedad y límpielo con agua si es necesario, aplique gel de ultrasonido transparente como medio de inmersión entre la ventana craneal y el objetivo de inmersión en agua para proteger la luz. Envuelve un trozo de cinta adhesiva negra alrededor del objetivo y la barra principal.

Mueva la arena del entorno virtual a su posición final y ajuste la cámara de video para el seguimiento de los alumnos. Finalmente, configure el supresor láser para que coincida con la amplitud de escaneo utilizada durante el experimento y comience a registrar datos cuando se completen los experimentos. Eutanasiar al animal de acuerdo con las pautas de su institución.

La calidad de la imagen en las imágenes de calcio de dos fotones de las poblaciones celulares marcadas con un indicador genético de calcio depende en gran medida de la calidad del implante de la ventana craneal, como se demuestra aquí al verificar la claridad de la ventana craneal después de la inyección del virus, no debe haber tejido de granulación ni recrecimiento óseo visible. Además, el patrón de los vasos sanguíneos superficiales debe permanecer inalterado y los límites de la vasculatura deben estar claramente definidos. Al mismo tiempo, la BOI de las células marcadas debe ser claramente visible bajo un microscopio de epifluorescencia.

Idealmente, la preparación es lo suficientemente estable como para que las distorsiones de las dos imágenes de fotones inducidas por la locomoción del ratón no sean visibles en la imagen después del registro de fotogramas. La fuga de luz del sistema de estimulación visual se puede eliminar por completo sincronizando correctamente la salida de luz del proyector con los puntos de giro del escáner de resonancia. Cuando no se adquieren datos, la frecuencia de parpadeo de la fuente de luz debe ser el doble de la frecuencia de escaneo.

En este ejemplo, se eliminó el blanco para ilustrar el efecto de la fuga de luz que se muestra en los cuadros naranjas durante la estimulación visual. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar dos veces en la imagen, comportándose con ratones, navegando por un entorno de realidad virtual. Además de configurar los sistemas de imagen y realidad virtual como se describe aquí, la clave del éxito de estos experimentos es dominar la técnica de implante de ventana craneal.

Un implante limpio es un requisito previo para obtener imágenes de alta calidad y grabaciones estables.