Name: Simultánea de dos fotones En Vivo Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: Aprende a realizar craniotomía para imagen crónica de neuronas en la corteza retrosplenial de ratón mediante microscopía de dos fotones in vivo. Este método permite monitorear la plasticidad estructural dependiente de la experiencia a largo plazo.

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Los autores desean agradecer a M. Steczkowski para grabaciones de voz, M. Borczyk para dibujos, A. Trąbczyńska para la producción de virus, M. Ziókowska para el genotipado y A. Mirgos para obtener ayuda con la filmación. KR reconoce la especie de regalo del virus adeno-asociado recombinante (rAAV) que expresa la proteína fluorescente mCherry bajo el control del promotor de CaMK K. Deisseroth. Este proyecto se llevó a cabo en las instalaciones centrales del Laboratorio de Modelos Animales y Laboratorio de Estructura de los tejidos y la función del Centro de Neurobiología del Instituto Nencki de Biología Experimental, con el uso de la infraestructura de la CEPT financiado por la Unión Europea - Fondo Europeo de Desarrollo Regional dentro del Programa operativo &quot;economía innovadora&quot; para el período 2007-2013. Este trabajo fue apoyado por becas de Centro Nacional de Ciencia: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 a KR y Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 a RC

Todos los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Comité Ético local en el Instituto Nencki of Experimental Biology, Academia de Ciencias de Polonia. Nota: Algunas de las escenas en el vídeo asociado se aceleran. Factor de velocidad se indica en estas escenas. 1. Preparación para la Cirugía <ol><li> Esterilizar todas las herramientas, envases de vidrio para líquidos y bastoncillos de algodón en el autoclave. Use guantes prescindibles. Limpiar la mesa de operaciones, el marco estereotáxico y todo lo que le rodea con etanol al 70%. Use una almohadilla quirúrgico estéril para crear un espacio estéril para todo el equipo esterilizado. Cortar espuma de gel en trozos pequeños y remojar en solución salina estéril. Nota: De acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, el etanol es un esterilizante ni un desinfectante de alto nivel. Sólo se debe utilizar como un agente de limpieza / desengrasado de superficies previamente esterilizados. </li><li> Poner el animal en THcámara de inducción de correo y establecer el nivel de isoflurano al 5% y el flujo de oxígeno a 2 l / min. Este procedimiento debe tomar alrededor de 3 min. </li><li> Llevar al animal fuera de la cámara de inducción. Utilice la cola o del dedo del pie aprieta con el fin de asegurar que el animal está completamente sedado. </li><li> El uso de un condensador de ajuste preciso afeitar el pelo de la parte posterior de la cabeza (entre las orejas) hasta los ojos. </li><li> Colocar el animal en el marco estereotáxico y estabilizar la cabeza con barras de oído. </li><li> Establecer niveles de anestesia con isoflurano al 1,5-2% y 0,3 L / min de oxígeno. </li><li> Aplicar el ungüento oftálmico. </li><li> Inyectar la vía subcutánea animal con Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) y Baytril (5 mg / kg) para prevenir la inflamación, el dolor y la infección, respectivamente. </li><li> Inyectar la vía intramuscular animal con dexametasona (0,2 mg / kg) para evitar la hinchazón del cerebro. Nota: Es posible inyectar por vía subcutánea o intraperitoneal dexametasona para prevenir el daño muscular. </li><li> Limpiar la piel con shisopos de algodón terile con Betadine seguidos por 70% de etanol. </li><li> Cambiar los guantes y rociarlas con un 70% de etanol. Nota: Durante el uso de guantes desechables no toque el campo estéril. Toca el único animal con la punta de los instrumentos quirúrgicos estériles e hisopos estériles. </li></ol> 2. Cirugía ventana del cráneo <ol><li> Levantar la piel con pinzas y el uso de tijeras micro incise la piel horizontalmente a lo largo de la base de la cabeza y luego oblicuamente hasta el punto de frente entre los ojos. Retire la tapa de piel. </li><li> Aplique un ungüento de lidocaína con un hisopo estéril en el periostio para evitar el sangrado y el dolor excesivo. </li><li> Use hisopos de algodón estériles o un escalpelo para retirar el periostio. Se seca el cráneo con hisopos estériles. </li><li> El uso de una aguja estéril se aplica densa pegamento de cianoacrilato sobre los bordes de la piel para inmovilizarlos y para evitar el contacto con cemento dental. Espere a que el pegamento se seque. </li><li> Coloque un 3 mm cubreobjetos estéril sobre tque el cráneo anterior a esta sutura. Centre el cubreobjetos en RSC coordenadas: AP, bregma -2,8; ML, bregma 0. Marque los bordes cubreobjetos por el rascado la superficie del cráneo con una aguja estéril. Poner el cubre de nuevo en el recipiente estéril con un 70% de etanol. </li><li> Use un taladro dental de alta velocidad con rebabas de pequeño diámetro para delinear un círculo de 3 mm de diámetro. Limpiar el sitio de perforación del polvo de hueso con hisopos de cruce de solución salina estéril. Utilice la espuma de gel y de hisopos para detener el sangrado ocasional y limpiar el hueso. </li><li> En el medio de perforación comprobar el espesor del hueso con unas pinzas finas tocando con suavidad el círculo de hueso y la comprobación de su movilidad. Tenga en cuenta que el hueso es más gruesa en el área de la sutura. Detener la perforación cuando el círculo de hueso es móvil y sólo un par, capa delgada de hueso se deja en la circunferencia. Limpiar el campo operacional de todo el polvo de hueso restante con hisopos salinas de cruce. </li><li> La caída de la solución salina estéril en el área de perforación, que cubre el CIR perforadoCLE. saque con cuidado el círculo hueso con unas pinzas finas y luego suavemente pero con firmeza quitar el hueso levantándolo hacia arriba. Tenga cuidado de no sesgar el círculo de hueso mientras se levanta para evitar posibles daños a la dura. </li><li> Aplique suavemente la espuma de gel empapada en solución salina estéril sobre la duramadre para ayudar a detener el sangrado. Espere hasta que todo el sangrado se detiene por completo. Retirar con cuidado la espuma de gel de no perturbar el proceso de coagulación. Nota: El área de sutura es muy vascularizada, por lo que el sangrado en este punto podría ser profundos. Es esencial que esperar el tiempo suficiente para que el sangrado se detenga completamente. Es útil para mantener la espuma de gel empapada en solución salina enfriada colocándola en hielo. </li></ol> 3. Inyección de virus <ol><li> Coloque la bomba de infusión a la torre estereotáctica y conectar el controlador. </li><li> Insertar la aguja 35G en la jeringa. Enjuague la jeringa 10 veces con etanol para esterilizarla y 10 veces con solución salina estéril para eliminar los restos de correoTHANOL. Eliminar las burbujas de aire de la jeringa. Inserte la jeringa en la bomba. Nota: Considere el uso de otros desinfectantes. </li><li> Descongelar una dosis única de rAAV2 / 1 mCherry preparación (se recomienda 10 12 pfu) y mantenerlo en hielo. Llene la jeringa con la solución de virus. </li><li> Centrar la aguja en el bregma y luego insertar suavemente en el hipocampo utilizando las siguientes coordenadas: AP-2, ML +/- 1,0, -1 DV. Estas coordenadas se encuentran cerca del borde de la craneotomía. Esperar durante 5 minutos para que el tejido se estabilice. </li><li> Inyectar 0,7 l de la solución rAAV2 / 1 mCherry a razón de 50 nl / min. Esperar 10 min para que el virus se adsorbe completamente. Retire con cuidado la aguja. Seque con espuma de gel si se presenta sangrado. Repita con el sitio contralateral. </li></ol> 4. craneal ventana de implantación <ol><li> Coloque el cubreobjetos estéril, seca en la parte superior de la duramadre en el marco del círculo perforado. Mantenga el cubreobjetos con el forceps para aplanar suavemente la duramadre y llevar cubreobjetos &#39;bordes más cerca de la superficie del cráneo. Nota: Es posible que el cubreobjetos interrumpe el coágulo y se restablece el sangrado. Si ese es el caso, levantar el cubre objetos, colocarlo en el alcohol, secar y volver al paso 2.9. </li><li> Usando una aguja estéril aplicar el pegamento de cianoacrilato densa en los bordes de recubrimientos de vidrio para la fijación a la calavera. Espere a que el pegamento se seque. </li><li> Coloque una barra de fijación (tuerca M2 o un diseño hecho a medida) en la parte frontal del cráneo. Aplique el pegamento de cianoacrilato sobre los bordes de la barra. Espere a que el pegamento se seque. <ol><li> Colocar el gancho de fijación en una posición que permita el posicionamiento horizontal de la ventana del cráneo durante el diagnóstico por sesión. Colocarlo tan distantes como sea posible de la ventana. Si se coloca demasiado cerca de la ventana, la barra y el tornillo de conexión con el titular de la medida pueden suponer un obstáculo para el objetivo durante el proceso de formación de imágenes. </li></ol></li><li&gt; preparar el acrílico dental y aplicarlo sobre la superficie del cráneo alrededor del vaso. Es útil para formar una forma de cráter alrededor de la ventana. Se va a crear una cavidad para agua aplicada posteriormente para obtener imágenes con el objetivo de agua. </li><li> Crear un casquillo con el acrílico dental, que cubre el resto de la zona operativa, bordes de la piel, bar fijación, reforzando el cráter alrededor de la ventana craneal. Espere a que el cemento dental se endurezca. </li><li> Retire el animal del marco estereotáxico y ponerlo en la cámara de recuperación. </li><li> Espere a que el animal se recupere de la cirugía, mientras que la observación de las funciones fisiológicas. </li><li> Aplicar analgesia postoperatoria (carprofeno, 10 mg / kg) y el tratamiento de antibióticos (Baytril, 5 mg / kg) durante 48 horas. </li></ol> 5. Imaging <ol><li> Iniciar el Ti: Zafiro láser, encienda el microscopio. El sistema usado en este experimento está equipado con un láser de dos fotones, sistema OPO y PMT dual GaAsP. </li><li> El sacrificio del animal en el Inducy cámara de inducir la anestesia. </li><li> Retire el animal de la cámara de inducción y el lugar de la máscara de anestesia de gas bajo el microscopio. Disminuir el flujo de oxígeno a 0,3 L / min y la concentración de isoflurano al 1,5-2%. </li><li> Fijar el animal al pie del microscopio personalizado con un tornillo M2 (u otro sistema de medida). Nivelar la ventana del cráneo. Nota: Es posible utilizar el sistema de fijación de la cabeza del fabricante microscopio, aunque la trama personalizada específica da mejores resultados (mejora de la estabilidad de la cabeza, posicionamiento constante en varias sesiones durante un experimento crónica). </li><li> El uso de los ajustes del microscopio de campo amplio y un centro de objetivo de baja magnificación de la vista en uno de los lados de la corteza retroesplenial y enfocarla en la superficie cubreobjetos. </li><li> Aplicar una gota de agua en el pozo de acrílico en forma de cráter. Cambiar a un objetivo de inmersión en agua a larga distancia. Mover el objetivo hacia la ventana del cráneo hasta que el menisco con aguanecta la muestra y objetiva. </li><li> Cambiar a la configuración de dos fotones y comenzar a escanear la parte superior a la inferior muestra el uso del zoom más bajo. El cruce de la duramadre será visible como un reflejo de la señal no específica alta. </li><li> Ajuste la configuración de adquisición de microscopio en ambos canales (GFP y mCherry) de acuerdo con la intensidad de señal de las células fluorescentes con el fin de cubrir todo el rango dinámico. </li><li> Después de encontrar una neurona adecuada (con el árbol dendrítico separado de otras células) realizar una exploración inicial usando sólo el filterset GFP con zoom más baja y la distancia z de 5 micras. </li><li> Obtener una proyección máxima de la pila de escaneado e imprimirlo para las anotaciones (utilizando colores invertidos). </li><li> Ajuste el zoom a un valor que permita a la imagen de los detalles morfológicos deseados. Imagen entera del árbol dendrítico en los canales de GFP y mCherry utilizando máxima proyección como guía. </li></ol>

<ol><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li>
<li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li>
<li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li>
</ol>

Los autores (KL, MR, KR) tienen derechos de patente pendientes (PL410001) para el marco Holder utilizada en este artículo.

En el presente trabajo se presenta un protocolo para la utilización simultánea de dos fotones de imágenes in vivo de las entradas sinápticas y las metas post-sinápticas en RSC a través de una ventana del cráneo. El procedimiento de implantación consiste en varios pasos clave. En primer lugar, el animal se anestesió profundamente y se fija en el marco estereotáctico, entonces el cráneo sobre RSC se adelgaza con un taladro a lo largo de las líneas circulares marcados y se retira el hueso circular. Despué...

microscopía de dos fotones revolucionó la observación de la actividad cerebral en vivir y comportarse animales. Desde su introducción en 1990, rápidamente ganó popularidad y ahora se implementa como uno de los enfoques más interesantes e innovadores en el examen de numerosos aspectos de la actividad cerebral in vivo 1,2. Estas aplicaciones incluyen las mediciones de flujo de sangre, la activación neuronal (por ejemplo, utilizando indicadores de nivel de calcio o genes tempranos inmediatos de expresión) y la morfología de las células neuronales. Un número creciente de laboratorios utilizan microscopios de dos fotones, la aplicación de la técnica en todo el mundo científico como un nuevo estándar para las imágenes del cerebro in vivo. El método estándar consiste en la implantación de la ventana del cráneo (un agujero redondo en el cráneo cubierto con una tapa de vidrio) sobre el barril o la corteza visual del cerebro del ratón 3. A continuación, dependiendo del protocolo experimental, el mouse somete a una serie de visualización y las sesiones de entrenamiento de comportamiento, lo que permite controlar los cambios en la actividad cerebral y la morfología neuronal en el tiempo 4,5. En ambos casos la craneotomía sólo afecta el hueso parietal, sin cruzar las suturas. Se cree ampliamente que el principal inconveniente de la técnica es su limitada aplicación a cortezas fácilmente accesibles, tales como el barril o de la corteza visual. La implantación de la ventana del cráneo sobre otras regiones plantea muchas dificultades, debido a un sangrado excesivo y / u obstáculo espacial. En este artículo se propone la implantación de la ventana del cráneo por encima de la corteza retroesplenial (RSC) como otra posible zona de interés para los dos fotones en la microscopía in vivo 6. RSC es un elemento importante del circuito cerebral responsable de la formación de la memoria espacial. Anatómicamente, RSC es una parte de una red neuronal de conexión cortical, del hipocampo, y las regiones talámicas 7. Esmuy involucrado en una serie de comportamientos, tales como el aprendizaje espacial y la extinción, así como la navegación espacial 6. Con el fin de visualizar los cambios morfológicos de las neuronas que utilizamos una línea de ratón transgénico que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el promotor thy1. En estos ratones, GFP se expresa en aproximadamente el 10% de las neuronas en el cerebro que permiten una visualización clara de los axones y dendritas corticales utilizando microscopía de dos fotones 8. Otra innovación que proponemos es la inyección de un serotipo recombinante adeno-asociado virus 2/1 (rAAV2 / 1) que codifica una proteína fluorescente de color rojo (mCherry) bajo un promotor específico de neuronas CaMKII 9 en las estructuras más profundas del cerebro que se proyectan hacia RSC , tales como el hipocampo. La expresión de rAAV2 / 1 mCherry en el hipocampo de ratón Thy1-GFP permite la visualización simultánea de elementos pre y postsinápticos del Hippocampo-Cortical 10 sinapsis. La expresión impulsada por el rAAV de mCherry requiere dos a tres semanas para la proteína para alcanzar el nivel suficiente en los terminales axonales. Este período es consistente con el tiempo usual requerido para la recuperación de la craneotomía.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Fármaco</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2% preoperatorio</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1,5-2% durante la cirugía</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Scan Vet</td><td>Dexasone 2mg/ml</td><td>0,2 mg/kg</td></tr><tr><td>intramuscular Baytril</td><td>Bayer</td><td>2,50%</td><td>5 mg/kg por vía subcutánea</td></tr><tr><td>Tolfedina</td><td>Vetoquinol</td><td>4%</td><td>4 mg/kg por vía subcutánea</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td><td>2 mg/kg por vía subcutánea</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50mg/ml</td><td>10 mg/kg por vía subcutánea</td></tr><tr><td>Lidocaína</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td><td>por vía tópica</td></tr><tr><td>Lidocaína</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td>por vía tópica</td></tr><tr><td>Surgery</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan dental; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para los ojos</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>pegamento tópico</td></tr><tr><td>CA</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste Acrílico</td><td></td></tr><tr><td>dental</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáxico</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Harvard Aparato</td><td>HSE-64-0720</td> 3 <td>mm de diámetro</td></tr><tr><td>Taladro dental</td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Barra de fijación</td> N/A hecho <td>a medida</td> Se <td>pueden utilizar tuercas de tornillo N/A M2 o M3</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Micro tijeras</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Holder frame</td><td>Hecho a medida</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de dos fotones</td><td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Unidad láser: Camaleón coherente 690-1040nm con oscilador óptico paramétrico 1050-1300nm. Objetivos: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 y LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detección: Filtros de paso de banda Zeiss BP 500-550 (GFP) y BP 570-610 (mCherry) separados por un divisor de haz a 560 nm y acoplados a dos fotodetectores de GaAsP.</td></tr><tr><td><reactivo fuerte>< reactivo/></td><td></td><td></td><td></td></tr> regalo <tr><td></td><td>K. Deisseroth</td><td></td><td>Virus adenoasociado recombinante (rAAV) que expresa la proteína fluorescente mCherry bajo el control del promotor CaMK</td></tr></tbody></table>

simultánea de dos fotones<em&gt; en vivo</em&gt; imágenes de entradas sinápticas y objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de las neuronas en la corteza retroesplenial (RSC) del ratón utilizando microscopía de dos fotones in vivo en la línea de ratones transgénicos Thy1-GFP. Este enfoque crea la posibilidad de investigar la correlación de las manipulaciones conductuales con los cambios en la morfología neuronal in vivo.
Se consideró que el procedimiento de implantación de la ventana craneal se limitaba solo a las regiones de la corteza de fácil acceso, como el campo de barril. Nuestro enfoque permite la visualización de neuronas en el RSC altamente vascularizado. RSC es un elemento importante del circuito cerebral responsable de la memoria espacial, que anteriormente se consideraba problemático para la obtención de imágenes in vivo de dos fotones.
La implantación de la ventana craneal sobre el RSC se combina con una inyección de virus adenoasociado recombinante que expresa mCherry (rAAVmCherry) en el hipocampo dorsal. La mCherry expresada se extiende a proyecciones axonales desde el hipocampo hasta RSC, lo que permite la visualización de cambios tanto en los botones axonales presinápticos como en las espinas dendríticas postsinápticas en la corteza. 
Esta técnica permite el monitoreo a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

La expresión de GFP en un subconjunto de neuronas en el ratón reportero Thy1-GFP permite imágenes in vivo de las dendritas corticales y proyecciones axonales locales en RSC. La Figura 1A muestra la máxima proyección de una pila de imágenes con múltiples dendritas GFP-positivas visibles. El cuerpo de la célula es oscurecida por una arteria. La Figura 1B muestra una imagen ampliada de un solo plano (zoom digital 3x) de la rama dendrítica se indica...

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Todos los procedimientos experimentales descritos a continuación fueron aprobados por el Comité Ético Local del Instituto Nencki de Biología Experimental, Academia Polaca de Ciencias. Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite la obtención de imágenes crónicas de neuronas en la corteza retrosplenial de ratones mediante microscopía de dos fotones in vivo en la línea transgénica thi one-G de feet. Este enfoque se combina con la inyección de virus asociado a adenovirus que expresa mCherry, AAV, en el hipocampo dorsal.Combinadas, estas técnicas permiten el monitoreo a largo plazo de la dependencia experimentada y la plasticidad estructural en la corteza retrosplenial. En este artículo, proponemos la implantación de una ventana craneal sobre la corteza retrosplenial como una región de interés viable para la microscopía in vivo de dos fotones. Con el fin de visualizar los cambios morfológicos en las estructuras neuronales, utilizamos ratones de la línea B uno-G de T con expresión del proteína fluorescente GFP en aproximadamente el 10 por ciento de las neuronas en el cerebro.Otra innovación que proponemos es la inyección de un AAV, expresión de una proteína fluorescente mCherry bajo un promotor específico de neuronas en estructuras más profundas del cerebro, como el hipocampo, con el fin de visualizar las proyecciones de la estructura hacia la corteza retrosplenial. Esterilice todas las herramientas, los recipientes de vidrio para líquidos y los bastoncillos de algodón en el autoclave. Usted guantes desechables.Limpie la mesa quirúrgica, el marco estereotáctico y toda el área circundante con etanol al 70%. Utilice una almohadilla quirúrgica estéril para crear un espacio estéril para todo el equipo esterilizado. Corte la espuma de gel en trozos pequeños y sumérjalos en solución salina estéril.Coloque el animal en la cámara de inducción y ajuste el nivel de isoflurano al 5% y el flujo de oxígeno a dos litros por minuto. Este procedimiento debe durar aproximadamente tres minutos. Saque el animal de la cámara de inducción.Utilice pellizcos en la cola o en los dedos del pie para asegurarse de que el animal esté completamente sedado. Con tijeras precisas, afeite el pelo de la parte posterior de la cabeza, entre las orejas y hasta los ojos. Coloque al animal en el marco estereotáctico y estabilice la cabeza con barras para las orejas.Ajuste los niveles de anestesia a 1,5-2 % de isoflurano y 0,3 litros por minuto de oxígeno. Aplique la pomada oftálmica. Inyecte al animal por vía subcutánea tolfedina, cuatro miligramos por kilogramo; butomidoro, dos miligramos por kilogramo; y Baytril, cinco miligramos por kilogramo para prevenir inflamación, dolor e infección, respectivamente.Administre al animal dexametasona por vía intramuscular, cero punto dos miligramos por kilogramo, para prevenir la hinchazón cerebral. Limpie la piel utilizando hisopos estériles con betadina seguidos de etanol al 70%. Cambie los guantes y rocíe con etanol al 70%.Levante la piel con pinzas y, utilizando tijeras microquirúrgicas, haga un corte horizontal en la piel a lo largo de la base de la cabeza y luego en diagonal hasta el punto frontal entre los ojos. Retire el colgajo de piel. Aplique pomada de lidocaína con un hisopo estéril sobre el periostio para prevenir sangrado excesivo y dolor.Utilice hisopos de algodón estériles o un escalpelo para eliminar el periostio. Seque el cráneo con hisopos estériles. Con una aguja estéril, aplique pegamento denso de cianoacrilato sobre los bordes de la piel para inmovilizarlos y evitar cualquier contacto adicional con el cemento dental.Espere a que el pegamento se seque. Coloque un cubreobjetos estéril de tres milímetros sobre el cráneo anteriormente a la sutura lambdoidea. Centre el cubreobjetos en las coordenadas retrosplénicas, anterior-posterior bregma menos dos punto ocho, medial-lateral bregma cero.Marque los bordes del cubreobjetos rayando la superficie del cráneo con una aguja estéril. Coloque nuevamente el cubreobjetos en el recipiente estéril con etanol al 70%. Utilice un taladro dental de alta velocidad con una fresa de pequeño diámetro para trazar un círculo de tres milímetros de diámetro.Limpie el sitio de perforación del polvo óseo con torundas estériles humedecidas en solución salina. Utilice espuma de gel y torundas para detener cualquier sangrado y limpiar el hueso. Entre cada perforación, verifique el grosor del hueso con pinzas finas tocando suavemente el círculo óseo y comprobando su movilidad.Teniendo en cuenta que el hueso es más grueso en el área de las suturas. Detenga la perforación cuando el círculo óseo esté móvil y solo quede una capa delgada y uniforme de hueso en la circunferencia. Limpie el campo operatorio de todo el polvo óseo residual con torundas impregnadas en solución salina.Coloque la solución salina estéril sobre el área de perforación, cubriendo el círculo perforado. Levante cuidadosamente el círculo óseo con una pinza fina y luego extráigalo suavemente pero firmemente elevándolo hacia arriba. Tenga cuidado de no torcer el círculo óseo al levantarlo para evitar posibles daños en la duramadre.Aplique suavemente la espuma de gel empapada en solución salina estéril sobre la dura para ayudar a detener la hemorragia. Espere hasta que la hemorragia haya cesado por completo. Retire cuidadosamente la espuma de gel para no alterar el proceso de coagulación.Tenga en cuenta que el área de sutura está altamente vascularizada, por lo que el sangrado en este punto podría ser abundante. Es fundamental esperar un tiempo suficiente para que el sangrado se detenga. Conecte la bomba de infusión a la torre estereotáxica y conecte el controlador.Introduzca la aguja de calibre 35 en la jeringa de llenado. Lave la jeringa 10 veces con etanol para esterilizarla y 10 veces con solución salina estéril para eliminar los rastros de etanol. Elimine las burbujas de aire de la jeringa.Introduzca la jeringa en la bomba. Prepare una dosis individual de la preparación de AV y manténgala en hielo. Llene la jeringa con la solución de virus.Centre la aguja en el bregma y luego insértela suavemente en el hipocampo utilizando las siguientes coordenadas: anterior, posterior menos dos, medial lateral más menos uno, dorsal ventral menos uno. Estas coordenadas se ubicarán cerca del borde del dominio craneal. Espere cinco minutos para que el tejido se estabilice.Inyecte cero punto siete microlitros de solución AV a una velocidad de 50 nanolitros por minuto. Espere 10 minutos para que el virus se absorba completamente. Retire suavemente la aguja.Presione con espuma de gel si se produce sangrado. Repita el procedimiento en el lado contralateral. Coloque el cubreobjetos estéril y seco sobre la duramadre dentro del marco circular perforado.Sostenga el cubreobjetos con la pinza para aplanar suavemente la duramadre y acercar los bordes del cubreobjetos a la superficie del cráneo. Utilizando una aguja estéril, aplique el pegamento denso de cianoacrilato sobre los bordes del cubreobjetos para fijarlos al cráneo. Espere a que el pegamento se seque.Coloque una barra de fijación, una tuerca Anton o un diseño personalizado en la parte frontal del cráneo. Tenga en cuenta que la barra de fijación debe colocarse en una posición que permita la colocación horizontal de la ventana craneal durante la sesión de imagen. Aplique el pegamento sobre los bordes de la barra.Espere a que el pegamento se seque. Tenga en cuenta que la barra de fijación debe colocarse lo más alejada posible de la ventana. Si se coloca demasiado cerca de la ventana, la barra y el tornillo que la conecta con el soporte hecho a medida podrían convertirse en un obstáculo para el objetivo durante el proceso de obtención de imágenes.Prepare el acrílico dental y aplíquelo sobre la superficie del cráneo alrededor del vidrio. Es útil formar una forma similar a un cráter alrededor de la ventana. Esto creará una cavidad para el agua que se aplicará posteriormente durante la imagenología con el objetivo de inmersión en agua.Cree un casquete con acrílico dental, cubriendo el resto de los bordes de la piel del área operatoria y la barra de fijación, reforzando así el cráter alrededor de la ventana craneal. Espere a que el cemento dental se endurezca. Retire al animal del marco estereotáxico y colóquelo en la cámara de recuperación.Esperar a que el animal se recupere de la cirugía mientras se observan las funciones fisiológicas. Aplicar anestesia posoperatoria cyroproferrin, 10 miligramos por kilogramo, y tratamiento antibiótico baytril, cinco miligramos por kilogramo, durante 48 horas. Encender el láser de ti sapphire, encender el microscopio.El sistema utilizado en este experimento está equipado con un láser de dos fotones, un sistema OPO y un PMT de arseniuro de galio doble falsificado. Coloque el animal en la cámara de inducción e induzca la anestesia. Retire el animal de la cámara de inducción y colóquelo en la máscara de anestesia gaseosa bajo el microscopio.Disminuya el flujo de oxígeno a cero punto tres litros por minuto y la concentración de isoflurano a 1,52 %. Fije el animal al soporte personalizado del microscopio con un tornillo MT o otro sistema personalizado. Nivele la ventana craneal. Tenga en cuenta que es posible utilizar el sistema de fijación de cabeza del fabricante del microscopio, aunque el soporte personalizado específico ofrece mejores resultados, una mayor estabilidad de la cabeza y una posición constante en múltiples sesiones durante un experimento crónico.Utilizando la configuración del microscopio de campo amplio y un objetivo de baja magnificación, centre la vista en uno de los lados de la corteza retrosplenial y enfoque sobre la superficie del cubreobjetos. Aplique una gota de agua en el pozo acrílico con forma de cráter. Cambie a un objetivo de inmersión en agua de larga distancia.Mueva el objetivo hacia la ventana craneal hasta que el menisco de agua conecte la muestra y el objetivo. Cambie a la configuración de dos fotones e inicie el escaneo de la muestra de arriba hacia abajo utilizando el zoom más bajo. El cruce de la duramadre será visible como un resplandor de señal no específica alta.Ajuste la configuración de adquisición del microscopio en ambos canales, GFP y mCherry, según la intensidad de la señal procedente de las células fluorescentes para cubrir todo el rango dinámico. Tras localizar una neurona adecuada con el árbol dendrítico separado de otras células, realice un escaneo inicial utilizando únicamente filtros GFP con el zoom más bajo y una distancia Z de cinco micrones. Obtenga una proyección máxima del conjunto de escaneo e imprímala para realizar anotaciones utilizando colores invertidos.Configure el zoom a un valor que permita obtener imágenes de los detalles morfológicos deseados. Imagen del árbol dendrítico completo en los canales GFP y mCherry utilizando la proyección máxima como guía. Mediante este protocolo, será posible monitorear repetidamente tanto las estructuras pre como post-sinápticas en la corteza retrosplénica.Este enfoque podría utilizarse en un experimento crónico en el que se esperan correlaciones entre manipulaciones conductuales y cambios en la morfología de las dendritas, espinas sinápticas o neuronas pre-sinápticas. Las sesiones de imagen pueden realizarse con cualquier frecuencia, pero se prefiere un intervalo de 24 horas para permitir una recuperación adecuada del animal y minimizar el efecto de la anestesia. Si se aplica correctamente, esta técnica permite realizar múltiples sesiones de imagen durante varios meses.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2021).Este video muestra una técnica para obtener imágenes de la retina in vivo utilizando microscopía de dos fotones. Los ratones anestesiados se preparan para la obtención de imágenes asegurando sus cabezas, aplicando lubricante ocular y colocando un cubreobjetos sobre el ojo. Las células ganglionares de la retina (CGR) que expresan proteínas fluorescentes se visualizan primero mediante...

Imágenes in vivo de dos fotones de la retina del ratón

Fuente: Maruoka, H., et. al. Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos. J. Vis. Exp.  (2022) Este video muestra un procedimiento de microscopía de dos fotones para obtener imágenes de la actividad neuronal y la dinámica microglial en un ratón despierto durante la estimulación visual, destacando los transitorios de calcio y las interacciones celulares.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en un ratón despierto

Fuente: Kamei, R., et. al., Imágenes crónicas de dos fotones in vivo de la microglía en el hipocampo del ratón. J. Vis. Exp. (2022)El video demuestra la configuración y el proceso de obtención de imágenes para la microscopía de dos fotones in vivo de la dinámica microglial en el hipocampo CA1 (Cornu ammonis 1) y la circunvolución dentada, lo que garantiza una alineación óptica óptima y una evaluación de la integridad estructural.

Imágenes in vivo de dos fotones de la dinámica microglial en el hipocampo del ratón

Se describe un método para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en funcional predeterminada micro-dominios del neocórtex. En primer lugar, la imagen de la señal óptica intrínseca se utiliza para obtener un mapa funcional. Luego de dos fotones microscopía se utiliza para etiquetar y neuronas imagen dentro de un dominio de micro del mapa.

Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

La experiencia-dependientes cambios moleculares en las neuronas son esenciales para la capacidad del cerebro para adaptarse en respuesta a problemas de comportamiento.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

Las imágenes de lapso de tiempo en el animal vivo proporcionan información valiosa sobre la reorganización estructural en el cerebro intacto. Aquí, presentamos una preparación de cráneo adelgazado que permite la obtención de imágenes transcraneales de estructuras sinápticas marcadas con fluorescencia en la corteza del ratón vivo mediante microscopía de dos fotones.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

Se describe un procedimiento experimental para medir la actividad neuronal a través de dos ventanas ópticas arriba bilateral corticies somatosensorial primaria (S1) en Thy1-GCaMP6s de ratones transgénicos usando fotones 2 (2P) microscopia en vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

Este método describe una preparación crónica que permite el acceso óptico al hipocampo de ratones vivos. Esta preparación se puede utilizar para realizar imágenes ópticas longitudinales de plasticidad estructural neuronal y plasticidad celular evocada por la actividad durante un período de varias semanas.

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La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

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Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

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Aprende a realizar craniotomía para imagen crónica de neuronas en la corteza retrosplenial de ratón mediante microscopía de dos fotones in vivo. Este método permite monitorear la plasticidad estructural dependiente de la experiencia a largo plazo.

Simultánea de dos fotones En Vivo Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial (Video) | JoVE Journal

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