Simultánea de dos fotones

Todos los procedimientos experimentales descritos a continuación fueron aprobados por el Comité Ético Local del Instituto Nencki de Biología Experimental, Academia Polaca de Ciencias. Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite la obtención de imágenes crónicas de neuronas en la corteza retrosplenial de ratones mediante microscopía de dos fotones in vivo en la línea transgénica thi one-G de feet. Este enfoque se combina con la inyección de virus asociado a adenovirus que expresa mCherry, AAV, en el hipocampo dorsal.

Combinadas, estas técnicas permiten el monitoreo a largo plazo de la dependencia experimentada y la plasticidad estructural en la corteza retrosplenial. En este artículo, proponemos la implantación de una ventana craneal sobre la corteza retrosplenial como una región de interés viable para la microscopía in vivo de dos fotones. Con el fin de visualizar los cambios morfológicos en las estructuras neuronales, utilizamos ratones de la línea B uno-G de T con expresión del proteína fluorescente GFP en aproximadamente el 10 por ciento de las neuronas en el cerebro.

Otra innovación que proponemos es la inyección de un AAV, expresión de una proteína fluorescente mCherry bajo un promotor específico de neuronas en estructuras más profundas del cerebro, como el hipocampo, con el fin de visualizar las proyecciones de la estructura hacia la corteza retrosplenial. Esterilice todas las herramientas, los recipientes de vidrio para líquidos y los bastoncillos de algodón en el autoclave. Usted guantes desechables.

Limpie la mesa quirúrgica, el marco estereotáctico y toda el área circundante con etanol al 70%. Utilice una almohadilla quirúrgica estéril para crear un espacio estéril para todo el equipo esterilizado. Corte la espuma de gel en trozos pequeños y sumérjalos en solución salina estéril.

Coloque el animal en la cámara de inducción y ajuste el nivel de isoflurano al 5% y el flujo de oxígeno a dos litros por minuto. Este procedimiento debe durar aproximadamente tres minutos. Saque el animal de la cámara de inducción.

Utilice pellizcos en la cola o en los dedos del pie para asegurarse de que el animal esté completamente sedado. Con tijeras precisas, afeite el pelo de la parte posterior de la cabeza, entre las orejas y hasta los ojos. Coloque al animal en el marco estereotáctico y estabilice la cabeza con barras para las orejas.

Ajuste los niveles de anestesia a 1,5-2 % de isoflurano y 0,3 litros por minuto de oxígeno. Aplique la pomada oftálmica. Inyecte al animal por vía subcutánea tolfedina, cuatro miligramos por kilogramo; butomidoro, dos miligramos por kilogramo; y Baytril, cinco miligramos por kilogramo para prevenir inflamación, dolor e infección, respectivamente.

Administre al animal dexametasona por vía intramuscular, cero punto dos miligramos por kilogramo, para prevenir la hinchazón cerebral. Limpie la piel utilizando hisopos estériles con betadina seguidos de etanol al 70%. Cambie los guantes y rocíe con etanol al 70%.

Levante la piel con pinzas y, utilizando tijeras microquirúrgicas, haga un corte horizontal en la piel a lo largo de la base de la cabeza y luego en diagonal hasta el punto frontal entre los ojos. Retire el colgajo de piel. Aplique pomada de lidocaína con un hisopo estéril sobre el periostio para prevenir sangrado excesivo y dolor.

Utilice hisopos de algodón estériles o un escalpelo para eliminar el periostio. Seque el cráneo con hisopos estériles. Con una aguja estéril, aplique pegamento denso de cianoacrilato sobre los bordes de la piel para inmovilizarlos y evitar cualquier contacto adicional con el cemento dental.

Espere a que el pegamento se seque. Coloque un cubreobjetos estéril de tres milímetros sobre el cráneo anteriormente a la sutura lambdoidea. Centre el cubreobjetos en las coordenadas retrosplénicas, anterior-posterior bregma menos dos punto ocho, medial-lateral bregma cero.

Marque los bordes del cubreobjetos rayando la superficie del cráneo con una aguja estéril. Coloque nuevamente el cubreobjetos en el recipiente estéril con etanol al 70%. Utilice un taladro dental de alta velocidad con una fresa de pequeño diámetro para trazar un círculo de tres milímetros de diámetro.

Limpie el sitio de perforación del polvo óseo con torundas estériles humedecidas en solución salina. Utilice espuma de gel y torundas para detener cualquier sangrado y limpiar el hueso. Entre cada perforación, verifique el grosor del hueso con pinzas finas tocando suavemente el círculo óseo y comprobando su movilidad.

Teniendo en cuenta que el hueso es más grueso en el área de las suturas. Detenga la perforación cuando el círculo óseo esté móvil y solo quede una capa delgada y uniforme de hueso en la circunferencia. Limpie el campo operatorio de todo el polvo óseo residual con torundas impregnadas en solución salina.

Coloque la solución salina estéril sobre el área de perforación, cubriendo el círculo perforado. Levante cuidadosamente el círculo óseo con una pinza fina y luego extráigalo suavemente pero firmemente elevándolo hacia arriba. Tenga cuidado de no torcer el círculo óseo al levantarlo para evitar posibles daños en la duramadre.

Aplique suavemente la espuma de gel empapada en solución salina estéril sobre la dura para ayudar a detener la hemorragia. Espere hasta que la hemorragia haya cesado por completo. Retire cuidadosamente la espuma de gel para no alterar el proceso de coagulación.

Tenga en cuenta que el área de sutura está altamente vascularizada, por lo que el sangrado en este punto podría ser abundante. Es fundamental esperar un tiempo suficiente para que el sangrado se detenga. Conecte la bomba de infusión a la torre estereotáxica y conecte el controlador.

Introduzca la aguja de calibre 35 en la jeringa de llenado. Lave la jeringa 10 veces con etanol para esterilizarla y 10 veces con solución salina estéril para eliminar los rastros de etanol. Elimine las burbujas de aire de la jeringa.

Introduzca la jeringa en la bomba. Prepare una dosis individual de la preparación de AV y manténgala en hielo. Llene la jeringa con la solución de virus.

Centre la aguja en el bregma y luego insértela suavemente en el hipocampo utilizando las siguientes coordenadas: anterior, posterior menos dos, medial lateral más menos uno, dorsal ventral menos uno. Estas coordenadas se ubicarán cerca del borde del dominio craneal. Espere cinco minutos para que el tejido se estabilice.

Inyecte cero punto siete microlitros de solución AV a una velocidad de 50 nanolitros por minuto. Espere 10 minutos para que el virus se absorba completamente. Retire suavemente la aguja.

Presione con espuma de gel si se produce sangrado. Repita el procedimiento en el lado contralateral. Coloque el cubreobjetos estéril y seco sobre la duramadre dentro del marco circular perforado.

Sostenga el cubreobjetos con la pinza para aplanar suavemente la duramadre y acercar los bordes del cubreobjetos a la superficie del cráneo. Utilizando una aguja estéril, aplique el pegamento denso de cianoacrilato sobre los bordes del cubreobjetos para fijarlos al cráneo. Espere a que el pegamento se seque.

Coloque una barra de fijación, una tuerca Anton o un diseño personalizado en la parte frontal del cráneo. Tenga en cuenta que la barra de fijación debe colocarse en una posición que permita la colocación horizontal de la ventana craneal durante la sesión de imagen. Aplique el pegamento sobre los bordes de la barra.

Espere a que el pegamento se seque. Tenga en cuenta que la barra de fijación debe colocarse lo más alejada posible de la ventana. Si se coloca demasiado cerca de la ventana, la barra y el tornillo que la conecta con el soporte hecho a medida podrían convertirse en un obstáculo para el objetivo durante el proceso de obtención de imágenes.

Prepare el acrílico dental y aplíquelo sobre la superficie del cráneo alrededor del vidrio. Es útil formar una forma similar a un cráter alrededor de la ventana. Esto creará una cavidad para el agua que se aplicará posteriormente durante la imagenología con el objetivo de inmersión en agua.

Cree un casquete con acrílico dental, cubriendo el resto de los bordes de la piel del área operatoria y la barra de fijación, reforzando así el cráter alrededor de la ventana craneal. Espere a que el cemento dental se endurezca. Retire al animal del marco estereotáxico y colóquelo en la cámara de recuperación.

Esperar a que el animal se recupere de la cirugía mientras se observan las funciones fisiológicas. Aplicar anestesia posoperatoria cyroproferrin, 10 miligramos por kilogramo, y tratamiento antibiótico baytril, cinco miligramos por kilogramo, durante 48 horas. Encender el láser de ti sapphire, encender el microscopio.

El sistema utilizado en este experimento está equipado con un láser de dos fotones, un sistema OPO y un PMT de arseniuro de galio doble falsificado. Coloque el animal en la cámara de inducción e induzca la anestesia. Retire el animal de la cámara de inducción y colóquelo en la máscara de anestesia gaseosa bajo el microscopio.

Disminuya el flujo de oxígeno a cero punto tres litros por minuto y la concentración de isoflurano a 1,52 %. Fije el animal al soporte personalizado del microscopio con un tornillo MT o otro sistema personalizado. Nivele la ventana craneal. Tenga en cuenta que es posible utilizar el sistema de fijación de cabeza del fabricante del microscopio, aunque el soporte personalizado específico ofrece mejores resultados, una mayor estabilidad de la cabeza y una posición constante en múltiples sesiones durante un experimento crónico.

Utilizando la configuración del microscopio de campo amplio y un objetivo de baja magnificación, centre la vista en uno de los lados de la corteza retrosplenial y enfoque sobre la superficie del cubreobjetos. Aplique una gota de agua en el pozo acrílico con forma de cráter. Cambie a un objetivo de inmersión en agua de larga distancia.

Mueva el objetivo hacia la ventana craneal hasta que el menisco de agua conecte la muestra y el objetivo. Cambie a la configuración de dos fotones e inicie el escaneo de la muestra de arriba hacia abajo utilizando el zoom más bajo. El cruce de la duramadre será visible como un resplandor de señal no específica alta.

Ajuste la configuración de adquisición del microscopio en ambos canales, GFP y mCherry, según la intensidad de la señal procedente de las células fluorescentes para cubrir todo el rango dinámico. Tras localizar una neurona adecuada con el árbol dendrítico separado de otras células, realice un escaneo inicial utilizando únicamente filtros GFP con el zoom más bajo y una distancia Z de cinco micrones. Obtenga una proyección máxima del conjunto de escaneo e imprímala para realizar anotaciones utilizando colores invertidos.

Configure el zoom a un valor que permita obtener imágenes de los detalles morfológicos deseados. Imagen del árbol dendrítico completo en los canales GFP y mCherry utilizando la proyección máxima como guía. Mediante este protocolo, será posible monitorear repetidamente tanto las estructuras pre como post-sinápticas en la corteza retrosplénica.

Este enfoque podría utilizarse en un experimento crónico en el que se esperan correlaciones entre manipulaciones conductuales y cambios en la morfología de las dendritas, espinas sinápticas o neuronas pre-sinápticas. Las sesiones de imagen pueden realizarse con cualquier frecuencia, pero se prefiere un intervalo de 24 horas para permitir una recuperación adecuada del animal y minimizar el efecto de la anestesia. Si se aplica correctamente, esta técnica permite realizar múltiples sesiones de imagen durante varios meses.