Name: Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-20T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprende a realizar imagen de calcio con dos fotones en ratones que navegan entornos de realidad virtual. Este método reduce artefactos de movimiento y fugas de luz para obtener registros neuronales estables y de alta calidad.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Friedrich Miescher para la Investigación Biomédica, la Sociedad Max Planck y el Programa Científico Fronteras Humanos.

Fueron aprobadas y realizadas de conformidad con las directrices del Departamento del Cantón de Basilea-Ciudad Veterinario Todos los procedimientos con animales. 1. Hardware y software de instalación <ol><li> Dos fotones configuración microscopio de barrido: <ol><li> Utilice un láser infrarrojo pulsante como una fuente de iluminación (ancho de pulso &lt;120 fs). </li><li> Utilice una exploración de cabeza compuesto por un escáner de resonancia 8 o 12 kHz y un nivel galvanómetro Nota:. Esto permite velocidades de fotogramas de 40 o 60 Hz a 750 x 400 píxeles. Una alta tasa de cuadros es fundamental para minimizar el movimiento del cerebro distorsión de la imagen inducida. Por otra parte, los resultados de escaneo rápido resonantes en un rendimiento de señal más alta y reduce fotoblanqueo 16 y fototoxicidad. </li><li> Utilice una velocidad alta Z-paso a paso piezoeléctrico secuencialmente tiempo adquirir imágenes intercaladas en múltiples profundidades Nota:. Esto es opcional y se utiliza para aumentar el rendimiento de datos a costa de la velocidad de fotogramas. </li><li> Utilice amsupresor ecánico para reducir la exposición al láser al tejido. Ajuste de la anchura de la supresor dependiendo de la amplitud de la escáner resonante Nota:. Debido a la naturaleza sinusoidal de la trayectoria de exploración de un escáner de resonancia, el haz de láser se mueve comparativamente lenta en los puntos de respuesta de exploración. Para prevenir el daño del tejido en estos puntos de entrega en donde la exposición al láser es más grande, un supresor de mecánica se introduce en el plano focal entre la exploración y lentes de tubo que detiene el haz de láser. </li><li> Para la adquisición de datos utilizar un digitalizador de alta velocidad (800 MHz) en combinación con un arreglo de compuertas programables en campo (FPGA) Nota:. Los filtros de paso alto FPGA y cubos de la señal de PMT en píxeles. La combinación del filtro de paso alto en el FPGA y el filtro de paso bajo eficaz en el resultado amplificador de PMT en un filtro de paso de banda de aproximadamente centrada alrededor de la frecuencia de repetición del láser (80 MHz). Código FPGA ejemplo se proporciona como un suplemento. </li></ol></li><li> Configuración de la rueda de ardilla hinchable basado en el diseño de Dombeck y colegas 2 <ol><li> Conectar el soporte de la bola a una línea de suministro de aire usando un tubo de suministro de aire de al menos 10 mm de diámetro interior. Maximizar la sección transversal de la entrada de suministro de aire soporte de bola y colocar amplia cantidad de tubo entre el suministro de aire principal y el soporte de la bola Nota:. Aumento de la sección transversal y el aumento de longitud de la tubería de suministro de aire reduce la generación de ruido. </li><li> Colocar una bola de espuma de poliestireno (20 cm de diámetro) en un soporte de bola de diseño personalizado e impreso-3D. </li><li> Si el paradigma de comportamiento requiere solamente hacia delante (o hacia atrás) la locomoción, restringir el movimiento de la bola para el eje horizontal (pitch) mediante la inserción de un pasador (por ejemplo, una aguja hipodérmica 19 G) en el lado de la bola Nota:. Normalmente los animales se adaptan a la configuración mucho más rápido en este paradigma de rotación reducida. </li><li> Seguir el movimiento de la pelota, usando uno o dos ratones de ordenador ópticopara detectar el movimiento en torno a dos o de los tres ejes, respectivamente Nota:. Los ratones de ordenador idealmente deben operar con un diodo de infrarrojos para la menor interferencia con la imagen. </li></ol></li><li> Configuración del entorno de realidad virtual <ol><li> Prepare el entorno de realidad virtual Nota:. Un entorno de ejemplo basado en Panda3D, un motor de juego de libre acceso, se proporciona como un suplemento. Los objetos del entorno virtual se generan utilizando Wings3D, un modelador 3D de código abierto. El programa de ejemplo lee la información de posición en una tarjeta de adquisición de datos y esto se traduce en movimiento en el entorno virtual. El código también realiza la transformación no lineal necesario para el medio ambiente que se proyecta sobre una pantalla toroidal. La construcción detallada de la pantalla toroidal se ha descrito en otra parte 14,17. </li><li> Utilice proyectores LED o pantallas de ordenador con retroiluminación LED para mostrar el entorno virtual. Integrar una cir gatingCUIT para el parpadeo rápido de los LEDs durante la exploración Nota:. Un problema inherente en dos fotones de imágenes durante la estimulación visual es fuga de luz procedente del sistema de estimulación visual, que puede reducirse mediante el blindaje del objetivo. Sin embargo, la fuga de luz del sistema de estimulación visual puede ser completamente abolida mediante la sincronización de la salida de luz del proyector a los puntos de entrega del escáner de resonancia (cuando los datos no son adquiridos), como se hace con arenas LED utilizados para la estimulación visual durante la exploración en 18 de Drosophila. Esto resulta en una alternancia de alta velocidad efectiva de estimulación visual y adquisición de datos (véase la Figura 2). La frecuencia de parpadeo (24 kHz) es órdenes de magnitud por encima del umbral de fusión de parpadeo, por encima del cual el parpadeo ya no se percibe por el animal. El diagrama del circuito electrónico de esta modificación a un proyector LED comercial se muestra en la Figura 3. </li></ol></li><li> Cachorroil seguimiento <ol><li> Utilice una cámara de vídeo basado en CMOS (30 fps) para el seguimiento de posición de la pupila. Asegúrese de que la cámara no contiene un filtro de bloqueo de infrarrojos Nota:. La pupila es visible en alto contraste durante las grabaciones debido a la luz difusa procedente del láser de excitación de dos fotones que sale a través del ojo. Posición de la pupila y el diámetro se extrae en tiempo real mediante un software personalizado programado basado en el diseño de Sakatani e Isa 19. </li></ol></li></ol> 2. La inyección de indicador de calcio Genética y Ventana de Implantes La inyección de un indicador de calcio 20 y la implantación de la ventana craneal 21 se realizó como se describió anteriormente con las siguientes adiciones: <ol><li> Inyectar el virus en la región de interés usando una pipeta de inyección de vidrio se rellenó con solución de virus y conectado a un sistema de inyección a presión. Ajustar la presión en función de la pipeta interna-de diámetro, típicamente aprox. 70-140 mbar, para inyectar aproximadamente 100 nl de solución de virus en el transcurso de 1-2 min. Pulsos de inyección de bajo volumen entregado a baja frecuencia (0,05 pulsos segundos a 2 Hz) deben ser utilizados con el fin de evitar el desbordamiento del virus a lo largo de la pipeta durante la inyección Nota:. Con el fin de controlar el volumen de inyección, la pipeta puede estar marcado en pequeña , longitudes iguales de tiempo (por ejemplo, 0,5 mm) bajo un microscopio estereoscópico. El desplazamiento del menisco entre las marcas puede ser utilizado para estimar el volumen inyectado. </li><li> Varias semanas después de la inyección de esto debería resultar en un bolo de células densamente marcados con un diámetro de aproximadamente 500 micras. La eficacia de expresión GECI en la región de interés depende de la elección de la combinación promotor GECI y, así como el título infeccioso y el serotipo de AAV recombinante utilizado Nota:. Como un ejemplo representativo, la inyección de AAV2/1-EF1α-GCaMP5 con una teta viraler de 8 x 10 12 GC / ml en la corteza visual primaria de un ratón produce la expresión satisfactoria en aproximadamente dos semanas después de la inyección (Figura 1). </li><li> La barra de la cabeza no debe obstruir el campo visual del ratón, pero debe ser lo suficientemente rígido para permitir la formación de imagen estable durante comportamiento. Esto normalmente requiere dos puntos de unión en ambos lados de la barra de la cabeza (ver Figura 1). Para sujetar firmemente la barra de la cabeza en el cráneo, asegúrese de maximizar y seque el área del cráneo expuesta donde se colocará la barra de cabeza. Además, el uso de un bisturí o una jeringa, rayar el cráneo para crear ranuras superficiales, aumentando así el área de superficie para el encolado. Cubrir el hueso con tejido adhesivo cianoacrilato antes de colocar la barra de la cabeza con cemento dental. </li></ol> 3. Procedimiento experimental <ol><li> Dos o tres semanas después de la inyección de virus, compruebe la ventana implante craneal para la claridad y la expresión bajo epiiluminación de fluorescencia. Límites claramente visibles y claramente definidas de los vasos sanguíneos superficiales son una buena indicación de que el implante ventana es adecuado para la formación de imágenes (véase la Figura 1). </li><li> Medir y ajustar la potencia del láser a un valor por debajo de 50 mW a la muestra. </li><li> Encienda el flujo de aire a la rueda de ardilla esférica. </li><li> Para fijar la cabeza bajo el microscopio, anestesiar brevemente el animal con isoflurano para reducir el estrés. Colocar el animal en un recipiente de anestesia con isoflurano y esperar hasta que las paradas de animales en movimiento (aproximadamente 10 segundos). Retire el animal e inmediatamente la cabeza fijarlo en el microscopio. </li><li> Coloque el sistema de presentación visual lo más cerca posible al animal a todavía permitir el acceso al animal. El contacto visual a menos que el animal tiene con el experimentador, menos estresado el animal será durante la fase inicial del experimento. </li><li> Asegúrese de que la ventana de implante craneal está libre de polvo y suciedad. Limpie con aguasi es necesario. </li><li> Aplicar gel de ultrasonido claro como medio de inmersión entre la ventana craneal y objetivo de inmersión en agua. Esto resuelve los problemas de degradación de la imagen lento debido a la evaporación de agua o fugas y elimina la necesidad de montar un cono en la barra de la cabeza para contener el agua Nota:. Centrífuga el gel antes de su uso para eliminar todas las burbujas de aire, y tener cuidado de no crear ningún aire burbujas durante la aplicación del gel. Las burbujas de aire pueden afectar seriamente la calidad de imagen. </li><li> Envuelva un pedazo de cinta negro alrededor de la barra de objetivo y la cabeza de protección de la luz. </li><li> Mueva el entorno de arena virtual a su posición final y ajustar la cámara de vídeo para el seguimiento de los alumnos. </li><li> Ajuste el supresor de láser para que coincida con la amplitud de exploración utilizado durante el experimento. </li><li> Inicie la grabación de datos. </li></ol>

<ol><li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).</li>
<li>Huber, D., Gutnisky, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., Chen, T. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Mittmann, W., Wallace, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).</li>
<li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li>
<li>Mank, M., Santos, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Margolis, D. J., Lütcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li>
<li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li>
<li>Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+Reality+for+Mice%2C+mousevr.blogspot.com%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li>
<li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li>
<li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2%2F3+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li>
<li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La clave para el éxito de comportamiento de formación de imágenes de dos fotones es la estabilidad de la preparación de dos maneras: <ol><li> En el transcurso de la implantación ventana días post, respuestas inflamatorias del tejido pueden conducir a la mejora de la formación de tejido de granulación y el cartílago que dificultar o incluso impedir formación de imágenes. </li><li> Durante el experimento, el cerebro tiene que ser lo suficientemente estable para evitar los artefactos de movimiento corrompa la señal de ...

Dos fotones de imágenes de los indicadores de calcio (genéticamente codificados como GCaMP5 7 o R-GECO 8, o colorantes sintéticos como OGB o Fluo4) ha emergido como un poderoso método para medir la actividad neuronal en ratones comportarse 1-6. Se permite la medición simultánea de la actividad de cientos de células en acción cerca de un solo potencial de resolución, de hasta aproximadamente 800 m por debajo de la superficie del cerebro 9,10. Por otra parte, el uso de indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis) la actividad neuronal se puede medir crónicamente 5,11,12, y en tipos de células genéticamente definidas 13. En conjunto, estos métodos proporcionan un grado de resolución temporal y espacial que abre una multitud de nuevas posibilidades en el estudio de la computación neuronal in vivo. La intervención quirúrgica es necesaria para exponer y etiquetar el cerebro de un ratón para la imagen. Las células se transfectaron usando típicamente un Vir adeno-asociado recombinante<html> nos sistema (AAV) para la entrega GECI y una ventana craneal se implanta en el sitio de la inyección para obtener acceso óptico al cerebro. Un bar de la cabeza se une entonces al cráneo para la fijación de la cabeza bajo el microscopio de dos fotones. El diseño y la implementación de estas medidas es fundamental ya que la mayoría de los problemas con las imágenes despierto surgen de la inestabilidad en la preparación. Idealmente, el procedimiento descrito aquí debe permitir para formación de imágenes crónica de hasta varios meses después de la cirugía. Para habilitar el comportamiento guiado visualmente durante dos fotones de imágenes, el ratón fijo cabeza se sienta en una cinta de correr esférica aire apoyado, que puede utilizar para navegar por un entorno de realidad virtual. Locomoción del ratón en la cinta se acopla al movimiento en el entorno virtual que se muestra en una pantalla toroidal que rodea el 14,15 ratón. Variables de comportamiento, tales como locomoción, el estímulo visual, y la posición de la pupila se pueden grabar 6. t &quot;&gt; Se describen los procedimientos involucrados en la crónica de dos fotones en ratones explorando un entorno de realidad virtual Los puntos clave abordados son:. reducción de artefactos de movimiento, la reducción de la fuga de luz, la maximización del número de células grabadas de forma simultánea, y la minimización de el daño por luz. También dio detalles sobre la configuración de la rueda de ardilla hinchable, el seguimiento de los alumnos, y el entorno de realidad virtual. Los procedimientos descritos aquí se pueden utilizar para obtener imágenes de las poblaciones de células marcadas con fluorescencia en ratones fijos en la cabeza en un potencialmente amplia variedad de paradigmas de comportamiento .

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos (diámetro = 3-5 mm)</td><td>Implante de ventana</td> <td>Menzel</td><td></td></tr><tr><td>InSight DeepSee láser</td><td>Microscopio</td><td>Spectra-Physics</td><td></td></tr><tr><td>12 kHz Escáner de resonancia</td><td>Cambridge Technology</td><td>G1-003-30026</td><td>Microscopio</td></tr><tr><td>Galvometer</td><td>Cambridge Technology</td><td>G6215H</td><td>Microscopio</td></tr><tr><td>Digitalizador</td><td>National Instruments</td><td>NI 5772</td><td>microscopio</td></tr><tr><td>FPGA</td><td>National Instruments</td><td>Microscopio</td><td>PXIe 7965R</td></tr><tr><td>Tarjeta de adquisición</td><td>Microscopio</td><td>PCIe 6363</td> de <td>National</td></tr><tr><td>Instruments Filtro de emisión 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td>Microscopio</td></tr><tr><td>piezoeléctrico z-drive</td><td>Physikinstrumente</td><td>P-726.1CD</td> Controlador de <td>microscopio</td></tr><tr><td>para piezoeléctrico accionamiento</td><td>Physikinstrumente</td><td>E665 Microscopio LVPZT</td><td></td></tr><tr><td>Objective 16X, 0.8NA</td><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>CFI75</td></tr><tr>Amplificador de corriente <td>Microscopio Femto</td><td>DHPCA-100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo fotomultiplicador</td><td>Microscopio</td><td>Hamamatsu</td><td></td></tr><tr><td>Cámara USB sin filtro IR</td><td>ImagenSource</td><td>DMK22BUC03</td><td>seguimiento de</td></tr> <tr><td>la pupilaObjetivo 50 mm</td><td>VisualizaciónSource</td><td>M5018-MP Seguimiento de</td><td>la pupila</td></tr><tr><td>Anillos adaptadores macro</td><td>ImagengSource</td><td>LAexSet</td><td>Seguimiento de la pupila</td></tr><tr><td>Ratón óptico de ordenador</td><td>Logitech</td><td>G500</td><td>Seguimiento de movimiento</td></tr><tr><td>Bola de espuma de poliestireno 20 cm</td><td>, p. ej. idee-shop.de</td><td>08797.00.15</td><td>entorno virtual</td></tr><tr><td>Proyector LED</td><td>Samsung</td><td>SP-F10M</td><td>virtual entorno</td></tr><tr><td>Tarjeta de adquisición</td><td>National Instruments</td><td>NI 6009</td><td>entorno virtual</td></tr><tr><td>Motor de juego</td><td></td> Panda3D<td><a href="http://www.panda3d.org/">www.panda3d.org</a></td><td>entorno virtual</td></tr><tr><td>Biblioteca Numpy para Python</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>entorno virtual</td></tr><tr><td>Scipy librería para Python</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>entorno virtual</td></tr><tr><td>Controlador NI-DAQmx</td><td>National Instruments</td><td><a href="http://www.ni.com/">www.ni.com</a></td><td>entorno virtual</td></tr><tr><td>Gel de ultrasonido</td><td>Dahlhausen</td><td>5701.0342.10</td><td>de imágenes</td></tr></tbody></table>

dos fotones de imágenes de calcio en ratones recorriendo un entorno de realidad virtual

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

En los últimos años, dos fotones de imágenes se ha convertido en una herramienta muy valiosa en la neurociencia, ya que permite la medición de crónica de la actividad de las células identificadas genéticamente durante comportamiento 1-6. Aquí se describen los métodos para llevar a cabo de dos fotones en la corteza del ratón mientras el animal se desplaza un entorno de realidad virtual. Nos centramos en los aspectos de los procedimientos experimentales que son clave para obtener imágenes en un animal se comporta en un entorno virtual muy iluminada. Los principales problemas que se presentan en este montaje experimental que aquí la dirección estamos: minimizando los artefactos de movimiento relacionadas con el cerebro, reduciendo al mínimo la fuga de luz del sistema de proyección de realidad virtual, y minimizando el daño tisular inducida por láser. También proporcionamos software muestra para controlar el entorno de realidad virtual y de hacer el seguimiento de los alumnos. Con estos procedimientos y recursos debería ser posible convertir un microscopio de dos fotones convencional para su uso en comportarse ratones.

La calidad de imagen en imágenes de calcio de dos fotones de las poblaciones de células marcadas con un GECI depende en gran medida de la calidad de la ventana de implante craneal. Dos semanas después de la inyección del virus de la ventana del cráneo deben ser inspeccionados para mayor claridad. No debe haber ningún tejido de granulación o recrecimiento del hueso visible (Figura 1A). Por otra parte, el patrón de los vasos sanguíneos superficiales debe permanecer sin cambios y los límites de la vasculat...

Aquí se describen los procedimientos experimentales que participan en dos fotones de imágenes de la corteza del ratón durante comportamiento en un entorno de realidad virtual.

Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

El objetivo general del siguiente experimento es realizar los aspectos clave de la obtención crónica de imágenes de dos fotones en ratones, explorando un entorno de realidad virtual. Esto se logra modificando un microscopio de dos fotones para obtener imágenes rápidas y estables en ratones que se comportan. A continuación, se instala una cinta de correr con soporte neumático capaz de realizar el seguimiento de la locomoción.A continuación, se prepara un entorno de realidad virtual que utiliza un proyector LED sincronizado con el microscopio con el fin de minimizar la fuga de luz. Como resultado, se obtienen grabaciones de imágenes buenas y estables debido a la reducción de los artefactos de movimiento, la reducción de la fuga de luz y la minimización del borde de daño fotográfico. Aunque este método se puede utilizar para medir la neuroactividad durante la navegación en un entorno de realidad virtual, también se puede adaptar fácilmente a una amplia variedad de paradigmas conductuales diferentes que requieren estimulación visual.Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y llevados a cabo de acuerdo con las directrices del departamento veterinario de la estación del Cantón de Basilia. Los dos microscopios de fotones utilizados en estos experimentos consisten en un cabezal de escaneo compuesto por un escáner resonante de ocho o 12 kilohercios y un galvanómetro estándar. Esto permite velocidades de fotogramas de 40 o 60 hercios a 750 veces 400 píxeles y reduce la distorsión de la imagen inducida por el movimiento cerebral, el fotoblanqueo y la fototoxicidad.Se utiliza un escalador paso Z piezoeléctrico de alta velocidad para adquirir secuencialmente imágenes intercaladas en el tiempo a múltiples profundidades. Se utiliza una suturadora mecánica para reducir la exposición del láser al tejido en los puntos de giro de la trayectoria de escaneo, la sucinta debe ser ajustable para establecer su ancho. Dependiendo de la amplitud del escáner resonante, conecte un tubo de suministro de aire con un diámetro interior de al menos 10 milímetros al soporte de bolas de la cinta de correr y coloque una cantidad BLE de tubos entre el suministro de aire principal y el soporte de bolas para reducir el ruido.Coloca una bola de espuma de poliestireno de 20 centímetros de diámetro en un portabolas diseñado a medida e impreso en 3D. Si el paradigma conductual solo requiere locomoción hacia adelante y hacia atrás, inserte un alfiler como una aguja hipodérmica de calibre 19 en el costado de la pelota. Para restringir el movimiento de la bola en el eje horizontal, use uno o dos ratones ópticos de computadora para rastrear el movimiento de la bola alrededor de dos o los tres ejes respectivamente.Para preparar el entorno de realidad virtual, utilice proyectores LED o pantallas de ordenador con retroiluminación LED para la visualización. Integre un circuito de compuerta para un parpadeo rápido de los LED durante la toma de imágenes. La frecuencia de parpadeo de 24 kilohercios es órdenes de magnitud por encima del umbral de fusión de parpadeo, por encima del cual el parpadeo ya no es percibido por el animal.Ajuste la frecuencia de parpadeo exacta y el ciclo de trabajo para sincronizar la salida de luz del proyector con los puntos de respuesta del escáner resonante para el seguimiento de la pupila, use una cámara de video basada en CMO. Asegúrese de que la cámara no contenga un filtro de bloqueo de infrarrojos. Aproximadamente dos o tres semanas después de inyectar el indicador genético de calcio e implantar una ventana craneal, utilice la iluminación de epifluorescencia para comprobar la claridad y la expresión del implante de ventana craneal.Claramente visible y nítidamente definido. Los límites de los vasos sanguíneos superficiales son una buena indicación de que el implante de ventana es adecuado para la obtención de imágenes uno o dos días después. Para llevar a cabo el experimento de dos fotones, mida y ajuste la potencia del láser a un valor inferior a 50 milivatios en la muestra.A continuación, encienda el flujo de aire a la cinta de correr esférica. A continuación, fije al animal en la cinta de correr esférica. Las primeras veces que el mouse está fijo en la cabeza.Este proceso se puede facilitar sedando brevemente al animal con iso flúor. Una vez que el animal se ha acostumbrado al procedimiento, el montaje se puede realizar normalmente sin sedación. Tenga en cuenta que es fundamental minimizar el estrés del animal durante este procedimiento.A continuación, coloque el sistema de visualización lo más cerca posible del animal para permitir el acceso al animal. Asegúrese de que el implante de ventana craneal esté libre de suciedad y límpielo con agua si es necesario, aplique gel de ultrasonido transparente como medio de inmersión entre la ventana craneal y el objetivo de inmersión en agua para proteger la luz. Envuelve un trozo de cinta adhesiva negra alrededor del objetivo y la barra principal.Mueva la arena del entorno virtual a su posición final y ajuste la cámara de video para el seguimiento de los alumnos. Finalmente, configure el supresor láser para que coincida con la amplitud de escaneo utilizada durante el experimento y comience a registrar datos cuando se completen los experimentos. Eutanasiar al animal de acuerdo con las pautas de su institución.La calidad de la imagen en las imágenes de calcio de dos fotones de las poblaciones celulares marcadas con un indicador genético de calcio depende en gran medida de la calidad del implante de la ventana craneal, como se demuestra aquí al verificar la claridad de la ventana craneal después de la inyección del virus, no debe haber tejido de granulación ni recrecimiento óseo visible. Además, el patrón de los vasos sanguíneos superficiales debe permanecer inalterado y los límites de la vasculatura deben estar claramente definidos. Al mismo tiempo, la BOI de las células marcadas debe ser claramente visible bajo un microscopio de epifluorescencia.Idealmente, la preparación es lo suficientemente estable como para que las distorsiones de las dos imágenes de fotones inducidas por la locomoción del ratón no sean visibles en la imagen después del registro de fotogramas. La fuga de luz del sistema de estimulación visual se puede eliminar por completo sincronizando correctamente la salida de luz del proyector con los puntos de giro del escáner de resonancia. Cuando no se adquieren datos, la frecuencia de parpadeo de la fuente de luz debe ser el doble de la frecuencia de escaneo.En este ejemplo, se eliminó el blanco para ilustrar el efecto de la fuga de luz que se muestra en los cuadros naranjas durante la estimulación visual. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar dos veces en la imagen, comportándose con ratones, navegando por un entorno de realidad virtual. Además de configurar los sistemas de imagen y realidad virtual como se describe aquí, la clave del éxito de estos experimentos es dominar la técnica de implante de ventana craneal.Un implante limpio es un requisito previo para obtener imágenes de alta calidad y grabaciones estables.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Para comprender la dinámica de la red de microcircuitos de la neocorteza, que es esencial para grabar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. En vivo de dos fotones de imágenes de calcio es el único método que permite grabar la actividad de una densa población neuronal con una sola célula de resolución.

En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

Fuente: Maruoka, H., et. al. Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos. J. Vis. Exp.  (2022) Este video muestra un procedimiento de microscopía de dos fotones para obtener imágenes de la actividad neuronal y la dinámica microglial en un ratón despierto durante la estimulación visual, destacando los transitorios de calcio y las interacciones celulares.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en un ratón despierto

Fuente: Lee, H. et. al., Imágenes exitosas de calcio in vivo con un microscopio miniaturizado de montaje en la cabeza en la amígdala de un ratón que se comporta libremente. J. Vis. Exp. (2020)Este video muestra imágenes de calcio in vivo en un ratón utilizando un índice de refracción de gradiente, o lente GRIN, y un microscopio miniaturizado. La configuración combina la fijación de la cabeza dentro de un sistema de jaula móvil sin fricción, estimulando las neuronas y desencadenando la entrada...

Imágenes microendoscópicas de calcio en tiempo real en un ratón que se mueve libremente

Fuente: Thapa, R., et. al., Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio en el cerebro profundo In Vivo.  J. Vis. Exp. (2021)El video muestra imágenes de calcio en tiempo real utilizando un miniscopio en un ratón transducido, correlacionando la actividad neuronal con el comportamiento.

Imágenes de calcio en tiempo real de la corteza prefrontal medial de un ratón utilizando un miniscopio

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

Presentamos un protocolo para exponer el médula oblonga del ratón adulto del lado ventral. Mediante el uso de una lente de índice de refracción de gradiente con un microscopio en miniatura, las imágenes de calcio se pueden utilizar para examinar la actividad de los somatas neuronales oliva inferiores in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

El miniscopio de imágenes de calcio in vivo es una técnica poderosa para estudiar la dinámica neuronal y los microcircuitos en ratones que se comportan libremente. Este protocolo describe la realización de cirugías cerebrales para lograr buenas imágenes de calcio in vivo utilizando un miniscopio.

Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

El presente protocolo describe la fabricación de una ventana craneal grande (6 x 3 mm2) utilizando envoltura de alimentos, silicona transparente y vidrio de cubierta. Esta ventana craneal permite experimentos in vivo de imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones en el mismo ratón.

In vivo Imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones de un ratón usando una ventana craneal grande

Aquí, presentamos una configuración simplificada de hardware y software de código abierto para investigar el aprendizaje espacial del mouse utilizando realidad virtual (VR). Este sistema muestra una pista lineal virtual a un ratón con cabeza restringida que se ejecuta en una rueda utilizando una red de microcontroladores y una computadora de placa única que ejecuta un paquete de software gráfico Python fácil de usar.

Un sistema de realidad virtual de código abierto para la medición del aprendizaje espacial en ratones con cabeza restringida

Este protocolo detalla el procedimiento para obtener imágenes de las respuestas de calcio en el colículo superior (SC) de ratones despiertos, incluida la obtención de imágenes de la actividad de una sola neurona con microscopía de dos fotones mientras se deja la corteza intacta en ratones de tipo salvaje, y la obtención de imágenes de todo el SC con microscopía de campo amplio en ratones mutantes de corteza parcial.

Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón

Aprende a realizar imagen de calcio con dos fotones en ratones que navegan entornos de realidad virtual. Este método reduce artefactos de movimiento y fugas de luz para obtener registros neuronales estables y de alta calidad.

Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual

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