Simultánea de dos fotones En Vivo Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

Todos los procedimientos experimentales que se describen a continuación fueron aprobados por el Comité de Ética Local del Instituto Nenscki de Biología Experimental de la Academia Polaca de Ciencias. Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de las neuronas en la corteza retroesplenial del ratón utilizando microscopía de dos fotones in vivo en esta línea transgénica de un G de pies. Este enfoque se combina con la inyección de mCherry que expresa el virus adenoasociado, AAV, en el hipocampo dorsal.

Combinadas, estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la dependencia experimentada, la plasticidad estructural en la corteza retroesplenial. En este trabajo, proponemos la implantación de la ventana craneal por encima de la corteza retroesplenial como una región no posiblemente de interés para la microscopía in vivo de dos fotones. Con el fin de visualizar los cambios morfológicos en las estructuras neuronales, utilizamos este 1/4 de ratones B con la expresión de la proteína GFP fluorescente en aproximadamente el 10 por ciento de las neuronas del cerebro.

Otra innovación que proponemos es la inyección de un AAV, expresión de una proteína fluorescente mCherry bajo un promotor neuronal específico en las estructuras más profundas del cerebro, como el hipocampo, con el fin de visualizar proyecciones de la estructura en la corteza retroesplenial. Esterilice todas las herramientas, recipientes de vidrio para líquidos e hisopos de algodón en el autoclave. Guantes prescindibles.

Limpie la mesa quirúrgica, el marco estereotáxico y toda el área circundante con etanol al 70%. Use una almohadilla quirúrgica estéril para crear un espacio estéril para todo el equipo esterilizado. Corta la espuma de gel en trozos pequeños y sumérgelos en solución salina estéril.

Coloque al animal en la cámara de inducción y ajuste el nivel de isoflurano al 5% y el flujo de oxígeno a dos litros por minuto. Este procedimiento debería durar unos tres minutos. Saque al animal de la cámara de inducción.

Use pellizcos en la cola o los dedos de los pies para asegurarse de que el animal esté completamente sedado. Con recortadoras precisas, afeita el vello desde la parte posterior de la cabeza, entre las orejas hasta los ojos. Coloque al animal en el marco estereotáctico y estabilice la cabeza con barras para los oídos.

Ajuste los niveles de anestesia a 1,5 a 2% de isoflurano y cero punto tres litros por minuto de oxígeno. Aplícate el ungüento para los ojos. Inyectar al animal por vía subcutánea tolfedina, cuatro miligramos por kilogramo, butomidor, dos miligramos por kilogramo, y Baytril, cinco miligramos por kilogramo para prevenir la inflamación, el dolor y la infección respectivamente.

Inyectar al animal por vía intramuscular dexametasona, cero coma dos miligramos por kilogramo, para prevenir la inflamación del cerebro. Limpie la piel con bastoncillos de algodón estériles con betadine seguido de etanol al 70%. Cambia los guantes y rocíalos con etanol al 70%.

Levante la piel con pinzas y, con unas microtijeras, incida la piel horizontalmente a lo largo de la base de la cabeza y luego oblicuamente hasta el punto frontal entre los ojos. Retire el colgajo de piel. Aplique el ungüento de lidocaína con un hisopo estéril en el periostio para prevenir el sangrado excesivo y el dolor.

Use hisopos de algodón estériles o bisturí para extraer el periostio. Seque el cráneo con hisopos estériles. Con una aguja estéril, aplique un pegamento denso de cianoacrilato en los bordes de la piel para inmovilizarlos y evitar un mayor contacto con el cemento dental.

Espera a que el pegamento se seque. Coloque un cubreobjetos estéril de tres milímetros sobre el cráneo en la parte anterior a la sutura lambdoidea. Centre el cubreobjetos en las coordenadas retroespleniales, anterior, bregma posterior menos dos punto ocho, bregma lateral medial cero.

Marque los bordes deslizantes de la cubierta rascando la superficie del cráneo con una aguja estéril. Vuelva a colocar el cubreobjetos en el recipiente estéril con etanol al 70%. Use un taladro dental de alta velocidad con fresa de diámetro pequeño para delinear un círculo de tres milímetros de diámetro.

Limpie el sitio de perforación del polvo óseo con hisopos estériles con punta salina. Use la espuma de gel y los hisopos para detener el sangrado ocasional y limpiar el hueso. Entre las perforaciones, compruebe el grosor del hueso con pinzas finas tocando suavemente el círculo óseo y comprobando su movilidad.

Hay que tener en cuenta que el hueso es más grueso en la zona de las suturas. Detenga la perforación cuando el círculo óseo sea móvil y solo quede una capa delgada de hueso en la circunferencia. Limpie el campo operativo de todo el polvo óseo restante con hisopos con punta salina.

Deje caer la solución salina estéril sobre el área de perforación, cubriendo el círculo perforado. Haga palanca cuidadosamente en el círculo óseo con una pinza fina y luego retire el hueso con suavidad pero con firmeza levantándolo hacia arriba. Tenga cuidado de no sesgar el círculo óseo mientras lo levanta para evitar posibles daños en la duramadre.

Aplique suavemente la espuma de gel empapada en solución salina estéril sobre la duramadre para ayudar a controlar el sangrado. Espere hasta que todo el sangrado se detenga por completo. Retire con cuidado la espuma de gel para no perturbar el proceso de coagulación.

Tenga en cuenta que el área de sutura está muy vascularizada, por lo que el sangrado en este punto puede resultar profundo. Es fundamental esperar el tiempo suficiente para que se detenga el sangrado. Conecte la bomba de infusión a la torre estereotáctica y conecte el controlador.

Inserte la aguja de calibre 35 en la jeringa de llenado. Enjuague la jeringa 10 veces con etanol para esterilizarla y 10 veces con solución salina estéril para eliminar los restos de etanol. Retire las burbujas de aire de la jeringa.

Inserte la jeringa en la bomba. Llene una sola dosis de preparación AV y manténgala en hielo. Llene la jeringa con solución antivirus.

Centre la aguja en el bregma y luego insértela suavemente en el hipocampo usando las siguientes coordenadas: Anterior, posterior menos dos, lateral medial más menos uno, ventral dorsal menos uno. Estas coordenadas se ubicarán cerca del borde del dominio craneal. Espere cinco minutos para que el tejido se estabilice.

Inyecte siete microlitros de solución AV a una velocidad de 50 nanolitros por minuto. Espere 10 minutos para que el virus se absorba por completo. Retire suavemente la aguja.

Seque con espuma de gel si se produce sangrado. Repita con el lado contralateral. Coloque el cubreobjetos seco estéril en la parte superior de la duramadre en el marco circular perforado.

Sostenga el cubreobjetos con los pérceps para aplanar suavemente la duramadre y acercar los bordes del cubreobjetos a la superficie del cráneo. Con una aguja estéril, aplique el pegamento denso de cianoacrilato en los bordes del cubreobjetos para adherirlos al cráneo. Espera a que el pegamento se seque.

Coloque una barra de fijación, una tuerca anton o un diseño hecho a medida en la parte delantera del cráneo. Tenga en cuenta que la barra de fijación debe colocarse en una posición que permita el posicionamiento horizontal de la ventana craneal durante la sesión de imágenes. Aplica el pegamento sobre los bordes de la barra.

Espera a que el pegamento se seque. Tenga en cuenta que la barra de fijación debe colocarse lo más lejos posible de la ventana. Si se coloca demasiado cerca de la ventana, la barra y el tornillo que la conecta con el soporte hecho a medida pueden representar un obstáculo para el objetivo durante el proceso de imagen.

Prepare el acrílico dental y aplíquelo sobre la superficie del cráneo alrededor del vidrio. Es útil formar una forma similar a un cráter alrededor de la ventana. Creará una cavidad para el agua que se aplicará más tarde para obtener imágenes con el objetivo de agua.

Cree una tapa con el acrílico dental, cubriendo el resto de la barra de fijación de los bordes de la piel del área operativa reforzando el cráter alrededor de la ventana craneal. Espera a que el cemento dental se endurezca. Retire al animal del marco estereotáctico y colóquelo en la cámara de recuperación.

Esperar a que el animal se recupere de la cirugía mientras se observan las funciones fisiológicas. Aplicar anestesia postoperatoria cyroproferrina, 10 miligramos por kilogramo, y antibióticos de tratamiento baytril, cinco miligramos por kilogramo, durante 48 horas. Encienda el láser de zafiro ti, encienda el microscopio.

El sistema utilizado en este experimento está equipado con un láser de dos fotones, un sistema OPO y PMT falsificado con arseniuro de galio dual. Coloque al animal en la cámara de inducción e induzca la anestesia. Retire al animal de la cámara de inducción y colóquelo en la máscara de anestesia gaseosa bajo el microscopio.

Disminuya el flujo de oxígeno a cero punto tres litros por minuto y la concentración de isoflurano a 1.52%Fije el animal al marco del microscopio personalizado con un tornillo MT u otro sistema personalizado. Nivele la ventana craneal. Tenga en cuenta que es posible utilizar el sistema de fijación de la cabeza del fabricante del microscopio, aunque el marco personalizado específico brinda mejores resultados, mejor estabilidad de la cabeza, posicionamiento constante en múltiples sesiones durante un experimento crónico.

Usando la configuración del microscopio de campo amplio, un objetivo de bajo aumento, centre la vista en uno de los lados de la corteza retroesplenial y enfóquela en la superficie del cubreobjetos. Aplica una gota de agua en el pozo acrílico en forma de cráter. Cambia a un objetivo de inmersión en agua de larga distancia.

Mueva el objetivo hacia la ventana craneal hasta que el menisco de agua conecte el espécimen y el objetivo. Cambie a la configuración de dos fotones y comience a escanear el espécimen de arriba a abajo con el zoom más bajo. El cruce de la duramadre será visible como deslumbramiento de una señal no específica alta.

Ajuste la configuración de adquisición del microscopio en ambos canales, GFP y mCherry de acuerdo con la intensidad de la señal de las celdas fluorescentes para cubrir todo el rango dinámico. Después de encontrar una neurona adecuada con el árbol dendrítico separado de otras células, realice un escaneo inicial utilizando solo filtros GFP configurados con el zoom más bajo y la distancia Z de cinco micras. Obtenga una proyección máxima de la pila de escaneo e imprímala para las anotaciones utilizando colores invertidos.

Establezca el zoom en un valor que permita obtener imágenes de los detalles morfológicos deseados. Visualice todo el árbol dendrítico en el canal GFP y mCherry utilizando la proyección máxima como guía. Usando este protocolo, será posible monitorear repetidamente las estructuras pre y post-sinápticas en la corteza retroesplenial.

Este enfoque podría utilizarse con un experimento crónico en el que se espera que las manipulaciones conductuales se correlacionen cuando se producen cambios en la morfología de las dendritas, las espinas sinápticas o los neutrones presinápticos. Las sesiones de imagen se pueden realizar con cualquier frecuencia, pero se prefiere un intervalo de tiempo de 24 horas para permitir una recuperación adecuada del animal y minimizar el efecto de la anestesia. Si se aplica correctamente, esta técnica permite realizar múltiples sesiones de imagen en el transcurso de varios meses.